一种重组人角质细胞生长因子-2工程菌的发酵方法及发酵培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组人角质细胞生长因子?2工程菌的发酵方法，其包括，根据接种重组工程菌后的基础发酵培养液的OD600值，在发酵过程中依次添加包括葡萄糖和维生素液的第一补料，包括有葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物和微量金属元素液的第二补料以及包括有葡萄糖、胰蛋白胨和酵母提取物的第三补料，以满足重组工程菌不同阶段的营养需求，提高其表达人角质细胞生长因子?2的产量。此外，本发明还公开了一种可用于上述重组工程菌进行发酵培养的发酵培养基。CGMCC No.1239020160425
【专利说明】
-种重组人角质细胞生长因子-2工程菌的发酵方法及发酵培 养基
技术领域
[0001] 本发明设及工程菌发酵技术领域，具体而言，设及一种重组人角质细胞生长因子- 2工程菌的发酵方法及发酵培养基。
【背景技术】
[0002] 目前，现有的用于生产出人角质细胞生长因子-2化Uman keratino巧te growth factor-2，KGF-2)的大肠杆菌发酵方法主要是W包涵体形式进行生产，该方法虽然能够形 成高产，但是在包涵体复性和后续纯化方面会形成复杂繁琐的工艺流程，限制了目标蛋白 的规模化生产。目前也有可溶性表达系统用于生产出可溶性的KGF-2,虽然，避开了包涵体 的问题。但是，目标产物KGF-2的产量很低，不足W进行规模化生产。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种重组人角质细胞生长因子-2工程菌的发酵方法，该方 法能够提高重组工程菌表达出更高产量的人角质细胞生长因子-2化GF-2)。
[0004] 本发明的另一目的在于提供一种发酵培养基，重组工程菌在该发酵培养基中进行 发酵培养，能够表达出更高产量的人角质细胞生长因子-2。
[0005] 本发明解决其技术问题是采用W下技术方案来实现的。
[0006] -种重组人角质细胞生长因子-2工程菌的发酵方法，首先，将能够表达出人角质 细胞生长因子-2的重组工程菌接种至基础发酵培养液中，并加入第一补料，于发酵条件下， 进行发酵培养，所述第一补料包括葡萄糖和维生素液;然后，根据基础发酵培养液的ODsoo值 往基础发酵培养液中依次添加第二补料W及第=补料，第二补料包括葡萄糖、膜蛋白腺、酵 母提取物和微量金属元素液，第=补料包括葡萄糖、膜蛋白腺和酵母提取物。
[0007] -种发酵培养基，其包括:基础发酵培养液W及于发酵培养过程中依次添加在基 础发酵培养液中的第一补料、第二补料W及第=补料，第一补料包括葡萄糖和维生素液，第 二补料包括葡萄糖、膜蛋白腺、酵母提取物和微量金属元素液，第=补料包括葡萄糖、膜蛋 白腺和酵母提取物。
[000引本发明提供的重组人角质细胞生长因子-2工程菌的发酵方法及发酵培养基的有 益效果是:根据重组工程菌的生长特性，在发酵的过程中，采用对应基础发酵培养液不同的 ODsoo值，依次往基础发酵培养液中添加包括有葡萄糖和维生素液的第一补料，包括有葡萄 糖、膜蛋白腺、酵母提取物和微量金属元素液的第二补料，W及包括有葡萄糖、膜蛋白腺和 酵母提取物的第=补料的发酵工艺手段，为重组工程菌提供给营养适宜的发酵环境，确保 重组工程菌能够保持旺盛的活力，高产量地表达出人角质细胞生长因子-2。
【附图说明】
[0009]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍，应当理解，W下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对 范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据运 些附图获得其他相关的附图。
[0010] 图1为本发明实施例1提供的重组表达载体祀T2化的结构图；
[0011] 图2为本发明实施例1提供的重组工程菌的生长曲线图；
[0012] 图3为本发明实施例1提供的诱导不同时间点KGF-2的凝胶电泳图；
[0013] 图4为本发明实施例提供的重组工程菌的生物保藏信息。
【具体实施方式】
[0014] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建 议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过市售购买获得的常规产 品。
[0015] 下面对本发明实施例的重组人角质细胞生长因子-2工程菌的发酵方法及发酵培 养基进行具体说明。
[0016] 本发明实施例提供的重组人角质细胞生长因子-2工程菌的发酵方法，包括如下步 骤：
[0017] SI:活化菌种
[0018] 1.取冷冻保存的重组工程菌，融化后，将重组工程菌划线接种至LB固体培养基(含 lOOiig/mL的Kana)，于30~37°C、生长24~48小时至单菌落直径为2.8~3.2mm。
[0019] 其中，需要说明的是，本发明所用的重组工程菌是指能够表达出人角质细胞生长 因子-2的重组工程菌，即可称之为重组人角质细胞生长因子-2工程菌。该重组工程菌可通 过W大肠杆菌如化21、DH5a等细菌作为宿主菌，采用常规方法导入携带有KGF-2基因的表达 载体如祀T系列的载体后得到，KGF-2基因编码人角质细胞生长因子-2。
[0020] 本发明所用重组工程菌（具有Kana抗性），分类命名为Escherichia COli，于2016 年4月25日在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏，保藏编CGMCC No. 12390。
[0021] 其中，IL的LB固体培养基的制作方法如下，取IOg细菌培养用膜化蛋白腺、5g细菌 培养用酵母提取物、IOg化Cl、15g细菌培养用琼脂，加入到容器中，加入去离子水完全溶解 溶质定容至1L，于1.034X 105Pa、12^C下蒸汽灭菌20分钟，待培养基溫度降至5(rC时方可 加入不耐热的物质，如抗生素，该抗生素的类别对应于重组工程菌含有的重组表达载体的 抗性基因。
[0022] 2.挑取单菌落接种至LB液体培养基（含10化g/mL的Kana)中，于30~37°C、200~ 24化/min条件下，活化培养10~1地直至ODsqq值为0.8~1.2，得到活化培养液。
[0023] 其中，IL的LB液体培养基的制作方法如下，取IOg细菌培养用膜化蛋白腺、5g细菌 培养用酵母提取物、10NaCl、15g细菌培养用琼脂，加入到容器中，加入去离子水完全溶解溶 质定容至1L，于1.034X 105Pa、12^C下蒸汽灭菌20分钟，待培养基溫度降至5(rC时方可加 入不耐热的物质。
[0024] 3.再按1:50的体积比，将活化培养液接种至新鲜的LB液体培养基(含10化g/mL的 Kana)中，于30~37°C、200~24化/min,扩大培养至生长对数期，得到重组工程菌种子液。
[0025] S2:发酵培养，将上述得到的重组工程菌种子液接种至发酵培养基中，其中，发酵 培养基包括基础发酵培养液W及在发酵过程中依次添加在该基础发酵培养液中的第一补 料、第二补料W及第=补料。W下结合发酵方法对发酵培养液的成分含量进行说明。
[00%] 1.将上述得到的重组工程菌种子液按1:9~11的体积比接种至基础发酵培养液 中，并加入包括有葡萄糖和维生素液的第一补料。
[0027]其中，较佳地，上述基础发酵培养液按每升计包括:膜蛋白腺18~22g、酵母提取物 9~11邑、船(：19~11邑、1(2册〇4 3.2~3.7邑、皿2口0巧.8~6.2邑^及1邑5〇4 3.2~3.7邑。
[00%]进一步地，上述基础发酵培养液按每升计包括：膜蛋白腺20g、酵母提取物lOg、 NaCl 10g、K抽P〇4 3.5g、K出P〇4 6.0gW及MgS043.5邑。
[0029] 其中，上述第一补料按每升计包括:葡萄糖48~5?和维生素液9~llmL。较佳地， 第一补料按每升计包括:葡萄糖50g和维生素液lOmL。
[0030] 其中，维生素液按每升计包括:烟酸5.8~6.2g、核黄素 0.40~0.44g、盐酸化唉醇 1.2~1.6mg、D-泛酸0.28~0.32mg、生物素 0.058 ~0.062mg W 及叶酸0.038 ~0.042mg。进一 步地，维生素液按每升计包括:硫酸铜1.9g、铜酸钢0.012g、棚酸0.5g，氯化侣0.012g，氯化 锋0.0144g，氯化铁0.162g，氯化巧0.006g。
[0031 ] 2.将接种后的基础发酵培养液于发酵条件下，进行发酵培养。
[0032] 发酵条件具体为:控制发酵溫度30~37°C，优选为32°C;控制基础发酵培养液的抑 为6.8~7.2，优选地，采用7mol/L氨水或6mol/L肥1调苄基础发酵培养液抑至6.8~7.2，优 选为抑为7.0;控制基础发酵培养液中的溶解氧为20~60 %，优选地，控制基础发酵培养液 中的溶解氧为40%; W及控制通气量（无菌空气或空气与纯氧混合的无菌气体）为0.9~ 1.1VVM，优选为 1.0VVM。
[0033] 3.根据基础发酵培养液的ODsoo值往基础发酵培养液中依次添加第二补料W及第 =补料。
[0034] 首先，较佳地，在发酵的过程中，在基础发酵培养液的ODsoo值为2~6时，往发酵培 养液中添加第二补料。其中，第二补料包括葡萄糖、膜蛋白腺、酵母提取物和微量金属元素 液。
[0035] 较佳地，第二补料按每升计包括:葡萄糖48~52g、膜蛋白腺38~42g、酵母提取物 18~22g、微量金属元素液9~llmL。进一步地，第二补料按每升计包括:葡萄糖50g、膜蛋白 腺40g、酵母提取物20g、微量金属元素液1 OmL。
[0036] 其中，较佳地，微量金属元素液按每升计包括:硫酸铜1.7~2. Ig、铜酸钢0.01~ 0.014旨、棚酸0.48~0.52旨，氯化侣0.01~0.014旨，氯化锋0.0142~0.0146旨，氯化铁0.16~ 0.164g，氯化巧0.004~0.008g。进一步地，微量金属元素液按每升计包括:硫酸铜1.9g、铜 酸钢0.012g、棚酸0.5g，氯化侣0.012g，氯化锋0.0144g，氯化铁0.162g，氯化巧0.006g。
[0037] 其次，在发酵的过程中，在基础发酵培养液的ODsoo值为15~25时，往发酵培养液中 添加第=补料。其中，第=补料包括葡萄糖、膜蛋白腺和酵母提取物。
[0038] 较佳地，第=补料按每升计包括:葡萄糖48~52g、膜蛋白腺48~52g、酵母提取物 18~2地。
[0039] 由于重组工程菌在发酵的过程中，随着其繁殖的过程中，不断地消化基础发酵培 养液的养分。因此，需要不断地往基础发酵培养液添加适宜的营养物质。在本发明中，针对 重组工程菌的生长特性，在其不同的生长阶段，有差异性地针对性地往基础发酵培养液中 依次加入第一补料(接种初期加入）、第二补料(基础发酵培养液的ODsoo值为2~即寸加入）W 及第S补料(基础发酵培养液的ODsoo值为15~25时加入），去针对性地满足重组工程菌的各 生长阶段的营养需求，确保重组工程菌能够保持旺盛的生长活力，高产量地表达出人角质 细胞生长因子-2。
[0040] 4.诱导培养，在发酵过程中，往基础发酵培养液中加入诱导剂，诱导重组工程菌高 产量地表达出KGF-2。
[0041] 优选地，在重组工程菌的生长对数期加入诱导剂，该生长对数期对应的基础发酵 培养液的ODso日值为2~6,也就是说，在基础发酵培养液的ODso日值为2~即寸，往基础发酵培养 液中加入诱导剂。其中，诱导剂为IPTG(异丙基-P-D-硫代半乳糖巧，Isopropyie-D- thiogalactoside)。
[0042] 5.采用现有纯化方法，从诱导培养后的基础发酵培养液提纯出KGF-2。
[0043] W下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0044] 实施例1
[0045] 首先，活化菌种
[0046] 1.取冷冻保存的重组工程菌，融化后，将重组工程菌划线接种至LB固体培养基(含 lOOiig/mL的Kana),于32°C、生长24~48小时至单菌落的大小为3mm左右。该重组工程菌是W 重组表达载体祀T26b(结构如图1所示)转化大肠杆菌后得到，其中，pET26b携带有编码人角 质细胞生长因子-2化GF-2)的KGF-2基因。该重组工程菌，分类命名为Escherichia COli，于 2016年4月25日在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏，保藏编CGMCC No. 12390。本实施例所用重 组工程菌的生物保藏信息见图4。
[0047] 2.挑取单菌落接种至LB液体培养基(含10化g/mL的Kana)中，于32°C、220r/min条 件下，活化培养1化直至ODsqq值为1.0左右，得到活化培养液。
[004引3.再按1:50的体积比，将活化培养液接种至新鲜的LB液体培养基(含10化g/mL的 Kana)中，于32°C、220r/min，扩大培养至生长对数期，得到重组工程菌种子液。
[0049] 需要说明的是，活化菌种的步骤可选择性地进行，在其他的实施例中，也可W不用 活化菌种，可直接将含有重组工程菌接种发酵培养。
[0050] 接着，发酵培养
[0051 ] 1.将上述得到的重组工程菌种子液W1:10的体积比接种至60L础发酵培养液的发 酵罐(上海百伦，型号:化BI0-100STA-UIP)中，并加入4.化第一补料。该发酵罐可显示溶氧、 pH、溫度、揽拌转速等参数，并带有蠕动累可进行pH控制和自动补料。
[0052] 其中，较佳地，在本实施例中基础发酵培养液按每升计包括:膜蛋白腺20g、酵母提 取物 10g、NaCl 10g、K2HP〇4 3.5g、KH2P〇4 6gW及MgS〇4 3.5邑。
[0053] 其中，较佳地，在本实施例中，第一补料按每升计包括：葡萄糖50g和维生素液 lOmL。
[0054] 其中，较佳地，在本实施例中，维生素液每升计包括:硫酸铜1.9g、铜酸钢0.012g、 棚酸0.5g，氯化侣0.0 l 2g，氯化锋0.0144g，氯化铁0.162g，氯化巧0.006g。
[0055] 2.调节发酵条件，进行发酵培养。
[0056] 调节发酵罐的参数，设置发酵条件具体为：
[0057] 通过发酵罐自带的夹套水浴自动控制发酵溫度度为32°C ;
[005引采用7mol/L氨水调苄基础发酵培养液pH至7.0，当然，在其他的实施例中，也可W 采用6mol/L的肥1进行调节；
[0059] 通过调节揽拌棒的转速控制基础发酵培养液中的溶解氧为40%，当然，在其他的 实施例中溶解氧可W不同；
[0060] 调节发酵罐中通气量(无菌空气与纯氧混合的无菌气体)为1VVM，当然，在其他的 实施例中通气量可W不同。
[0061 ] 3.根据基础发酵培养液的ODsoo值往基础发酵培养液中依次添加第二补料W及第 =补料。第二补料和第=补料分两个阶段加入，具体如下。
[0062] (1)、在发酵的过程中，在基础发酵培养液的ODsoo值为2~6时，往发酵培养液中添 加化第二补料。
[0063] 其中，第二补料包括葡萄糖、膜蛋白腺、酵母提取物和微量金属元素液。
[0064] 在本实施例中，第二补料按每升计包括：葡萄糖50g、膜蛋白腺40g、酵母提取物 20g、微量金属元素液1 OmL。
[0065] 在本实施例中，微量金属元素液按每升计包括:硫酸铜1.9g、铜酸钢0.012g、棚酸 0.5g，氯化侣0.012g，氯化锋0.0144g，氯化铁0.162g，氯化巧0.006g。
[0066] (2)、在加入第二补料后，在发酵的过程中，在基础发酵培养液的ODsoo值为15~25 时，往发酵培养液中添加化第=补料。
[0067] 其中，第=补料包括葡萄糖、膜蛋白腺和酵母提取物。
[0068] 在本实施例中，第S补料按每升计包括：葡萄糖50g、膜蛋白腺50g、酵母提取物 20邑。
[0069] 需要说明的是，第一补料、第二补料W及第=补料的加入方式均采用缓慢匀速的 流加方式，加入的量可根据实际情况确定。
[0070] 在第一补料加入后，间隔地取基础发酵培养液，采用紫外分光光度法检测基础发 酵培养液ODsoo值，W反映菌体的生长情况，结果如图2所示。由图2可知，随着发酵时间的增 加，基础发酵培养液的ODsoo值呈几何指数增加，由此表明菌体的浓度在增加，菌体生长情况 良好。
[0071] 4.诱导培养，在发酵过程中，往基础发酵培养液中加入诱导剂，诱导重组工程菌高 产量地表达出KGF-2。
[0072] 在重组工程菌的生长对数期加入诱导剂例如IPTG，该生长对数期对应的基础发酵 培养液的ODso日值为2~6,也就是说，在基础发酵培养液的ODso日值为2~即寸，往基础发酵培养 液中加入诱导剂，至基础发酵培养液的ODsoo值为30~50时，终止发酵。
[0073] 在此步骤中，分别在加诱导剂前、加诱导剂后化、加诱导剂后化、诱导剂化、W及加 诱导剂后地的时间点，取发酵罐中的正在进行发酵的基础发酵培养液（W下简称发酵液）W 提取KGF-2蛋白样品，进行蛋白凝胶电泳，检测KGF-2的表达量情况W及其他相关指标如湿 菌量、KGF-2表达量等，结果如图3所示。
[0074] 由图3可知（图中1为蛋白Maker, 2为加诱导剂前、3为加诱导剂后化、4为加诱导剂 后化、5为加诱导剂后化、6为加诱导剂后4h)，在加入诱导剂前，其条带的颜色较浅，表面单 位发酵液中的KGF-2表达量低，加入诱导剂后，随着发酵时间的增加，各时间点的条带颜色 越来越深，表面KGF-2表达量在增加，且在加入诱导剂4h的条带颜色较深，表明在加入诱导 剂4h后，KGF-2表达量最高，单位发酵液中的KGF-2含量也最多;此外，KGF-2分子量在22KD左 右，与预期的KGF-2分子量大小一致。
[0075] 5.停止发酵后，采用现有提取工艺例如固液分离法、离子交换法等，可从发酵液中 提纯出KGF-2。
[0076] 本实施例通过在重组工程菌接种初期加入第一补料、在0D600值为2~6时加入第 二补料，W及在0D600值为15~25时加入第=补料，使得在发酵的过程中基础发酵培养液中 的菌体浓度得到了大幅度提高(湿菌量达到lOOg/L)，配合对发酵工艺参数(如培养溫度32 °C、溶解氧为40%、pH7.0、诱导4h)的优化，使得表达出的可溶性的人角质细胞生长因子-2 产量也高(5mg/g)，单位发酵液的KGF-2产量达到了 500mg/L。
[0077] 实施例2-实施例6
[0078] 需要说明的是，在实施例2-6中，所采用的发酵方法的原理和步骤与本实施例大致 相同，主要不同的是所用的基础发酵液W及第一补料、第二补料、第=补料的成分及含量， W及发酵条件，实施例2~6中所用的基础发酵液W及第一补料、第二补料、第=补料的成分 及含量，W及发酵条件参数如表1和表2所示。此外，还有如下不同点，实施例2没有没有采用 诱导剂IPTG进行诱导培养，实施例3~4均采用了诱导剂IPTG进行诱导;实施例2、3、4、5是分 别按体积比1:11、1:9、1:10、1:9的比例将重组工程菌种子液接种至基础发酵培养液中，实 施例6是直接将重组工程菌直接接种至基础发酵培养液中，没有经过菌种活化的步骤。
[0079] 表1.本发明实施例2-6所用发酵培养基的成分含量W及发酵条件参数表
[0080]
[0081] 表2.本发明实施例2-6所用的维生素液和微量金属元素液的成分含量
[0082]
[0083] 采用实施例2~6的发酵方法，重组工程菌在发酵的过程中，同样具有较高的菌体 浓度，W及高产量地表达出了KGF-2,其产生的效果与实施例1大致相同。
[0084] 综上，针对重组工程菌的生长特性，本发明通过在其不同的生长阶段，有差异性地 针对性地往基础发酵培养液中依次在接种初期加入第一补料、在ODsoo值为2~6时加入第二 补料，W及在ODsgg值为15~25时加入第=补料，通过优化基础发酵培养液的营养成分，针对 性地满足重组工程菌的各生长阶段的营养需求，确保重组工程菌能够保持旺盛的生长活 力，使得菌体浓度得到大幅度提高(湿菌量达到lOOg/L)，配合对发酵工艺参数(如培养溫度 32°C、溶解氧为40%、pH7.0、诱导4h)的优化，使得表达出的可溶性的人角质细胞生长因子- 2产量也高（5mg/g)，单位发酵液的KGF-2产量达到了 500mg/L，有效地解决了现有发酵工艺 中存在的KGF-2表达产量低无法规模化生产的问题。
[0085] W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可W有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种重组人角质细胞生长因子-2工程菌的发酵方法，其特征在于，其包括： 将能够表达出人角质细胞生长因子-2的重组工程菌接种至基础发酵培养液中，并加入 第一补料，于发酵条件下，进行发酵培养，所述第一补料包括葡萄糖和维生素液； 根据所述基础发酵培养液的〇D_值往所述基础发酵培养液中依次添加第二补料以及 第三补料，所述第二补料包括葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物和微量金属元素液，所述第三 补料包括葡萄糖、胰蛋白胨和酵母提取物。2. 根据权利要求1所述的重组人角质细胞生长因子_2工程菌的发酵方法，其特征在于， 根据所述基础发酵培养液的〇D_值往所述基础发酵培养液中依次添加所述第二补料以及 所述第三补料包括： 在所述基础发酵培养液的〇D_值为2~6时，往所述发酵培养液中添加所述第二补料； 以及 在所述基础发酵培养液的〇D_值为15~25时，往所述发酵培养液中再添加所述第三补 料。3. 根据权利要求1所述的重组人角质细胞生长因子_2工程菌的发酵方法，其特征在于， 所述发酵条件为:发酵温度30~35°C、所述基础发酵培养液的pH为6.8~7.2以及溶解氧为 20~60% 〇4. 根据权利要求1所述的重组人角质细胞生长因子_2工程菌的发酵方法，其特征在于， 所述发酵方法还包括诱导培养，所述诱导培养为:在所述重组工程菌发酵的过程中，在所述 重组工程菌的生长对数期往所述基础发酵培养液中加入诱导剂，所述诱导剂为IPTG。5. 根据权利要求1所述的重组人角质细胞生长因子_2工程菌的发酵方法，其特征在于， 将所述重组工程菌接种至所述基础发酵培养液中是将重组工程菌种子液按1:9~11的体积 比接种至所述基础发酵培养液中。6. 根据权利要求5所述的重组人角质细胞生长因子-2工程菌的发酵方法，其特征在于， 在将所述重组工程菌种子液接种至所述基础发酵培养液中进行发酵培养之前，所述发酵方 法还包括： 将所述重组工程菌接种至LB固体培养基，于30~37 °C、生长24~48小时至单菌落的直 径为2.8~3.2mm; 再挑取所述单菌落接种至LB液体培养基中，于30~37°C、200~240r/min条件下，活化 培养10~14h至OD6qq值为0.8~1.2，得到活化培养液;以及 按1:50的体积比，将所述活化培养液接种至LB液体培养基中，于30~37°C、200~240r/ min条件下，扩大培养至生长对数期，得到所述重组工程菌种子液。7. -种发酵培养基，其特征在于，其包括:基础发酵培养液以及于发酵培养过程中依次 添加在所述基础发酵培养液中的第一补料、第二补料以及第三补料，所述第一补料包括葡 萄糖和维生素液，所述第二补料包括葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物和微量金属元素液，所 述第三补料包括葡萄糖、胰蛋白胨和酵母提取物。8. 根据权利要求7所述的发酵培养基，其特征在于，所述基础发酵培养液按每升计包 括:胰蛋白胨18~22g、酵母提取物9~llg、NaCl 9~llg、K2HP〇4 3.2~3.7g、KH2P〇4 5.8~ 6.2g&&MgS〇4 3.2~3.7g。9. 根据权利要求7所述的发酵培养基，其特征在于，所述第一补料按每升计包括:葡萄 糖48~52g和所述维生素液9~I ImL，优选地，所述维生素液按每升计包括:烟酸5.8~6.2g、 核黄素〇 · 40~O · 44g、盐酸吡咳醇1 · 2~1 · 6mg、D_泛酸O · 28~O · 32mg、生物素 O · 058~ 0 · 062mg 以及叶酸 0 · 038 ~0 · 042mg。10.根据权利要求7所述的发酵培养基，其特征在于，所述第二补料按每升计包括:葡萄 糖48~52g、胰蛋白胨38~42g、酵母提取物18~22g和所述微量金属元素液9~llmL，优选 地，所述微量金属元素液按每升计包括:硫酸铜1.7~2. Ig、铜酸钠0.01~0.014g、硼酸0.48 ~0 · 52g，氯化铝0 · 01~0 · 014g、氯化锌0 · 0142~0 · 0146g、氯化铁0 · 16~0 · 164g、氯化钙 0 · 004~0 · 008g〇
【文档编号】C12R1/19GK105925647SQ201610481209
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】贾芳苗
【申请人】成都远睿生物技术有限公司