一种快速抑制龙眼胚性愈伤组织中目标基因表达的方法
【专利摘要】本发明提供了一种快速抑制龙眼胚性愈伤组织细胞中目标基因表达的方法。本发明根据目标mRNA全长序列设计合成数个靶点寡核苷酸siRNA序列，利用悬浮细胞培养体系，通过细胞转染剂Lipofectamine 2000 reagent介导法导入龙眼胚性愈伤组织细胞中，从而实现特异性抑制目标mRNA表达。该方法具有操作简单、抑制效果显著、无需载体构等优点，避免了现有方法由于依赖农杆菌介导的转基因技术而实验周期长，费时费力的缺点，本发明提供了一种快速高效的新技术手段，为龙眼偏性愈伤组织中目标基因的功能研究奠定了重要基础。
【专利说明】
一种快速抑制龙眼胚性愈伤组织中目标基因表达的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种快速抑制龙眼胚性愈伤组织细胞中目标基因表达的方法。
【背景技术】
[0002]胚胎发育的好坏是植物能否正常生长的关键，尤其在果树等经济作物生产过程中，胚胎发育能够影响果实的产量和品质。然而，胚胎发育早期研究存在取样困难，材料一致性差，发育同步化水平低等不利因素，对其研究往往存在较大难度。而植物体细胞胚胎发生(体胚发生)通过人为同步化调控发育进程，是研究植物早期胚胎发生理想的替代系统。而植物的生长发育、生物学性状以及遗传特征等从根本上主要通过基因的转录翻译实现调控，因此对植物体胚发生过程中基因进行研究对于揭示目标基因的调控功能，甚至进行植物遗传改良均有重要意义。
[0003]目前，植物基因表达调控研究主要通过已知基因序列构建表达载体进行遗传转化、瞬时表达或亚细胞定位等。在拟南芥、水稻和小麦等植物中，已经有关于体胚发生过程中基因功能验证的相关报道，而在其他多种植物中，由于其胚性愈伤组织的特殊性，其基因遗传转化存在诸多难度，例如，龙眼属于顽拗型植物，且其胚性胚性愈伤组织为内起源性，采用传统遗传转化手段无法实现，因此主要通过转化模式生物进行研究，而由于物种本身的差异性，这种功能分析存在较多局限性。鉴于此，寻找新的方法解决这一难题成为后续开展研究的关键。
[0004]近年来，采用反义脱氧寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotides，0DNs)进行目标基因抑制表达从而实现基因功能研究已在部分植物中进行报道，例如大麦叶片、烟草花粉管以及水稻细胞等(Sun et al, 2005 ； Yang et al, 2006 ； Sun et al, 2007 ；Liao etal，2013;Dinc et al，2011)。在这些研究基础上，我们提出通过细胞转染剂介导ODNs导入龙眼胚性愈伤组织中进行目标mRNA抑制表达，从而实现龙眼体胚发生过程中相关基因的调控功能验证。
【发明内容】
[0005]本发明针对目前龙眼等植物胚性愈伤组织目标基因功能研究的技术空白，提供了一种快速高效抑制龙眼胚性愈伤组织细胞中目标基因表达的方法。
[0006]—种快速抑制龙眼胚性愈伤组织中目标基因表达的方法，通过以下步骤实现:增殖并筛选生长状态良好、细胞活力旺盛的龙眼胚性愈伤组织悬浮细胞系，随后通过GenBank数据库搜索并下载相应物种目标基因全长序列，设计并合成靶点SiRNA寡核苷酸，采用细胞转染剂介导寡核苷酸转入龙眼胚性愈伤组织细胞中，24 h处理后通过定量检测胚性愈伤组织中目标基因的表达水平。
[0007]所述的龙眼胚性愈伤组织为细胞悬浮培养获得的质地松散、生长状态良好且细胞活力旺盛的龙眼胚性愈伤组织细胞系。
[0008]根据目标基因全长序列设计并合成数个靶点siRNA寡核苷酸，通过24h处理采用基因定量表达方法筛选靶点s iRNA。
[0009]采用小型胚性愈伤组织细胞培养容器，在添加靶点siRNA的基础上加入胚性愈伤组织细胞液体培养基(MS+2，4-D 1.0 mg/L)至终体积500yL，25 °C、115rpm/min条件下处理时间为24h。
[0010]该方法按以下步骤实施:
一、根据目标基因全长cDNA序列设计并合成数个靶点siRNA寡核苷酸；
二、采用液体悬浮培养方式增殖和筛选生长状态良好、细胞活力旺盛的龙眼胚性愈伤组织;三、在小型细胞培养容器中加入33yL细胞转染剂、1.ΟμΜ靶点siRNA寡核苷酸和0.15 g龙眼胚性愈伤组织细胞；
四、再往小型细胞培养容器中加入胚性愈伤组织细胞液体培养基MS+2，4-D 1.0 mg/L至终体积500yL，，25°C、115rpm/min条件下处理时间为24h，通过定量表达检测筛选抑制效果最佳处理体系。
[0011]本发明经过多次试验重复发现，采用本方法可以在不影响龙眼胚性愈伤组织生长的情况下高效进行目标基因抑制表达，实现龙眼胚性愈伤组织及体胚发生过程中目标基因功能研究。
[0012]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:
1.本发明操作简便，作用效果显著，且试验周期短，避免了传统方法试验繁琐、费时费力的缺点、省去了载体构建等步骤。
[0013]2.本发明采用细胞脂质体型转染试剂Lipofectamin2000介导目标基因革巴点siRNA寡核苷酸导入龙眼胚性愈伤组织细胞，而不受品系或物种种类局限，应用范围广，为不同物种胚性愈伤组织或体胚发生过程中目标基因功能研究提供方法。
[0014]3.本发明试验效率高，处理24h后目标基因表达量降为原来的一半。
【附图说明】
[0015]图1是以仍Γυ为例，33yL转染剂介导下，分别添加Ι.ΟμΜ革巴点siRNA609和siRNA751和SiRNAlOOO处理24h后，龙眼胚性胚性愈伤组织中仍TTTW抑制表达情况。所用胚性愈伤组织为‘红核子’龙眼幼胚中诱导获得。
[0016]图2是33yL转染剂介导下，不同浓度siRNA751处理24h后，龙眼胚性胚性愈伤组织中仞77仍抑制表达情况。
【具体实施方式】
[0017]一下结合具体实施例和附图进一步对本发明进行详细说明，但具体实施例并不在任何意义上构成对本发明保护范围的限制。
[0018]具体实施步骤如下:
I)龙眼仞77?靶点SiRNA寡核苷酸设计及合成
从GenBank数据库中查找并获取龙眼仍77?全长cDNA，验证无误后送上海吉玛制药技术有限公司合成3个相应靶点siRNA寡核苷酸，并采用高效液相色谱进行纯化。靶点s iRNA序列分别为siRNA609: CCAAGUCCUUUGUCAAUUUTT ;siRNA751: CCAUUGGAUUAGCUGCUUUTT和siRNAlOOO:GCUAAAGGCUACCCUCCUUTT。
[0019]2)龙眼胚性愈伤组织增殖培养和筛选
将龙眼胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中培养1-2代，筛选质地松散，色泽鲜艳且生长状态良好的悬浮培养细胞系。
[0020]3)龙眼仞77仍靶点siRNA筛选
挑选生长良好的龙眼胚性愈伤组织，置于经高压灭菌的滤纸上去除多余的液体培养基。随后取2个经高压灭菌的1.5mL离心管，分别加入细胞转染剂(Lipofectamine 2000reagent，购自Invitrogen)33yL和胚性愈伤组织液体培养基92yL，混勾后形成混合液，室温下静置5min。取25yL不同靶点siRNA寡核苷酸siRNA609、siRNA751和siRNAlOOO分别加入3个经高压灭菌的1mL三角瓶中，再分别加入10yL胚性愈伤组织液体培养基，混匀后将上述混合液加入到该三角瓶中，进一步重复混匀静置20min。随后加入0.15g龙眼胚性愈伤组织，并再次加入胚性愈伤组织液体培养基至500yL ο相同方法设置ck对照组。25 °C，115rpm/min，黑暗条件下处理24h。
[0021 ] 4)龙眼仞77仍靶点siRNA浓度筛选
根据上述方法筛选获得的抑制效果最佳的siRNA，设置不同浓度梯度进行最优添加浓度优化，浓度梯度分别为1.ΟμΜ、2.5μΜ和5.ΟμΜ采用步骤3)中方法进行处理。
[0022]5)龙眼胚性愈伤组织总RNA提取
(I)试验所需要的10yL、200yL和ImL枪头以及1.5毫升离心管均为无RNA酶耗材，且使用前均采用高压锅进行121°C、1lKPa处理20min;提RNA所用研钵采用工业酒精灼烧，室温下冷却备用。
[0023](2)超低温冰箱中快速取出处理后的胚性愈伤组织，于研钵中采用液氮研磨成匀浆，转移至1.5mL专用离心管中，加ImL Tripure细胞裂解液，颠倒混匀后静置5min。
[0024](3)加200yL氯仿，剧烈震荡15s后静置1min;台式高速冷冻离心机4°C，12000rpm/min离心15min，吸取上清液转移到新离心管中。
[0025](4)加入500yL异丙醇，颠倒混匀后静置1min;台式高速冷冻离心机4°C，12000rpm/min离心15min，随后去除上清液。
[0026](5)加入75%乙醇800yL，台式高速冷冻离心机4°C，8000rpm/min离心2min，去除上清液。
[0027](6)风干沉淀，加入无RNA酶双蒸水50yL溶解沉淀。
[0028](7)采用1.5%琼脂糖进行凝胶电泳检测胚性愈伤组织RNA的纯度，并通过超微量紫外光分光光度计测定RNA的浓度。
[0029]6) cDNA逆转录
采用TaKaRa DRR037A PrimerscriptTM RT Reagent Kit进行仞77?定量cDNA逆转录，具体操作步骤如下:
总RNA 500ng；
5X PrimeScript ? Buffer 2 uL；
PrimerScript Rt Enzyme Mix 0.5 uL；
Oligo dT Primer(50uM) 0.5 uL；
Random 6 mers(10uM) 0.5uL； RNase-Free ddH20补足至终体积10 yL。随后低速离心混匀，置于37°C水浴锅中温浴15m i η后迅速注意到8 5 °C水浴锅中水浴5 s。
[0030]例77仍表达水平qPCR检测
根据DlTIRl全长cDNA序列qPCR引物，送北京六合华大基因科技股份有限公司合成。随后采用LightCycler480和SYBR ? Prumix EX TaqTMII试剂盒进行qPCR分析，内参基因为DlFSD、DlEFlamDlEif4a，反应体系和反应程序如下:qPCR反应体系:
SYBR 10yL；
Forward Primer (引物序列:TGAGTAGGCAGAGAGTGTTCGT)0.8yL ；
Reverse PrimerC 引物序列:GTGGGACCAAGTTGAAATCAG) 0.8yL；
模板IyL;
RNase-Free ddifeO 8.4 yL。
[0031]PCR反应程序:
95 °C, 30s；
95°C，5s，TM，15s，72°C，1s，重复该步骤40个循环；
95°C，5s，60°C，60s，97°C;
50。。，30s ο
[0032]每个样品进行3次重复，并采用excel进行相对表达量分析。
[0033]采用上述步骤进行龙眼胚性胚性愈伤组织中例TTTW抑制表达试验，处理24h后，筛选获得抑制效果最佳的为靶点siRNA751，表达量降为对照组的3/5(图l);siRNA751浓度优化处理后，/WTT仍表达量不到原来1/2(图2);该方法过抑制效果明显。
[0034]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种快速抑制龙眼胚性愈伤组织中目标基因表达的方法，其特征在于:所述方法为:增殖并筛选生长状态良好、细胞活力旺盛的龙眼胚性愈伤组织悬浮细胞系，随后通过GenBank数据库搜索并下载相应物种目标基因全长序列，设计并合成靶点SiRNA寡核苷酸，采用细胞转染剂介导寡核苷酸转入龙眼胚性愈伤组织细胞中，24 h处理后通过定量检测胚性愈伤组织中目标基因的表达水平。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的靶点SiRNA寡核苷酸序列为siRNA609:CCAAGUCCUUUGUCAAUUUTT;SsiRNA751:CCAUUGGAUUAGCUGCUUUTT;SsiRNAlOOO:GCUAAAGGCUACCCUCCUUTT。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的龙眼胚性愈伤组织为细胞悬浮培养获得的质地松散、生长状态良好且细胞活力旺盛的龙眼胚性愈伤组织细胞系。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:采用小型胚性愈伤组织细胞培养容器，加入33yL细胞转染剂、1.ΟμΜ勒点siRNA寡核苷酸和0.15 g龙眼胚性愈伤组织细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:在添加靶点SiRNA的基础上加入胚性愈伤组织细胞液体培养基至终体积500yL，并于25 °C、115rpm/min条件下处理时间为24h。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述的液体培养基为MS+2，4-D1.0 mg/L。
【文档编号】C12N15/87GK105925614SQ201610342710
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】林玉玲, 赖瑞联, 赖钟雄, 程春振, 刘生财, 陈裕坤, 张梓浩
【申请人】福建农林大学