昆虫杆状病毒表达载体、构建方法及其应用

昆虫杆状病毒表达载体、构建方法及其应用
【专利摘要】本发明提供了昆虫杆状病毒表达载体、构建方法及其应用，所述昆虫杆状病毒表达载体包括含人抗体轻链Kappa保守区序列的昆虫杆状病毒表达载体I以及含人抗体重链IgG1保守区的昆虫杆状病毒表达载体II，所述表达载体I的序列如序列表SEQ ID 1所示，所述表达载体II的序列如序列表SEQ ID 2所示；还包括含α?2，3?唾液酸糖基转移酶ST3的昆虫杆状病毒表达载体III，所述表达载体III的序列如序列表SEQ ID 3所示。所述昆虫杆状病毒表达载体可高效表达含重链和轻链的人源化抗体。
【专利说明】
昆虫杆状病毒表达载体、构建方法及其应用
技术领域
[0001]本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及昆虫杆状病毒表达载体、构建方法及其应用。
【背景技术】
[0002]抗体分子具备四聚体糖蛋白的复杂分子结构，其胞外表达遵循着〃分泌蛋白〃的一般规律:全抗体分子的轻、重链各自翻译后，经折叠、组装，糖基化修饰后才具生物活性。通过对已上市抗体的临床研究发现，宿主细胞对重组抗体的〃翻译后修饰〃，直接影响到抗体药物的临床疗效和免疫原性，所有IgG分子仅在每个Cy 2区域Asn-297存在一个保守的N-糖基化修饰位点。连接在该位点的糖链有助于维持IgG的四级结构和Fe稳定性，并为IgG与外源凝集素的结合提供糖基化修饰位点。正常人IgG的Fe寡糖主要是核心岩藻糖基化的复杂双天线型，多因末端糖的半乳糖基化和唾液酸化产生异质性。根据末端半乳糖数量，可将Asn-297连接的双天线32聚糖糖链分成三个不同亚型IgG-GO，-Gl，-G2，分别占整个人血清IgG糖链的35 %、35 %和16 % ;其他的14 %为唾液酸化的GI和G2型的糖链。此外，人类I gG中还存在少量有(或无)二等分乙酰葡糖胺的无岩藻糖Fe糖链。
[0003]昆虫产生唾液酸化糖蛋白的N-糖链是昆虫糖生物学和利用昆虫杆状病毒表达系统比较矛盾的一个问题。很多证据表明，在昆虫细胞株中没有唾液酸和唾液酸转运酶的活性，杆状病毒表达系统表达的重组糖蛋白的糖链末端没有唾液酸化。所有在标准昆虫杆状病毒表达系统中，其中以sf21、sf9和BT1-Tn-5Bl-4(High Five)细胞作为宿主，重组N-糖蛋白的糖链是简单的、没有唾液酸化的低甘露糖型，而不是哺乳动物在相同糖基化位置产生的唾液酸化的复合型糖链。
[0004]细胞系3€3胃1'-1(含有6111'1，61^2，6&11'，3了3，3了6等5个哺乳动物细胞糖基转移酶基因)具有能够很好地使重组糖蛋白的糖链唾液酸化的能力。我们知道Sf9细胞系不具有CMP-sialic acid，而这种物质是sialyl transferase酶活性的底物。随后发现Sf SWT-1中表达的重组糖蛋白的糖链唾液酸化，需要将该细胞放在含有外加唾液酸的培养基中培养，就像要添加FBS—样，表明这些昆虫细胞具有补偿型营养途径。不过这个问题很快得到了解决，那就是将编码唾液酸合酶和CMP-唾液酸合成酶的哺乳动物基因插入Sf SWT-1细胞内，得到的SfSWT-3细胞株，就能够在细胞内合成CMP-唾液酸，形成的糖链为双天线、末端单唾液酸化的复合型N-糖链，但该细胞要在含有N-乙酰甘露糖胺唾液酸前体物的培养基中生长。这里要特别强调的是，到目前为止所有由转基因昆虫细胞产生的糖链都在末端的α_1，6支链上没有唾液酸。这是因为尽管在SfSWT-1和SfSWT-3细胞株中引入老鼠ST3GalIV基因，但检测不到唾液酸转运酶活性，说明虽然从mRNA水平上能够检测到该基因的表达，但它不能编码一个具有活性的基因产物，这可能解释了目前为什么由这些细胞株表达的重组糖蛋白的糖链的末端没有两个唾液酸的原因。因此目前的工作重点是向SfSWT-1和SfSWT-3细胞系中转入能表达具有活性的ST3酶基因。

【发明内容】

[0005]针对现有技术中的上述问题，本发明的主要目的在于提供昆虫杆状病毒表达载体、构建方法及其应用，所述昆虫杆状病毒表达载体可高效表达含重链和轻链的人源化抗体。
[0006]为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]昆虫杆状病毒表达载体，包括含人抗体轻链Kappa保守区序列的昆虫杆状病毒表达载体I以及含人抗体重链IgGl保守区的昆虫杆状病毒表达载体II，所述表达载体I的序列如序列表SEQ ID I所示，所述表达载体II的序列如序列表SEQ ID 2所示；
[0008]还包括含α-2，3_唾液酸糖基转移酶ST3的昆虫杆状病毒表达载体III，所述表达载体III的序列如序列表SEQ ID 3所示。
[0009]作为进一步的优选，所述表达载体Ι、ΙΙ、ΙΙΙ为pFAST Bacl载体。
[0010]作为进一步的优选，所述表达载体III的启动子为杆状病毒极早期弱启动子iel。[0011 ]昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤:
[0012]所述载体I的构建方法为:设计引物从pFUSE2ss-CLIg-hk载体上克隆人抗体轻链Kappa保守区片段，并连接到pFAST Bacl载体上；
[0013]所述载体II的构建方法为:设计引物从pFUSEss-CHIg-hGl载体上克隆人抗体重链IgGl保守区片段，并连接到pFAST Bacl载体上；
[0014]所述载体III的构建方法为:将pFASTBacI载体的PH启动子置换成病毒极早期弱启动子iel，以及克隆人α-2，3-唾液酸糖基转移酶ST3基因到含启动子iel的所述pFASTBac I载体上。
[0015]作为进一步的优选，所述载体I的构建方法中，所述人抗体轻链Kappa保守区片段和pFAST BacI载体各自经双酶切后，以3:1的摩尔比例混合后通过连接酶连接。
[0016]作为进一步的优选，所述载体I的构建方法中，克隆的方法包括:以pFUSE2ss-CLIg-hk载体为模板，设计引物扩增pFUSE2ss-CLIg-hk载体的IgKappa轻链保守区。
[0017]作为进一步的优选，所述载体I的构建方法中，所述引物为上游引物LI和下游引物L2，所述上游引物LI的序列如SEQ ID 4所示，所述下游引物L2的序列如SEQ ID 5所示。
[0018]作为进一步的优选，所述载体II的构建方法中，所述人抗体重链IgGl保守区片段和pFAST BacI载体各自经双酶切后，以3:1的摩尔比例混合后通过连接酶连接。
[0019]作为进一步的优选，所述载体11的构建方法中，克隆的方法包括:以pFUSEsS-CHIg-hG I载体为模板，设计引物扩增pFUSEs s-CHI g-hG I载体的I gG I重链保守区。
[0020]作为进一步的优选，所述载体II的构建方法中，所述引物为上游引物Hl和下游引物H2，所述上游引物Hl的序列如SEQ ID 6所示，所述下游引物H2的序列如SEQ ID 7所示。
[0021]作为进一步的优选，所述载体I和载体II的构建方法中采用的扩增反应体系为:94°(:预变性5111丨11，941€458，58°(:1111丨11，721€458，共进行30个循环，72°(:延伸1011^11。
[0022]作为进一步的优选，所述载体III的构建方法中，所述置换包括如下=WpFASTBacl载体质粒为模板，扩增pFAST Bacl载体不含pPH启动子的部分;合成杆状病毒极早期弱启动子iel，将所述启动子iel与扩增后的所述pFAST Bacl载体连接，得到含杆状病毒极早期弱启动子iel的病毒表达载体。
[0023]作为进一步的优选，所述载体III的构建方法中，所述扩增反应体系包括如下:采用？作酶，扩增条件为:941€2111丨11，94°(:158，601€308，721€908，扩增35个循环，721€7111丨11，扩增片断长度为4647bp。
[0024]作为进一步的优选，所述人α-2，3_唾液酸糖基转移酶ST3基因片段和含启动子iel的pFAST BacI载体各自经双酶切后，以2:1的摩尔比例混合后通过连接酶连接。
[0025]作为进一步的优选，所述人α-2，3_唾液酸糖基转移酶ST3基因序列如SEQ ID 8所不O
[0026]作为进一步的优选，所述载体1、载体II和载体III的构建方法中，所述双酶切为BamHI 和 HindII I 双酶切。
[0027]所述昆虫杆状病毒表达载体在制备全长抗体中的应用，所述应用包括如下方法:
[0028]分别克隆分泌鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞轻链可变区基因序列和重链可变区基因序列；
[0029]将所述轻链可变区核酸序列连接到含人抗体轻链Kappa保守区序列的昆虫杆状病毒表达载体I，将所述重链可变区核酸序列连接到含人抗体重链IgGl保守区的昆虫杆状病毒表达载体II;
[0030]分别采用昆虫杆状病毒表达载体I和昆虫杆状病毒表达载体II转染构建重组杆状病毒粒子，得到两种病毒；
[0031]所述两种病毒混合感染昆虫细胞，得到重组人鼠嵌合抗体。
[0032]作为进一步的优选，所述轻链可变区基因序列如SEQ ID 9所示，所述重链可变区基因序列如SEQ ID 10所不。
[0033]作为进一步的优选，克隆时，采用引物L3和L4扩增鼠单抗轻链可变区基因序列，采用引物Η3和Η4扩增鼠单抗重链可变区基因序列，所述引物序列L3、L4、H3、H4分别如SEQ ID
11、12、13、14 所示。
[0034]所述昆虫杆状病毒表达载体在表达人源糖蛋白中的应用，所述应用包括如下方法:将特征蛋白基因构建到表达载体III上，利用表达载体1、II及III分别转染昆虫细胞，得到三种病毒，所述三种病毒混合共同感染昆虫细胞SfSWT-3细胞。
[0035]作为进一步的优选，所述感染方法为把病毒液加到培养好的SfSWT-3细胞里。
[0036]本发明的有益效果是:
[0037](I)经抗体检测实验证明，本发明昆虫杆状病毒表达载体可以高效表达含重链和轻链的人源化抗体。
[0038](2)本发明得到的重组抗体的糖基化修饰方式和人体内的糖基化修饰方式一致。
[0039 ] (3)本发明的抗体制备方法表达量大，成本低，效率高。
[0040](4)本发明制备的抗体干粉可作为血清学检查的诊断原料。
[0041 ] (5)本发明能在Sf SWT-3细胞系中表达具有活性的ST3酶基因。
【附图说明】
[0042]图1为本发明实施例制备的重组全长抗体的Western Blot图。
【具体实施方式】
[0043]本申请通过提供昆虫杆状病毒表达载体、构建方法及其应用，得到的所述表达载体可高效表达含重链和轻链的人源化抗体。
[0044]本申请实施例昆虫杆状病毒表达载体，包括含人抗体轻链Kappa保守区序列的昆虫杆状病毒表达载体I以及含人抗体重链IgGl保守区的昆虫杆状病毒表达载体II，所述表达载体I的序列如序列表SEQ ID I所示，所述表达载体II的序列如序列表SEQ ID 2所示；
[0045]还包括含α-2，3_唾液酸糖基转移酶ST3的昆虫杆状病毒表达载体III，所述表达载体III的序列如序列表SEQ ID 3所示；
[0046]所述表达载体Ι、ΙΙ、ΙΙΙ为pFAST Bacl载体。
[0047]所述载体I的表达元件包括:PH启动子，SV40pA，Tn7L，flori，ampici 11 in，pUC01"；[，1'1171?，661^3111；[(3；[11，1^口口3保守区，多克隆位点等。
[0048]所述载体II的表达元件包括:PH启动子，SV40pA，Tn7L，f1ri，ampicillin，pUCori，Tn7R,Gentamicin，IgGl重链保守区，多克隆位点等。
[0049]所述表达载体III的启动子为杆状病毒极早期弱启动子iel。
[0050]本申请实施例昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤:
[0051 ]所述载体I的构建方法为:设计引物从pFUSE2ss-CLIg-hk载体上克隆人抗体轻链Kappa保守区片段，并连接到pFAST Bacl载体上；
[0052]所述载体II的构建方法为:设计引物从pFUSEss-CHIg-hGl载体上克隆人抗体重链IgGl保守区片段，并连接到pFAST Bacl载体上；
[0053]所述载体III的构建方法为:将pFASTBacI载体的PH启动子置换成病毒极早期弱启动子iel，以及克隆人α-2，3-唾液酸糖基转移酶ST3基因到含启动子iel的所述pFASTBacl载体上。所述人α-2，3-唾液酸糖基转移酶ST3基因序列如SEQ ID 8所示。
[0054]本申请实施例昆虫杆状病毒表达载体在制备全长抗体中的应用，所述应用包括采用如下方法制备抗体:
[0055]分别克隆分泌鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞轻链可变区基因序列和重链可变区基因序列；
[0056]将所述轻链可变区核酸序列连接到含人抗体轻链Kappa保守区序列的昆虫杆状病毒表达载体I，将所述重链可变区核酸序列连接到含人抗体重链IgGl保守区的昆虫杆状病毒表达载体II;
[0057]分别采用昆虫杆状病毒表达载体I和昆虫杆状病毒表达载体II转染构建重组杆状病毒粒子，得到两种病毒；
[0058]所述两种病毒混合感染昆虫细胞，得到重组人鼠嵌合抗体。
[0059]所述轻链可变区基因序列如SEQ ID 9所示，所述重链可变区基因序列如SEQ ID1所示。
[0060]本申请实施例昆虫杆状病毒表达载体在表达人源糖蛋白中的应用，所述应用包括采用如下方法表达糖蛋白:将特征蛋白基因构建到表达载体III上，利用表达载体Ι、Π及III分别转染昆虫细胞，得到三种病毒，所述三种病毒混合共同感染昆虫细胞Sf SWT-3细胞。
[0061]为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案做详细的说明。
[0062]实施例1
[0063]以下以小鼠HER2单克隆抗体为例进行人源化抗体的表达。
[0064]重组抗体轻链可变区融合表达载体I的构建
[0065]以pFUSE2ss-CLIg-hk载体为模板，设计一对引物扩增该载体的IgKappa Light保守区，具体步骤如下:以上游引物LI:CGGGCGCGGATCCGAATTCACCGGTCACCATGG和下游引物L2:TTCTCGACAAGCTTCTCCCTCTAACACTCTCC，以pFUSE2ss-CLIg-hk载体质粒为模板，94°C预变性511^11，941€458，58°(:1111丨11，721€458，共进行30个循环，72°(:延伸10111丨11。？0?产物电泳回收，BamH I和Hind III双酶切得到含多克隆位点的人源化抗体轻链Kappa保守区片段。培养含pFAST Bacl载体在大肠杆菌，提取质粒，同样BamH I和Hind III双酶切，回收酶切片段，以轻链Kappa保守区片段:pFAST Bacl载体比例3:1，混合，加T4DNA连接酶链接，转化大肠杆菌DHlOBac，挑取抗氨苄青霉素的菌株，为构建成功的载体。
[0066]融合蛋白构建和表达(制备抗体时):1.杂交瘤细胞复苏、细胞培养以及cDNA的合成，采用常规方法从分泌抗HER2单抗的杂交瘤细胞株中提取mRNA，并以其为模板经逆转录酶催化(RT-PCR)，在体外反转录成cDNA。用可变区两头的通用混合引物扩增，然后连接到克隆载体PMD18-T，随机挑选一些克隆测序验证正确的抗体基因，得到鼠单抗轻链可变区基因序列，以弓I 物 L3:AGTCC GAATTCGACATCCAGATGACCCAGTC和L4:TGACTGCCATGGACGCTTGATCTCCACCTTGG扩增该基因可变区序列，EcoRI和NcoI双酶切插入上述构建好的表达载体。
[0067]重组抗体重链可变区融合表达载体II的构建
[0068]以pFUSEss-CHIg-hGl载体为模板，设计一对引物扩增该载体的IgGl重链保守区。具体步骤如下:以上游引物Hl: GCGCGGATCCGAATTCGATATCTCGAGTGCTAG和下游引物H2:CTCGACAAGCTTCCAGCTAGGACTCATTTAC，以pFUSE2ss-CLIg-hk载体质粒为模板，94°C预变性5!!^11，941€458，58°(:11^11，721€458，共进行30个循环，72°(:延伸101^11。？0?产物电泳回收，双酶切得到含多克隆位点的人源化抗体IgGl重链保守区片段。培养含pFAST Bacl载体在大肠杆菌，提取质粒，同样BamHI和HindIII双酶切，回收酶切片段，以IgGl重链保守区:pFASTBacI载体比例3:1，混合，加T4DNA连接酶链接，转化大肠杆菌DHlOBac，挑取抗氨苄青霉素的菌株，为构建成功的载体。
[0069]融合蛋白构建和表达(制备抗体时):1.杂交瘤细胞复苏、细胞培养以及cDNA的合成，采用常规方法从分泌抗HER2单抗的杂交瘤细胞株中提取mRNA，并以其为模板经逆转录酶催化(RT-PCR)，在体外反转录成cDNA。用可变区两头的通用混合引物扩增，然后连接到克隆载体PMD18-T，随机挑选一些克隆测序验证正确的抗体基因，得到鼠单抗重链可变区基因序列，以弓I 物 H3:AGTCC GAATTCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC和H4:GCTAAGATATCCACGGTCACCAGGTACC扩增改抗体基因重链可变区序列，EcoRI和EcoRV双酶切插入上述构建好的表达载体。
[0070]含杆状病毒极早期启动子iel和人α-2，3_唾液酸糖基转移酶ST3的载体III的构建
[0071]换启动子:以pFASTBacl载体质粒为模板，以引物扩增该载体不含pPH启动子的部分，用口如酶，扩增条件为:941€2111丨11，94°(:158，601€308，721€908，扩增35个循环，721€71^11，扩增片断长度为4647bp。同时合成杆状病毒极早期启动子iel，和载体平端连接，挑克隆，PCR和测序验证，得到含杆状病毒极早期弱启动子iel的病毒表达载体。
[0072]表达载体III的构建:将人α-2，3_唾液酸糖基转移酶ST3基因克隆到该载体上，人α-2，3-唾液酸糖基转移酶ST3蛋白质序列，根据密码子偏好转化为适合在昆虫细胞中表达的基因序列，合成该序列，合成的时候两端分别带上酶切位点BamH I和Hind III，合成的ST3基因片段和含ieI启动子的载体分别以BamH I和Hind III双酶切，以2:1的比例混合，加T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DHlOBac，挑克隆，PCR验证，得到表达ST3基因的表达载体。提取质粒备用。
[0073 ]上述三种病毒载体1、I1、III的分别转染(表达人源糖蛋白时)
[0074]取sf9细胞，用Grace’s培养液于27°C无CO2细胞培养箱中培养。利用Cellfectin在6孔培养板中将三种重组杆状病毒DNA即重链表达载体，轻链表达载体，ST3表达载体分别转染处于对数生长期即融合率80%以上的sf9细胞。转染方法如下:分别配置A液(LR反应物8μI，无血清无抗生素Grace’s培养基ΙΟΟμΙ)和B液(6μ1 Cellfectin，Grace’ s无血清无抗生素Grace ’ s培养基ΙΟΟμΙ)，并轻柔混勾两液，室温放置35min后，加入800μ1无血清无抗生素Grace，s培养基轻柔混勾；移弃六孔板中培养基，用无血清无抗生素Grace，s培养基润洗，以去除残留血清，加入AB混合物，27°C孵育5小时，移弃培养上清，于各孔中加入2ml含有50单位/ml青霉素和50ug/ml链霉素的Grace，s完全培养基，培养96h后4500rpm离心lOmin，收集培养上清，即获得重组抗体的杆状病毒，这是Pl毒株，分装后，-80°C避光保存备用。
[0075]病毒的扩增:感染当天，准备Sf9和Sf21细胞上清和细胞板，2X106细胞/孔。接触培养细胞室温I小时，I小时后倒差显微镜检查细胞的吸附情况，每孔加入合适数量的Pl毒株，27度潮湿培养箱抚育细胞96小时，感染后72小时，从每个孔收集2ml含有病毒的上清培养基，转到15ml的管子。500Xg离心5分钟弃去细胞和碎片。将上清转到15ml管子。这是P2毒株，4度避光保存。长期保存需要整株在-80度。检测你的P2毒株的滴度，同样方法制备P3病毒株。分别收集重链载体，轻链载体，和ST3表达载体转染后的P3病毒，再混合感染由SfO细胞株改良后的Sf SWT-3细胞，感染方法为把毒液加到培养好的细胞里面。
[0076]检测实验
[0077]抗体的检测和糖基化方式检测检测人源化抗体
[0078]a，分别取I X 16重组杆状病毒感染96h后的SfSWT-3细胞，未感染SfSWT-3细胞为阴性对照和感染PFastBac1-Gus杆状病毒的SfSWT-3细胞作为阳性对照。细胞分别裂解后用等量的2 X凝胶加样缓冲液混匀，各取20μ1上样电泳，并分别电泳3组细胞裂解液，利用B1-Rad蛋白转印系统转印3张PVDF膜，以便各种抗体和蛋白检测重组人源化抗体蛋白的存在。5 %脱脂奶粉室温封闭Ih，用1:5000的抗-人Kappa链-HRP单克隆抗体，I: 200兔抗Kappa链多克隆抗体，以及1:2000鼠抗人Kappa链单克隆抗体分别孵育3张PVDF膜，4 V过夜。PBST洗膜后分别用相应HRP标记的二抗室温孵育PVDF膜，PBST洗膜，DAB显色，结果见附图1。图1中，从左至右，泳道I为全长抗体的加热还原后的电泳，泳道2，3为非加热非还原的电泳，通过分子量对照，可以看出本申请实施例1制备的全长抗体结构是完整的，重链和轻链成功组装。
[0079]b.通过ELISA检测昆虫细胞株。以抗人KAPPA链抗体用包被酶标板，4°C包被过夜，5%牛奶封闭液封闭2h;，分别加入正常转染昆虫细胞上清(-)和人IgG标准品(100ng/ml—+ )和昆虫细胞表达上清，各ΙΟΟμΙ，37°C孵育30min，用ELISA洗涤液洗5次，3min/次;将HRP标记的重组HER2蛋白用ELISA稀释液稀释后，分别加入孔中，37°C孵育30min，用ELISA洗涤液洗5次，3min/次;加入显色液10ul/孔，37°C避光显色1()111；[11，最后加入5(^1/孔21]101凡硫酸终止，用酶标仪上机检测。根据酶标仪检测结果确定抗生素双筛选的昆虫细胞株的抗体表达能力。结果显示抗体有明显结合。
[0080]c.ProteinA亲和纯化抗HER2蛋白的人源化抗体。从昆虫细胞的细胞破碎液中可以分离纯化人源化的人鼠杂交抗体。主要步骤如下收集培养上清，4°C离心，12000rpmX1min，弃沉淀。用0.45μηι滤膜过滤进一步除去细胞杂质，以避免堵塞层析柱；用10倍体积的binding buffer
[0081 ] (20mM PBS，pH7.0)平衡Hitrap Protein A预装柱:上样，完毕后用10倍体积的binding buffer洗去未结合的蛋白，至Bradford检测溶液不显色；用5倍体积的elut1nbuffer (0.1M柠檬酸溶液，pH3.6)洗脱，用Bradford检测溶液检测洗脱过程，收集洗脱峰，并用IM Tris-HCI (pH9.0)调整PH值至7.0 ；从收集产物中取样进行SDS-PAGE检测，其余纯化产物经PBS液4 0C透析过夜后，分装，_80°C保存。
[0082]d.用木瓜蛋白酶酶解收集到的IgG，通过HPLC纯化，采用MALD1-TOF技术分析了 IgG的两种糖苷类型及其特异性N-糖基化位点。并用质谱检测了糖链结构:经酶切并干燥的样品用A相溶液(5%ACN，0.1%甲酸)充分溶解，高速离心后取上部溶液加入进样瓶，进行在线液质联用分析。液相色谱为反相高效液相色谱并直接与质谱的离子源接口连接。流动相相溶液95 % ACN，0.1 %甲酸。将进样瓶置于自动进样器样品以25μ!7分钟的流速进样，进样后，以500nL/min的流速梯度分离。质谱分析在nanoES1-LTQ-Orbitrap上进行。采用正离子模式扫描。一级Orbitrap分析，离子采集范围m/z400-2000，分辨率为m/z400处60000以DDA模式取强度前十位的离子进行二级分析。二级LTQ分析，全扫描选定的离子进入LTQ进行CID碎裂，并扫描获得二级碎裂谱图。
[0083]分析显示在重链的FC段的CH2区域内有一个保守的N-连接糖基化位点Asn297。该位点的糖基化结构为两个N-连接的二分支双触角复合型寡糖，含有高甘露糖型(Hex4-6HexNAc2)，杂合型(NeuAco-1Fucq-1Hex4-6HexNAc2-4)和复杂型(Fuco-1Hex3-4HexNAc3-6糖链，其末端为双唾液酸。质谱检测糖基化过程委托武汉金开瑞生物工程有限公司完成。证明ST3基因在感染过程中有表达。
[0084]上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点:
[0085](I)经抗体检测实验证明，本发明昆虫杆状病毒表达载体可以高效表达含重链和轻链的人源化抗体。
[0086](2)本发明得到的重组抗体的糖基化修饰方式和人体内的糖基化修饰方式一致。
[0087](3)本发明的抗体制备方法表达量大，成本低，效率高。
[0088](4)本发明制备的抗体干粉可作为血清学检查的诊断原料。
[0089](5)本发明能在Sf SWT-3细胞系中表达具有活性的ST3酶基因。
[0090]尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
【主权项】
1.昆虫杆状病毒表达载体，其特征在于:包括含人抗体轻链Kappa保守区序列的昆虫杆状病毒表达载体I以及含人抗体重链IgGl保守区的昆虫杆状病毒表达载体II，所述表达载体I的序列如序列表SEQ ID I所示，所述表达载体II的序列如序列表SEQ ID 2所示； 还包括含α-2，3-唾液酸糖基转移酶ST3的昆虫杆状病毒表达载体II I，所述表达载体III的序列如序列表SEQ ID 3所不。2.根据权利要求1所述的昆虫杆状病毒表达载体，其特征在于:所述表达载体1、I1、IIISpFAST Bac I 载体。3.根据权利要求1或2所述的昆虫杆状病毒表达载体，其特征在于:所述表达载体III的启动子为杆状病毒极早期弱启动子iel。4.如权利要求1-3任一项所述的昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于:所述方法包括: 所述载体I的构建方法为:设计引物从pFUSE2ss-CLIg-hk载体上克隆人抗体轻链Kappa保守区片段，并连接到pFAST Bacl载体上； 所述载体II的构建方法为:设计引物从pFUSEss-CHIg-hGl载体上克隆人抗体重链IgGl保守区片段，并连接到pFAST Bacl载体上； 所述载体III的构建方法为:将pFAST Bacl载体的PH启动子置换成病毒极早期弱启动子iel，以及克隆人α-2，3_唾液酸糖基转移酶ST3基因到含启动子iel的所述pFAST Bacl载体上。5.根据权利要求4所述的昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于:所述载体I的构建方法中，所述人抗体轻链Kappa保守区片段和pFAST Bacl载体各自经双酶切后，以3:1的摩尔比例混合后通过连接酶连接;所述载体II的构建方法中，所述人抗体重链IgGl保守区片段和pFAST Bacl载体各自经双酶切后，以3:1的摩尔比例混合后通过连接酶连接。6.根据权利要求4所述的昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于:所述载体I的构建方法中，所述引物为上游引物LI和下游引物L2，所述上游引物LI的序列如SEQ ID 4所示，所述下游引物L2的序列如SEQ ID 5所示;所述载体II的构建方法中，所述引物为上游引物Hl和下游引物H2，所述上游引物Hl的序列如SEQ ID 6所示，所述下游引物H2的序列如SEQ ID 7所示。7.根据权利要求4所述的昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于:所述载体III的构建方法中，所述置换包括如下:以pFAST Bacl载体质粒为模板，扩增pFAST Bacl载体不含pPH启动子的部分;合成杆状病毒极早期弱启动子iel，将所述启动子iel与扩增后的所述pFAST Bacl载体连接，得到含杆状病毒极早期弱启动子iel的病毒表达载体。8.根据权利要求4所述的昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于:所述人α-2，3-唾液酸糖基转移酶ST3基因片段和含启动子ie I的pFAST Bac I载体各自经双酶切后，以2:1的摩尔比例混合后通过连接酶连接。9.根据权利要求5或8所述的昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于:所述载体1、载体II和载体III的构建方法中，所述双酶切为BamHI和HindIII双酶切。10.如权利要求1-3任一项所述的昆虫杆状病毒表达载体在制备全长抗体中的应用，其特征在于:所述应用方法包括: 分别克隆分泌鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞轻链可变区基因序列和重链可变区基因序 列； 将所述轻链可变区核酸序列连接到含人抗体轻链Kappa保守区序列的昆虫杆状病毒表达载体I，将所述重链可变区核酸序列连接到含人抗体重链IgGl保守区的昆虫杆状病毒表达载体II; 分别米用昆虫杆状病毒表达载体I和昆虫杆状病毒表达载体II转染构建重组杆状病毒粒子，得到两种病毒； 所述两种病毒混合感染昆虫细胞，得到重组人鼠嵌合抗体。11.根据权利要求10所述的昆虫杆状病毒表达载体在制备全长抗体中的应用，其特征在于:所述轻链可变区基因序列如SEQ ID 9所示，所述重链可变区基因序列如SEQ ID 10所不O12.如权利要求1-3任一项所述的昆虫杆状病毒表达载体在表达人源糖蛋白中的应用，其特征在于:所述应用方法包括:将特征蛋白基因构建到表达载体III上，利用表达载体1、II及III分别转染昆虫细胞，得到三种病毒，所述三种病毒混合共同感染昆虫细胞SfSWT-3细胞。
【文档编号】C12N15/66GK105925610SQ201610334911
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】沈鹤霄, 华权高, 马峰, 徐春雷
【申请人】武汉金开瑞生物工程有限公司