试剂盒、试剂盒的用途及检测目标区域变异的方法及系统的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种试剂盒，其包含探针，所述探针固定在固相基质上或者所述探针游离于溶液中，所述探针能够特异性识别目标区域，其中，所述目标区域包括下列之一：表1所示163个基因中的至少之一；或表1中所述至少一种基因的CDS区域；或表1中所述至少一种基因的CDS区域的上下游至少10?20bp的区域。发明还提供试剂盒的用途、一种检测目标区域变异的方法及系统。利用本发明的试剂盒和/或本发明的方法及系统，能够一次性、简单方便且高特异性的获取遗传性耳聋的相关基因序列，能够准确检测分析这些相关基因序列，使检测分析结果可以辅助用于遗传性耳聋的研究。
【专利说明】
试剂盒、试剂盒的用途及检测目标区域变异的方法及系统
技术领域
[0001] 本发明设及生物医学领域，具体的，设及试剂盒及其用途，更具体的，本发明设及 一种试剂盒、试剂盒的用途、W及一种检测目标区域变异的方法及系统。
【背景技术】
[0002] 遗传性耳聋指的是由于基因和染色体异常所致的耳聋。运种疾病是由父辈的遗传 物质(包括染色体及位于其中的基因）发生了改变传给后代而引起的耳聋，并且在后代中W 一定数量出现。
[0003] 目前，用于耳聋基因检测的技术方法有PCR-RFLP法、微阵列忍片法、ARMS-PCR法、 巧光定量PCR法，凝胶电泳法，巧光烙解曲线法，巧光毛细管电泳法。现阶段广泛使用的是微 阵列忍片法和巧光定量PCR法，它们的主要技术缺陷如下：
[0004] 微阵列忍片法检测需经过全血DNA提取(30min)、PCR扩增(化W上）、产物杂交分析 (化W上）等步骤，检测时间长(化W上），操作繁琐；由于操作流程过多，容易造成样本交叉 污染;其次，对单个碱基的辨识率比较低，易出现假阴性和假阳性，使结果的准确率受到影 响;此外，微阵列忍片成本过高，需要专口的忍片扫描仪器，检测成本高;普通ARMS-PCR产品 的扩增效率仅为正常扩增的1-10%，因此扩增体系缺乏稳定性；四引物ARMS-PCR的一个反 应只能检一个突变位点。普通PCR产品共有的缺点为:在结果判读时需要通过条带大小判断 基因型，缺乏直观性。凝胶电泳检测结果容易造成PCR交叉污染、检测灵敏度低且耗时长;利 用Taqman探针进行SNP突变检测，每检测一个位点需要2条探针，且对探针特异性有较高要 求。探针合成成本较高，对巧光PCR仪的通道数有要求，不利于推广;巧光烙解曲线法检测一 管检测位点少，且受巧光染料通道限制无法满足耳聋多基因多位点的检测;PCR-RFLP法检 测技术操作繁琐，需要经过酶切反应，反应时间长，同时需要凝胶电泳检测容易出现样本交 叉污染。酶切位点易受基因变异影响；多重PCR引物体系较复杂，较难设计，多对引物之间会 形成相互干扰，竞争性抑制。因此检测位点越多，所需引物越多，PCR体系优化难度越高，同 时受毛细管电泳仪巧光通道的限制，产品推广较难，一般检测位点最多不超过20个。
[0005] 现有产品共有的缺点是检测位点少，只能检测遗传性耳聋基因热点突变，无法检 测众多的稀有位点，然而耳聋致病基因多，突变位点多，W上方法均无法满足技术发展快 速，简便，检测范围广的要求。
【发明内容】
[0006] 依据本发明的一方面，本发明提供一种试剂盒，其包含探针，所述探针固定在固相 基质上或者游离于溶液中，所述探针能够特异性识别目标区域，其中，所述目标区域包括下 列之一：
[0007] 表1所示163个基因中的至少之一;或表1中所述至少一种基因的CDS区域;或表1中 所述至少一种基因的CDS区域的上下游至少10-2化P的区域。
[000引本发明另一方面提供一种上述任一试剂盒在获取遗传性耳聋相关基因序列中的 用途。
[0009] 本发明另一方面提供一种检测目标区域变异的方法，包括：
[0010] (1)获取待测样本中的核酸，所述核酸由多个初始DNA片段组成，所述初始DNA片段 来自断裂的基因组DNA和/或游离的DNA片段；
[0011] (2)将所述核酸打断成100-70化P范围的短序列DNA片段，所述短序列DNA片段具有 平末端；
[001 ^ (3)加碱基"A"至所述DNA片段的3 '端，获得具有粘性末端A的DNA片段；
[0013] (4)连接接头于所述粘性末端片段的两端，获得接头连接片段；
[0014] (5)利用第一引物对所述接头连接片段进行第一扩增，获得第一扩增产物；
[001引（6)利用上述试剂盒对所述第一扩增产物进行捕获，获得所述目标区域；W及， [0016] (7)利用第二引物对所述目标区域进行第二扩增，获得第二扩增产物；
[0017] (8)将所述扩增产物进行测序，获得所述目标区域变异位点信息，变异包括SNP、 InDeLSV和CNV变异中的至少一种。
[0018] 本发明另一方面提供一种检测目标区域变异的系统，包括:核酸获取装置，用于获 取待测样本中的核酸，所述核酸由多个初始DNA片段组成，所述初始DNA片段来自断裂的基 因组DNA和/或游离的DNA片段;打断装置，用于将所述核酸打断成100-700bp范围的短序列 DNA片段，所述短序列DNA片段具有平末端；加碱基A装置，用于加碱基"A"至所述短序列DNA 片段的3 '端，获得具有粘性末端A的DNA片段;接头连接装置，用于连接接头于所述粘性末端 片段的两端，获得接头连接片段;第一扩增装置，用于利用第一引物对所述接头连接片段进 行第一扩增，获得第一扩增产物;捕获装置，用于利用前述含有探针的任一试剂盒对所述第 一扩增产物进行捕获，获得所述目标区域；W及，第二扩增装置，用于利用第二引物对所述 目标区域进行第二扩增，获得第二扩增产物;测序装置，用于将所述扩增产物进行测序，获 得所述目标区域变异位点信息，变异包括SNP、InDel、SV和CNV变异中的至少一种。
[0019] 本发明的方法，是一种高灵敏性、高特异性、高通量的方法，能够辅助用于遗传性 耳聋的相关基因的科学研究。通过使用新一代高通量测序技术，结合本发明一方面的试剂 盒包含的能特异性捕获特定目标区域的探针，能够在很短的时间内同时进行多例样本检 ，并且可W基于相同数据量进行更高深度的数据挖掘，检测结果特异性高，具较低的假阳 性率、假阴性率，能够确保得到的检测结果能够准确的反应受检者的实时外周血状况。而且 此忍片中的探针集不仅可W灵活的挑选检测基因，还能随着导致遗传性耳聋新基因的发 现，加入新的基因，具有很高的性价比和针对性。
【附图说明】
[0020] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得 明显和容易理解，其中：
[0021] 图1显示了根据本发明的一个实施例，测定目标区域变异的方法的流程图。
【具体实施方式】
[0022] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次建立了一种测定目标区域变异的方法。具 体而言，本发明人根据现有疾病基因的信息，设计了固定有多种疾病特异性探针的核酸忍 片;对待测样本中游离的、片段化的、源自基因组DNA的双链核酸分子的末端加入接头，并进 行富集;用核酸忍片对含接头的DNA片段进行捕获，将捕获的片段在高通量测序平台进行测 序，基于已知的基因位点信息，对测序结果进行分析，得到目标区域核酸变异的信息。
[002；3]本发明中的"变异"、"核酸变异"、"基因变异"可通用，本发明中的"SNP" (SNV)、 "CNV"、"插入缺失"（indel)和"结构变异"（SV)同通常定义，但本发明中对各种变异的大小 不作特别限定，运样运几种变异之间有的有交叉，比如当插入/缺失的为大片段甚至整条染 色体时，也属于发生拷贝数变异(CNV)或是染色体非整倍性，也属于SV。运些类型变异的大 小交叉并不妨碍本领域人员通过上述描述执行实现本发明的方法和/或系统并且达到所描 述的结果。
[0024] 本发明中的"参考序列"为已知基因组序列或者已知基因组序列的至少一部分，本 发明中所使用的"第一"、"第二"等仅为方便描述指代，不能理解为指示或暗示相对重要性， 也不能理解为有先后顺序关系。本发明的描述中，除非另有说明，"多个"的含义是两个或两 个W上。
[0025] CDS区域即编码区域，编码区是指能够转录信使RNA的部分，它能够合成相应的蛋 白质。
[0026] 获得本发明一方面的试剂盒、实现本发明一方面的方法，一般包括目标区域捕获 探针/忍片的设计、微量样本建库及杂交上机测序、下机数据的生物信息分析和变异数据解 读。
[0027] -种试剂盒，其包含探针，所述探针固定在固相基质上或者所述探针游离于溶液 中，所述探针特异性识别目标区域，其中，所述目标区域包括：
[0028] 表1所示163个基因中的至少之一;或表1中所述至少一种基因的CDS区域;或表1中 所述至少一种基因的CDS区域的上下游至少10-2化P的区域。
[0029] 表 1
[0030]
[0031 ] 在本发明的一个实施例中，目标区域包括表1所示163个基因中的至少10、20、30、 50、100或150个基因。在本发明的一个实施例中，目标区域包括表1所示163个基因的全部基 因区域。本发明的试剂盒探针能够特异性识别的目标区域，是发明人经过多次收集、多次筛 选和多次试验组合获得的，运些目标区域与遗传性耳聋的发生发展相关。
[0032] 进一步的，所述探针的长度为20-120mer。较佳地，50-100mer，更佳地，60-80mer。
[0033] 在本发明的一个实施例中，所述探针的制备包括如下步骤:确定所述目标区域的 参考序列;从所述参考序列的一端开始，在所述参考序列上依次获取DNA片段直至所述参考 序列的另一端;将所述DNA片段与所述参考序列比对，获得每一条DNA片段在参考序列上的 比对次数，过滤掉比对次数超过1的DNA片段;去除掉GC含量不在30-80 %的DNA片段。
[0034] 其中，一条DNA片段为一条探针，全部所述DNA片段构成探针集，所述DNA片段之间 完全重叠、部分重叠或完全不重叠，所述探针集能够覆盖所述目标区域至少一次。
[0035] 所说的目标区域的参考序列可W从参考基因组上获取，例如从人参考基因组HG19 上获得对应目标区域的基因，所有的HG19上的对应的基因构成所述的目标区域的参考序 列，服19可W从NCBI数据库下载。
[0036] 进一步的，探针的制备还包括:确定所述目标区域在参考基因组上的位置，获取所 述目标区域的参考序列，从所述参考序列一端的第一个核巧酸开始拷贝所述参考序列获取 第一条DNA片段，从所述参考序列一端的第二个核巧酸开始拷贝所述参考序列获取第二条 DNA片段，从所述参考序列一端的第S个核巧酸开始拷贝所述参考序列获取第S条DNA片 段，运样依次获取后续DNA片段直至第N条DNA片段的一端超出所述参考序列的另一端，其 中，一条DNA片段为一条探针，全部所述DNA片段构成所述探针集，N为所述探针集中包含的 探针的总数。
[0037] 依据本发明的另一方面，本发明提供一种上述任一试剂盒在获取遗传性耳聋相关 基因序列中的用途。利用本发明一方面的试剂盒能够一次性、简单方便且高特异性的获取 遗传性耳聋的相关基因序列。
[0038] 依据本发明的又一方面提供一种检测目标区域变异的方法，包括：（1)获取待测样 本中的核酸，所述核酸由多个初始DNA片段组成，所述初始DNA片段来自断裂的基因组DNA 和/或游离的DNA片段；（2)将所述核酸打断成100-7(K)bp范围的短序列DNA片段，所述短序列 DNA片段具有平末端；（3)加碱基"A"至所述DNA片段的3 '端，获得具有粘性末端A的DNA片段； (4)连接接头于所述粘性末端片段的两端，获得接头连接片段；（5)利用第一引物对所述接 头连接片段进行第一扩增，获得第一扩增产物；（6)利用上述任一试剂盒对所述第一扩增产 物进行捕获，获得所述目标区域；W及，（7)利用第二引物对所述目标区域进行第二扩增，获 得第二扩增产物；（8)将所述扩增产物进行测序，获得所述目标区域变异位点信息，变异包 括SNP、InDe 1、SV和CNV变异中的至少一种。
[0039] 本发明的检测方法，特别适用于含微量核酸的样本，在本发明的一个实施例中，样 本为含微量游离DNA片段的血浆样本，包含极其微量的目标游离DNA片段，第一扩增使得核 酸的量能满足探针杂交捕获的需求，而因探针杂交捕获会损耗一定量的核酸，第二扩增能 使捕获下的目标片段获得再次扩增W满足上机测序和质控检测的要求。该方法特别适用于 总游离核酸不低于IOng或者常规组织基因组DNA不低于化g的样本的检测，使用本方法测序 的下机数据质量高，利于后续的准确检测分析。
[0040] 在本发明的一个实施例中，步骤(2)中打断的方法为超声打断，优选采用covaris 打断仪进行打断。打断后的片段长度为l〇〇-7(K)bp，优选为200-25化P。
[0041] 在本发明的一个实施例中，步骤(1)中所述短序列DNA片段具有平末端是通过末端 修复的方法制备。根据本发明的一个实施例，在将DNA片段进行末端修复前，可W进一步包 括纯化DNA片段的步骤，由此，使得后续的末端修复易于进行。根据本发明的实施例，将DNA 片段进行末端修复可W利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核巧酸激酶进行，其中，所述 Klenow片段具有5 ' 一3 '聚合酶活性和3 '一5'聚合酶活性，但缺少5' 一3 '外切酶活性。由此， 能够方便准确地对DNA片段进行末端修复。根据本发明的实施例，还可W进一步包括对经过 末端修复的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。
[0042] 进一步的，在经过末端修复的DNA片段的3'末端添加碱基A，W便获得具有粘性末 端A的DNA片段。根据本发明的一个实施例，可W利用1(1611〇巧(3'一5'6义〇-)，即具有3'一5'外 切酶活性的Klenow,在经过末端修复的DNA片段的3'末端添加碱基A。由此，能够方便准确地 将碱基A添加到经过末端修复的DNA片段的3'末端。根据本发明的实施例，还可W进一步包 括对具有粘性末端A的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。
[0043] 进一步的，对所述具有粘性末端A的DNA片段添加接头。
[0044] 进一步的，可W使用热启动taq DNA聚合酶对经过转换的目的片段进行PCR扩增。 根据本发明的实施例，热启动taq DNA聚合酶的种类不受特别限制，根据本发明的具体示 例，热启动化qDNA聚合酶可W为r-化q聚合酶，由此PCR扩增效率高、用时少。
[0045] 在本发明的一个实施例中，所述第一引物序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所 示;所述第二引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
[004Al
[0047] 在本发明的一个实施例中，步骤(8)进一步包括：（a)对所述扩增产物进行测序，获 得测序数据，所述测序数据由多个读段组成;其中，在化XtSeq CN500上进行所述测序；（b) 对所述测序数据进行过滤，所述过滤包括去除掉不确定碱基比例超过10%的读段和/或碱 基质量值不大于5的碱基数的比例不小于50%的读段；（C)将所述测序数据与参考序列进行 比对，获得比对结果，统计所述比对结果，对所述比对结果进行过滤，所述过滤包括去除掉 比对中错配碱基数多于3个读段，获得所述目标区域中的SNP、InDel、SV和CNV变异中的至少 之一;其中所述参考序列为HG19。其中，所述比对包括但不限于SOAP或BWA等软件依照其默 认设置进行。所述比对结果包括读段在参考序列上的匹配位置及匹配情况信息。
[0048] 进一步的，测序技术可采用第二代测序技术或第=代测序技术进行。本领域人员 可W理解的，所述测序平台还可W采用111胆1〇曰的^3692000/2500平台、1^^6 Technologies的Ion Torrent平台、单分子测序平台等。在本发明的一个实施例中，采用贝 瑞和康公司的化XtSEQ CN 500测序平台。
[0049] 在本发明的一个实施例中，步骤(8)进一步包括:将所述测序数据与参考序列进行 第一比对，获得第一比对结果，去除掉第一比对结果中的一个读段对中的两个读段相同的 读段对，其中所述参考序列为HG19;将所述第一比对结果与所述参考序列的一部分进行第 二比对，获得第二比对结果;基于所述第一比对结果和所述第二比对结果，同时检测所述目 标区域中的SNP、InDe 1、SV和CNV变异中的至少之一。其中，所述参考序列的一部分包括目标 区域参考序列中的每个已知InDel位点，W及所述每个已知InDel位点上下游各1000 bp的参 考序列。所说的第二比对为局部比对，第一比对为常规全局比对，可利用但不限于SOAP或 BWA等软件依照其默认设置进行，获得第一比对结果，第一比对结果包括读段在参考序列上 的匹配位置及匹配情况信息，在本发明的一个实施例中，进行第二比对即基于第一比对结 果，对与所捕获的基因区域对应的参考序列中的所有已知IND化附近的所有序列信息 (reads)进行局部重新比对，能够消除第一比对中的错误，提高后续变异检测的准确性，第 二比对可利用6411(重比对软件化1：193://\￥丽.131'0日(1；[]131：；[1：111日.0巧/旨日14/)进行。在本发明 的一个实施例中，通过GATK化if iedGenotyper软件同时检测所说的SNP和IN呢L变异。
[0050] 在本发明的一个实施例中，所述方法具有如下特征:所述样本来源于人或动物;所 述目标区域为遗传性耳聋相关基因区域。
[0051] 本发明另一方面提供一种检测目标区域变异的系统，包括：
[0052] 核酸获取装置，用于获取待测样本中的核酸，所述核酸由多个初始DNA片段组成， 所述初始DNA片段来自断裂的基因组DNA和/或游离的DNA片段;打断装置，用于将所述核酸 打断成100-7(K)bp范围的短序列DNA片段，所述短序列DNA片段具有平末端;加碱基A装置，用 于加碱基"A"至所述短序列DNA片段的3 '端，获得具有粘性末端A的DNA片段;接头连接装置， 用于连接接头于所述粘性末端片段的两端，获得接头连接片段;第一扩增装置，用于利用第 一引物对所述接头连接片段进行第一扩增，获得第一扩增产物;捕获装置，用于前述任一包 含探针的试剂盒对所述第一扩增产物进行捕获，获得所述目标区域；W及，第二扩增装置， 用于利用第二引物对所述目标区域进行第二扩增，获得第二扩增产物;测序装置，用于将所 述扩增产物进行测序，获得所述目标区域变异位点信息，变异包括SNP、InDel、SV和CNV变异 中的至少一种。
[0化3] 在本发明的一个实施例中，所述第一引物序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所 示;所述第二引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
[0化4]
[0055] 在本发明的另外一个实施例中，所述检测目标区域变异的系统还包括：
[0056] 过滤装置，用于对所述测序数据进行过滤，所述过滤包括去除掉不确定碱基比例 超过10%的读段和/或碱基质量值不大于5的碱基数的比例不小于50%的读段；
[0057] 比对装置，用于将所述测序数据与参考序列进行比对，获得比对结果，统计所述比 对结果，对所述比对结果进行过滤，所述过滤包括去除掉比对中错配碱基数多于3个读段， 获得所述目标区域中的SNP、InDe 1、SV和CNV变异中的至少之一;其中所述参考序列为服19。 [005引前述对于本发明一方面或者任一【具体实施方式】中的检测目标区域变异的方法的 技术特征和优点的描述，同样适用于本发明运一方面的系统，在此不再寶述。
[0059] 下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。除另有交待，W下 实施例中设及的未特别交待的试剂、序列(接头、标签和引物）、软件及仪器，都是常规市售 产品或者开源的，比如购自贝瑞和康公司的化XtSEQ CN 500测序平台建库相关试剂盒来进 行文库构建等。
[0060] 实施例一设计忍片
[0061] 染色体变异与单基因都可W导致遗传性耳聋，染色体变异又包括染色体数目、结 构的改变，单亲二倍体与嵌合现象也可W导致遗传性耳聋。本发明只针对单基因导致的遗 传性耳聋。通过对OMIM数据库W及相关文献的查找，目前有163个单基因导致的400多种与 遗传性耳聋相关的单基因疾病。
[0062] 根据人类基因组HG19,选取上诉163个基因的外显子序列W及侧翼±10-2化P区域 进行捕获测序，忍片大小约为I. 6M。该忍片上覆盖了丰富的捕获探针，探针覆盖区域达 99.0%，可W从复杂的基因组中富集目标DNA片段，在同一张忍片上W高特异性和高覆盖率 捕获约为1.6M的基因组区域。所述基因详见表1。
[0063] 实施例二检测目标区域变异，具体流程参见图1。
[0064] ( - )样本制备
[0065] 用常规DNA提取方法提取样本DNA，尤其选用盐析法。将大片段DNA进行超声打断， 目前使用样品打断方法为Covaris打断法，将样品DNA打碎至100-7(K)bp范围的片段。优选在 200-250bp范围为佳。
[0066] (二)文库构建
[0067] 1.末端修复
[006引
1234 反应后加入Ampure Beads 18化L，磁珠纯化后，最后回溶30化dd此0,带磁珠进行 下一步反应； 2 2.末端加A 3
[0071]
4 3.接头连接
[0073]
[0074] 司溶；
[0075]
[0076] 1234 化应后加人150化Ampure Beads巧打广物纯化，便用31化ddHsU回溶，取上清液 后质控并进行忍片杂交。 2 (S)目标区域捕获忍片杂交 3
[00巧]1.采用实施例一设计的目标区域捕获忍片DeafnessGen-1.6M，按照常规忍片使用 的方法进行杂交捕获及洗脱，获取目的基因并PCR富集。 4 2. PCR 扩增
[0081]
[00剧（四化机测序
[0083] 采用化Xtseq CN 500PE75+8+75程序进行上机测序，测序实验操作按照制造商提 供的操作说明书(参见杭州贝瑞和康基因诊断公司官方公布cBot)进行上机测序操作。
[0084] 实施例=测序数据分析
[0085] 1.根据实施例二的方法获得测序数据。
[00化]2.下机数据过滤Reads_fi Iter:筛选符合分析要求的reads。需要满足两个条件： Dreads中N的数目<10%; 2)质量值巧的碱基不超过50%。
[0087] 3.序列比对：Bwa aln-〉sampe I samtools view I samtools sort:与人类参考基因 组序列比对，得到每条reads在染色体上的位置及质量信息。比对后的文件Wbam格式存在； [008引 4.去重复MarkD叫Iicates . jar:将比对到参考基因组相同起点的reads标记为重 复，在后续分析中只作为一条reads分析；
[0089] 5.重 tk 对：GenomeAnaly si sTK.jar-T Reali gner、Targe tCreator、 IndelReal igner:将前期比对质量差的reads针对性地利用其他比对工具进行重新比对，提 高数据利用率；
[0090] 6.质量值校正GenomeAnalysisTK. jar-T BaseRecalibrator,PrintReads :根据 reads特点对质量值作校正，提高支持的可信度；
[0091] 7.过滤Fi lt_bam:去除比对中错配碱基数多于3个的reads，提高准确性；
[0092] 8.质控QC:统计忍片的捕获效率、有效reads数、平均深度、重复率、覆盖度及未被 覆盖的区间等信息，对忍片设计、样本处理及上机测序过程进行评估和反馈，保证质量控制 过程。
[0093] 9.识别SNVInDe 1/SV/CNV及筛选其中的高频变异位点：
[0094]用 Mu^ct、varScan、somVar 流程识别出 SNP 变异；
[00 巧]用 gatk、varScan、somVa;r 流程识别出 InDel 变异；
[0096] 用 contra. py 流程识别出 CNV;
[0097] 用somVar流程识别出SV;
[0098] 针对不同的变异类型选用不同的检测软件及参数。
[0099] 10.注释
[0100] 对检出的变异进行注释，内容包括:功能、reads支持数、变异频率、氨基酸变异等， 得到的信息可根据疾病数据库进行相应调整;注释标记:根据变异情况判断疾病的来源，变 异数据解读。
[0101] 实施例四一例实验样本检测结果
[0102] 按照实施例1-3的方法对一例样本进行检测。
[0103] 1、检测结果
[0104] 测序数据统计结果见下表2:
[0105] 表2
[。1HA1
[0107]目标区域覆盖度见下表3:
[010引表3 L0110J 粒测结呆见h表4:
[0111] 表4
[0112]
[0113」本次基因检测检出的其他变异信恳见下表5:
[0114]表5
[0116]
[0117] 注释:rsID:短序列突变在数据库中的编号;FR. I: dbSNP数据库中收录的关于此 SNP的频率信息;Fr. 2:千人计划中全部测序样本中关于此SNP在亚裔人种中的频率信息； Fr. 3: ESP6500数据库中收录的关于此SNP的频率信息;Fr. 4:本地数据库中关于此SNP的频 率信息;Condel: Condel数据库预测结果。
[0118] 2、检测结果说明
[0119] 本次基因检测在与显性耳聋50型（Deafness ,autosomal dominance) ,DFNA50 ; 0MIM:613074)相关的MIR96基因检测到一个杂合已知致病突变n.l3G〉A。
[0120] Moreno-化Iayo等2009年研究西班牙DFNA50家系发现MIR96基因n.l3G〉A与DFNA50 表型共分离，功能试验表明该突变能调控其他耳聋相关基因表达。显性耳聋50型是显性遗 传病，杂合突变即可致病。因此，n.l3G〉A应是受检者相关病症的原因。
[0121] 上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范 围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术 方案所做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种试剂盒，其包含探针，所述探针固定在固相基质上或者所述探针游离于溶液中， 所述探针特异性识别目标区域，其中，所述目标区域包括： 表1所示163个基因中的至少之一;或表1中所述至少一种基因的⑶S区域;或表1中所述 至少一种基因的⑶S区域的上下游至少10-20bp的区域。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针为全人工合成或体外克隆合成， 所述探针的长度为20_120mer。3. 权利要求1或2的试剂盒，其特征在于，所述探针的制备包括如下步骤： 确定所述目标区域的参考序列； 从所述参考序列的一端开始，在所述参考序列上依次获取DNA片段直至所述参考序列 的另一端； 将所述DNA片段与所述参考序列比对，获得每一条DNA片段在参考序列上的比对次数， 过滤掉比对次数超过1的DNA片段； 去除掉GC含量不在30-80 %的DNA片段。4. 权利要求1-3任一项所述的试剂盒在获取遗传性耳聋相关基因序列中的用途。5. -种检测目标区域变异的方法，其特征在于，包括： (1) 获取待测样本中的核酸，所述核酸由多个初始DNA片段组成，所述初始DNA片段来自 断裂的基因组DNA和/或游离的DNA片段； (2) 将所述核酸打断成100_700bp范围的短序列DNA片段，所述短序列DNA片段具有平末 端； (3) 加碱基"A"至所述短序列DNA片段的3 '端，获得具有粘性末端A的DNA片段； (4) 连接接头于所述粘性末端片段的两端，获得接头连接片段； (5) 利用第一引物对所述接头连接片段进行第一扩增，获得第一扩增产物； (6) 利用权利要求1-3任一项所述的试剂盒对所述第一扩增产物进行捕获，获得所述目 标区域；以及， (7) 利用第二引物对所述目标区域进行第二扩增，获得第二扩增产物； (8) 将所述扩增产物进行测序，获得所述目标区域变异位点信息，变异包括SNP、InDel、 SV和CNV变异中的至少一种。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2)包括：将所述核酸打断成200-250bp范围的短序列DNA片段。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一引物序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示;所述第二引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(8)包括： (a) 对所述扩增产物进行测序，获得测序数据，所述测序数据由多个读段组成;其中，在 NextSeq CN500测序平台上进行所述测序； (b) 对所述测序数据进行过滤，所述过滤包括去除掉不确定碱基比例超过10%的读段 和/或碱基质量值不大于5的碱基数的比例不小于50%的读段； (c) 将所述测序数据与参考序列进行比对，获得比对结果，统计所述比对结果，对所述 比对结果进行过滤，所述过滤包括去除掉比对中错配碱基数多于3个读段，获得所述目标区 域中的SNP、InDel、SV和CNV变异中的至少之一;其中所述参考序列为HG19。9. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述样本来源于人或动物;所述目标区域 为遗传性耳聋相关基因区域。10. -种检测目标区域变异的系统，其特征在于，包括： 核酸获取装置，用于获取待测样本中的核酸，所述核酸由多个初始DNA片段组成，所述 初始DNA片段来自断裂的基因组DNA和/或游离的DNA片段； 打断装置，用于将所述核酸打断成100_700bp范围的短序列DNA片段，所述短序列DNA片 段具有平末端； 加碱基A装置，用于加碱基"A"至所述短序列DNA片段的3 '端，获得具有粘性末端A的DNA 片段； 接头连接装置，用于连接接头于所述粘性末端片段的两端，获得接头连接片段； 第一扩增装置，用于利用第一引物对所述接头连接片段进行第一扩增，获得第一扩增 产物； 捕获装置，用于利用权利要求1-3任一项所述的试剂盒对所述第一扩增产物进行捕获， 获得所述目标区域;以及， 第二扩增装置，用于利用第二引物对所述目标区域进行第二扩增，获得第二扩增产物； 测序装置，用于将所述扩增产物进行测序，获得所述目标区域变异位点信息，变异包括 SNP、InDe I、SV和CNV变异中的至少一种。
【文档编号】C12Q1/68GK105925663SQ201610192134
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年3月30日
【发明人】韩颖鑫, 张印新, 王佳伟, 高晓峘, 张春生, 李胜
【申请人】广州精科生物技术有限公司