一种检测hbb/gjb2/atp7b/pah遗传病基因的阳性质控品及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测HBB/GJB2/ATP7B/PAH遗传病基因的阳性质控品及其制备方法，设计合成一段包含HBB_CD41?42、GJB2_235delC、ATP7B_2333G＞T、PAH_728G＞A四种突变基因片段的DNA序列，将该序列插入质粒载体中并与野生型人类基因组DNA按拷贝数2∶1混合得到阳性质控品。该方法制备的阳性质控品可以作为遗传性疾病相关HBB/GJB2/ATP7B/PAH基因突变检测试剂盒的阳性内标质控物，能够准确监测在利用该检测试剂盒检测相关遗传病的整个实验过程，以此可作为评判实验是否成功的标准。
【专利说明】-种检测HBB/GJB2/ATP7B/PAH遗传病基因的阳性质控品及其 制备方法
[0001 ] 所属领域
[0002] 本发明设及分子生物学和医学检测领域，设及一种基于高通量测序平台的常见遗 传病一一地中海贫血、耳聋、苯丙酬尿症和肝豆状核变性病基因检测的阳性质控品及其制 备方法。
【背景技术】
[0003] 遗传性疾病，指因受精卵中的遗传物质(染色体，DNA)异常或生殖细胞所携带的遗 传信息异常所引起的子代的性状异常。遗传性疾病分为单基因遗传病和多基因遗传病，单 基因遗传病种类多，发病率高，不仅对患者的健康造成了严重危害，而且也给家庭和社会带 来了沉重的精神和经济负担。因此通过对早期初生儿或出生前胎儿的基因检测非常必要， W达到能够在医学上及早发现、及早干预、及早治疗的效果。
[0004] 常见的单基因遗传病有地中海贫血、耳聋、苯丙酬尿症和肝豆状核变性病等。
[0005] 地中海贫血(Thalassemia,简称"地贫是一组全球最常见、对人类健康影响最大 的单基因遗传病，也是世界卫生组织(WHO)推荐重点预防的遗传病，主要集中地中海沿岸国 家、东南亚、少数非洲地区和我国南方，保守估计全世界携带者近2亿人。临床上，Wa-地贫 和e-地贫最常见，其相关基因为HBA和皿B。
[0006] 遗传性耳聋是影响人类健康和致残的常见病，也是最常见的遗传性疾病，据统计， 新生儿中耳聋的发病率为1%。，其中大约一半的耳聋与遗传因素相关，影响它的基因主要有 GJB2、GJB3和化C26A4等。耳聋基因诊断结果对耳聋的预防、辅助诊断、康复治疗有很好的指 导意义。
[0007] 苯丙酬尿症（PKU ,Pheny Iketonuria)是由于肝脏苯丙氨酸径化酶（PAH， 化enyIalanine hy化oxyIase)缺乏所致的一种严重的遗传性氨基酸代谢障碍性疾病，为常 染色体隐性遗传病，其发病率为1/16500,携带者率为1/50~1/60。苯丙酬尿症是可治性的 遗传病之一，早期基因诊断可W尽早发现患者，应用饮食疗法可W减轻或者控制患者症状。 [000引肝豆状核变性化LD)，是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍疾病，在我国患病率约 为1/10万，人群杂合子携带率为1/4000,目前已明确主要与定位于13ql4.3的ATP7B基因突 变密切相关，该疾病可W通过早期诊断得到治疗。ATP7B基因突变可引起铜蓝蛋白合成障 碍、胆汁中铜排泄受阻，过量的铜不能排出体外而在体内沉积，导致肝硬化、神经症状、角膜 环、尿铜升高等临床表现，如能发现ATP7B基因突变类型，能够及早采取减少铜摄入和促进 铜排出的治疗，保证机体器官的正常功能。
[0009]在利用遗传性疾病相关皿B/GJB2/ATP7B/PAH基因突变检测试剂盒检测常见基因 突变的过程中，影响实验过程的因素较多，如实验人员测定操作中的随机误差、PCR扩增仪 溫度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增祀核酸的浓度及试剂问题等，运些因素 均可能会造成结果的偏差。因此，在检测时，需要有严格的质量控制措施，即需要有特定的 质控品。质控品须具备W下特点：（1)易制备；（2)在胆存和使用过程中稳定性好；（3)无生物 传染性；（4)能监控整个检测过程，结果可靠。
[0010] 传统的遗传病检测试剂盒阳性质控品的制备方法有两种：1、直接W突变阳性的单 一PCR产物重组质粒稀释到IO3COPiesAiL作为阳性质控品，运种方法制备的质控品只能覆 盖到包含特定突变位点的插入片段而基因组DNA其他区域却不能被覆盖;2、W两个或多个 突变阳性的PCR产物重组质粒按比例混合后稀释到IO3CopiesAiL作为阳性质控品，运种方 法虽可W模拟两个或多个突变位点的检测，但也无法覆盖到基因组DNA其他区域;上述两种 质控品均不能真实地模拟人类基因组DNA。而对于现代的一次能对几十万到几百万条DNA分 子进行序列测定的高通量测序技术，单一或几种PCR产物混合后制备的质控品的测序显然 是不合适的。
[0011] 基于此，本发明针对遗传性疾病相关皿B/GJB2/ATP7B/PAH基因突变检测试剂盒提 供了一种阳性质控品及其制备方法，用W对该试剂盒的整个实验过程进行质量控制，保证 该试剂盒的质量。
【发明内容】
[001^ 1、本发明制备了一种检测HBB/GJB2/ATP7B/PAH遗传病基因的阳性质控品，由突变 阳性质粒、野生型人类基因组DNA和NF-肥0组成；突变阳性质粒中包含插入了皿8_〔041 -42、 GJB2_235delC、ATP7B_2333G>T、PAH_728G>A四种突变基因片段的人工合成的DNA序列；且 突变阳性质粒与野生型人类基因组DNA按拷贝数W2:l混合。
[0013] 2、本发明设计并合成了一种包含 ATP7B_2333G>T、GJB2_235delCJBB_CD41-42、 PAH_728G>A四种突变基因片段的DNA序列(932bp)，片段序列为：
[0014] ATGGACGTGCTCATCGTCCTGGCCACAAGCATTGCTTATGTTTATTCTCTGGTCATCCTGGTGGTTGCTGTGGCTGA GAAGGCGGAGAGGAGCCCTGTGACATTCTTCGACACGCCCCCCATGCTCTTTGTGTTCATTGCCCTGGGCCl^ GTGGCTGGAACACTTGGCAAAGGTAACAGCAGCTTCAGGTTCAGAAAAGAGCTGCTCCTTCAGTAAACAAATCTCAC TTCCTCTGAACACCATGTTTAGAATTACTAATTATACATCTGGCTCACCGTCCTCTTCATTTTTCGCATTATGATCC TCGTTGTGGCTGCAAAGGAGGTGTGGGGAGATGAGCAGGCCGACTTTGTCTGCAACACCCTGCAGCCAGGCTGCAAG AACGTGTGCTACGATCACTACTTCCCCATCTCCCACATCCGGCTATGGGCC(delC) TGCAGCTGATCTTCGTGTCCACGCCAGCGCTCCTAGTGGCCATGCACGTGGCCTACCGGAGACATGAGAAGAAGAGG AAGTTCATCAAGGGGGAGTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTG GTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTT(delCTTT)GAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGC AACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCTAGTGCCTCTGACTCAGTGGTGATGAGCTTTGAGTTTTCTT tcttcttttcatcccagcttgcactggtttccgcctccAacctgtggctggcctgctttcctctcgggatttcttg GGTGGCCTGGCCTTCCGAGTCTTCCACTGCACACAGTACATCAGACATGGATCCAAGCCCATGTATACCCCCGAACC GTGAGTACTGTCCTCCAGCTACCAGTTGCCAGGCACAATGAGCGCCATC
[0015] 注:4段序列分别与W上4种突变对应，其中大号加粗的碱基为突变后的碱基，括号 中的为缺失前存在的碱基。
[0016] 3、本发明建立了一种检测皿B/GJB2/ATP7B/PAH遗传病基因的阳性质控品的制备 方法，包括W下主要步骤：
[0017] 1)提取2例野生型人类外周全血基因组DNA;
[0018] 2)突变阳性质粒的制备；
[0019] A: ATP7B_233 3G > T、G JB2_23 5de 1C、皿8_〔041 -42、PAH_7 28G > A 四种突变基因片段 的设计及人工合成阳性序列；
[0020] B:四种突变基因片段的扩增引物设计及合成；
[0021] C:构建重组质粒并转化合成宿主菌后，进行菌落PCR电泳验证；
[0022] D:提取阳性宿主菌内的突变阳性质粒；
[0023] 3)野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒的定量及混合；
[0024] A:构建4条QPCR标准曲线；
[0025] B:计算野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒的拷贝数；
[0026] C:分别将2例野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒按拷贝数W1:1、1: 2和1: 3S 个梯度混合制成6组待测阳性质控品；
[0027] 4)确定阳性质控品中野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒的最佳混合比例并验 证；
[0028] A:将步骤3)中获得的6组阳性质控品分别构建文库并定量；
[0029] B:模板制备和模板富集后上机测序；
[0030] C:测序结果分析并确定最佳混合比列；
[0031] D:阳性质控品重复性与稳定性的验证。
[0032] 4、本发明提供了一种携带上述人工合成DNA片段的突变阳性质粒。
[0033] 5、本发明提供了一种包含上述突变阳性质粒的阳性宿主菌种。
[0034] 6、本发明设计并合成了插入片段的4种突变基因片段的扩增引物，分别为：
[0035] PRl (皿B:CD41-42):
[0036] F:5 '-CTTCACCTTAGGGTTGCCCATAA-3 '
[0037] R:5 '-CTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCA-3 '
[0038] PR2(GJB2：235delC)：
[0039] F:5 '-TCTTCTTCTCATGTCTCCGGTAGG-3 '
[0040] R:5 '-CATTTTTCGCATTATGATCCTCGTTGT-3 '
[0041] PR3(ATP7B：2333G>T)：
[0042] F:5，-CATGGTGTTCAGAGGAAGTGAGA-3，
[0043] R:5 '-GGCCACAAGCATTGCTTATGTT-3 '
[0044] PR4(PAH：728G>A)：
[0045] F:5，-CATGGTGTTCAGAGGAAGTGAGA-3，
[0046] R:5 '-GGCCACAAGCATTGCTTATGTT-3 '。
[0047] 本发明提供的阳性质控品包含了4种突变位点，可W更准确，更有特异性地进行质 量控制;采用突变阳性质粒与野生型人全基因组DNA混合的方式构建质控品，不仅能实现方 便获取，易于制备，易于保存的要求，也更加符合人类全基因组DNA检测的模型。
【附图说明】
[004引图1显示突变阳性质粒的插入片段；
[0049]图2显示突变阳性质粒宿主菌的PCR电泳验证结果；
[0050]图3显示突变阳性质粒一代测序结果；
[0051 ]图4显示巧光定量PCR标准曲线STl;
[0052]图5显示巧光定量PCR标准曲线ST2;
[0化3] 图6显示巧光定量PCR标准曲线ST3;
[0054] 图7显示巧光定量PCR标准曲线ST4。
【具体实施方式】
[0055] W下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明。实施例中所用的技术手段若 未特殊指明，均为常规方法。实施例中设及到的试剂与耗材若无特殊说明均可从商业途径 获取。W下实施例中的巧光定量PCR实验，均设置两次重复试验，结果取平均值。
[0056] 实施例1:阳性质控品制备方法的建立
[0化7] ( -)2例野生型人类基因组DNA(Wild type Human Genome DNA，W服D)的获得：
[0化引 W野生型人类基因组外周全血样本A，样本B，按照QIAamp DNA Blood Mini Kit试 剂盒(QIAGEN ,69504)操作说明书提取W服D。
[0059] (二)突变阳性质粒的获得：
[0060] 1)插入片段设计及合成：
[0061 ]利用生物信息相关技术设计插入片段序列为：
[0062] ATGGACGTGCTCATCGTCCTGGCCACAAGCATTGCTTATGTTTATTCTCTGGTCATCCTGGTGGTTGCTGTGGCTGA GAAGGCGGAGAGGAGCCCTGTGACATTCTTCGACACGCCCCCCATGCTCTTTGTGTTCATTGCCCTGGGCCr GTGGCTGGAACACTTGGCAAAGGTAACAGCAGCTTCAGGTTCAGAAAAGAGCTGCTCCTTCAGTAAACAAATCTCAC TTCCTCTGAACACCATGTTTAGAATTACTAATTATACATCTGGCTCACCGTCCTCTTCATTTTTCGCATTATGATCC TCGTTGTGGCTGCAAAGGAGGTGTGGGGAGATGAGCAGGCCGACTTTGTCTGCAACACCCTGCAGCCAGGCTGCAAG AACGTGTGCTACGATCACTACTTCCCCATCTCCCACATCCGGCTATGGGCCt^ dCi TGCAGCTGATCTTCGTGTCCACGCCAGCGCTCCTAGTGGCCATGCACGTGGCCTACCGGAGACATGAGAAGAAGAGG AAGTTCATCAAGGGGGAGTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTG GTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTirrfe/CTT巧 GAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGC AACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCTAGTGCCTCTGACTCAGTGGTGATGAGCTTTGAGTTTTCTT TCTTCTTTTCATCCCAGCTTGCACTGGTTTCCGCCTCCAACCTGTGGCTGGCCTGCTTTCCTCTCGGGATTTCTTGG GTGGCCTGGCCTTCCGAGTCTTCCACTGCACACAGTACATCAGACATGGATCCAAGCCCATGTATACCCCCGAACCG TGAGTACTGTCCTCCAGCTACCAGTTGCCAGGCACAATGAGCGCCATC
[0063] 序列包含了 ATP7B_2333G>T、GJB2_235delC、皿B_CD41-42、PAH_728G>A四种突 变，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0064] 2)引物设计及合成：
[0(?日]利用Primer Premier 5.0软件设计待用的引物对为：
[0066] PRl (皿B:CD41-42):
[0067] F:5 '-CTTCACCTTAGGGTTGCCCATAA-3 '
[006引 R:5 '-CTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCA-3 '
[0069] PR2(GJB2：235delC)：
[0070] F:5 '-TCTTCTTCTCATGTCTCCGGTAGG-3 '
[0071 ] R:5 '-CATTTTTCGCATTATGATCCTCGTTGT-3 '
[0072] PR3(ATP7B：2333G>T)：
[0073] F:5 '-CATGGTGTTCAGAGGAAGTGAGA-3 '
[0074] R:5 '-GGCCACAAGCATTGCTTATGTT-3 '
[0075] PR4(PAH：728G>A)：
[0076] F:5 '-CATGGTGTTCAGAGGAAGTGAGA-3 '
[0077] R:5 '-GGCCACAAGCATTGCTTATGTT-3 '
[007引注：PRl引物对扩增HBB_CD41-42突变位点的DNA片段；PR2引物对扩增GJB2_ 235delC突变位点的DNA片段;PR3引物对扩增ATP7B_2333G>T突变位点的DNA片段;PR4引物 对扩增PAH_728G> A突变位点的DNA片段。W上引物由生工生物工程化海)股份有限公司合 成。
[00巧]3)构建重组质粒：
[0080] 按照pMD19-T?Vector Cloning KiUhkara,6013)操作说明书将步骤 1)所得的 基因片段与pMD19-T?Vector进行连接反应。
[0081] 4)获得突变阳性宿主菌：
[0082] 按照E.COli JM109 Compelent cells^akaratgOSS)使用说明书将步骤3)获得的 重组质粒转入E.COli JM109 Compelent cells,培养过夜后涂平板培养得到单克隆菌株， 单克隆菌扩大培养后分别利用引物对PRl，PR2，PR3，PR4进行菌落PCR电泳验证，结果如图2 所示。将电泳验证阳性的菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司一代测序如图3所示，确 定阳性宿主菌并使用30%甘油保保菌株，存放于-80°C。
[0083] 5)获得突变阳性质粒(Mu1:ate Positive Plasmid,MP):
[0084] 将步骤4)得到的阳性宿主菌扩大培养，按照Plasmid Mini Kit(0mega，6950)操作 说明书提取阳性宿主菌内的突变阳性质粒，用紫外分光光度仪测出质粒浓度。
[00化](S)阳性质控品（PositiveControl，PC)的制备
[0086] 1)巧光定量PCR体系及条件：
[0087] 将MP稀释成106, IO5，104,103, IO2(CopiesAiL)共5个梯度与2例WHGD进行巧光定量 PCR检测，分别WPRl，PR2，PR3，PR4作为巧光定量PCR扩增的引物，做两个复孔，共进行56个 PCR反应，反应体系如下：
[008引
[0089]
[0090]
[0091 ] 2)构建标准曲线（s1:andard，ST):
[0092] Wlg(质粒DNA浓度Co)为横坐标X，测得各CT值为纵坐标Y进行标准曲线的建立，根 据引物对分别建立4条标准曲线：STl(图4所示），ST2(图5所示），ST3(图6所示），ST4(图7所 示)。
[0093] 3)构建标准曲线公式：
[0094] 步骤2)构建4条标准曲线的公式分别为：
[0095] STl:Y = -3.2放+34.387(r2 = 0.999)
[0096] ST2:Y = -3.307巧4.224(r2=1)
[0097] ST3:Y = -3.4 放+34.733(r2=1)
[009引 ST4:Y = -3.465W5.014(r2 = 0.999)。
[0099] 4)WHGD 的浓度：
[0100] 将WHGD进行巧光定量PCR检测得到的CT值按照3)中标准曲线公式计算得到样本A 的4个最终浓度分别为4.90 X 1〇4、5.12 X 1〇4、7.28 X 1〇4、6.77 X l〇4(copiesAiL)，求平均值 为6.02 X IO4(CopiesAiL)，变异系数为1.97%，样本B的4个最终浓度分别为1.75 X 105、1.33 X 1〇5、1.85 X 1〇5、1.18 X l〇5(copiesAiL)，求平均值为 1.52 X l〇5(copiesAiL)，变异系数为 2.12%。
[0101] 5)确定混样体积：
[0102] 将IO5CopiesAiL浓度的MP与2例WHGD按拷贝数1:1，2:1，3:1的比例分别混合成阳 性质控品，编号分别为A-I，A-2，A-3，B-1，B-2，B-3如下表：
[0103]
[0104] 实施例2:阳性质控品的的验证 [010引（一)文库构建：
[0106]按照遗传性疾病相关皿B/GJB2/ATP7B/PAH基因突变检测试剂盒，对实施例1制备 的6例阳性质控品进行文库构建，构建好的文库经定量用于测序。
[0107] 仁化机测序：
[010引 按照Ion PGM HiQ 0T2 Reagents 200(Life Technologies,A26428)和Ion PGM HiQ 0T2 Solutions 200(Life Technologies,A26429)的试剂盒操作说明书进行模板制备 和模板富集。
[0109] 按照Ion PGM HiQ Sequencing 200 ReagentslXife Technologies,A26431)、Ion PGM HiQ Sequencing 200 Solutions(Life Technologies,A26430)和Ion PGM Sequencing Nucleotides(Life Technologies,A26432)的试剂盒操作说明书进行上机测 序。
[0110] (S)结果：
[0111] 利用生物信息相关技术进行数据分析，PC-A与PC-B测序结果如下表所示：
[0112]
[0113]
[0114] 上表6个质控品的4个突变位点对应的测序深度值均>20,突变频率在20 %~ 80%，其中A-2与B-2(突变阳性质粒与野生型人类基因组DNA按拷贝数2:1的比例混合得到 的阳性质控品）的突变频率更接近50%，符合杂合突变型的人基因组DNA测序结果，最终确 定WMP与WHGD按拷贝数2:1的比例制备阳性质控品。
[0115] 实施例3:重复性试验验证
[0116] ( - )阳性质控品制备方法的重复性验证
[0117] 1、实验：
[011引选取5例野生型人类外周全血样本提取基因组DNA，与突变阳性序列按照实施例1 和实施例2步骤操作，获得5例阳性质控品，分别为PC-I，PC-2，PC-3，PC-4，PC-5，按照实施例 2操作步骤对运5例阳性质控品进行实验验证。
[0119] 2、结果：
[0120] 利用生物信息相关技术进行数据分析，PC-1/2/3/4/5测序结果如下表所示：
[0121]
[0122]上表5个质控品的4个突变位点对应的测序深度值均>20,突变频率在40 %~ 65%，对其进行突变频率的变异系数分析显示?(：-1、？(：-2、？(：-3、？(：-4、？(：-5的四种突变类型 的突变频率变异系数值不大于5%，说明该阳性质控品制备方法较稳定。
[0123] (二）阳性质控品的重复性验证
[0124] 1、实验：
[0125] 选取步骤(一)制备的阳性质控品PC-I和PC-2按照实施例2进行重复5次验证实验。
[0126] 2、结果：
[0127] 利用生物信息相关技术进行数据分析，PC-1/2重复5次验证结果如下表所示：
[012 引
[0129] 5次上机测序突变位点对应的测序深度值均>20，突变频率在40%~65%，对其进 行突变频率的变异系数分析显示PC-UPC-2的四种突变类型的突变频率变异系数值均小于 5%，说明该阳性质控品较稳定。
[0130] 实施例4:阳性质控品在遗传性疾病相关皿B/GJB2/ATP7B/PAH基因突变检测试剂 盒检测四种遗传病过程中的应用实例
[0131] ( - )操作方法：
[0132] 将制备好的阳性质控品PC和阴性质控品NC(野生型人类基因组DNA)与已知突变类 型的待测样本Sl-S22(样本信息如下表"突变类型"列所示），按照实施例2进行实验操作。
[0133] (二)结果
[0134] 利用生物信息相关技术进行数据分析，PC/NC/S1-S22测序结果如下表所示：
[0135]
[0136] 注：突变阳性样本和阳性质控品PC的测序深度值为该突变位点的测序深度值，其 余=个位点测序深度值>20,野生型样本和阴性质控品的四个位点测序深度值均>20, W "-"表示。
[0137] 根据结果表可知，阳性质控品PC的测序结果为HBB_CD41-42、GJB2_235delC、 ATP7B_2333G>T、PAH_728G>A杂合突变类型，阴性质控品为野生型；22个待测样本的测序 结果显示3个野生型样本，2个纯合突变类型，17个杂合突变类型样本与原型别相同，说明该 方法制备的阳性质控品可W作为地中海贫血、耳聋、苯丙酬尿症、肝豆核变性病基因突变检 测的质控物。
【主权项】
1. 一种检测HBB/GJB2/ATP7B/PAH遗传病基因的阳性质控品，其特征在于，阳性质控品 由一种突变阳性质粒、野生型人类基因组DNA和NF-H20组成;所述的突变阳性质粒包含插入 了冊8_0)41-42、6邛2_235(161(：、厶了?78_23336>1'、？厶!1_7286>4四种突变基因片段的人工合 成的DNA序列。2. 根据权利要求1所述的阳性质控品，其特征还在于突变阳性质粒与野生型人类基因 组DNA按拷贝数2:1混合。3. 根据权利要求1所述的阳性质控品，其特征还在于所述"人工合成的DNA序列"为 932bp的DNA序列，如下： ATGGACGTGCTCATCGTCCTGGCCACAAGCATTGCTTATGTTTATTCTCTGGTCATCCTGGTGGTTGCTGTGG CTGAGAAGGCGGAGAGGAGCCCTGTGACATTCTTCGACACGCCCCCCATGCTCTTTGTGTTCATTGCCCTGGGCCTG TGGCTGGAACACTTGGCAAAGGTAACAGCAGCTTCAGGTTCAGAAAAGAGCTGCTCCTTCAGTAAACAAATCTCACT TCCTCTGAACACCATGTTTAGAATTACTAATTATACATCTGGCTCACCGTCCTCTTCATTTTTCGCATTATGATCCT CGTTGTGGCTGCAAAGGAGGTGTGGGGAGATGAGCAGGCCGACTTTGTCTGCAACACCCTGCAGCCAGGCTGCAAGA ACGTGTGCTACGATCACTACTTCCCCATCTCCCACATCCGGCTATGGGCCTGCAGCTGATCTTCGTGTCCACGCCAG CGCTCCTAGTGGCCATGCACGTGGCCTACCGGAGACATGAGAAGAAGAGGAAGTTCATCAAGGGGGAGTTCTGATAG GCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTG AGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTC TAGTGCCTCTGACTCAGTGGTGATGAGCTTTGAGTTTTCTTTCTTCTTTTCATCCCAGCTTGCACTGGTTTCCGCCT CCAACCTGTGGCTGGCCTGCTTTCCTCTCGGGATTTCTTGGGTGGCCTGGCCTTCCGAGTCTTCCACTGCACACAGT ACATCAGACATGGATCCAAGCCCATGTATACCCCCGAACCGTGAGTACTGTCCTCCAGCTACCAGTTGCCAGGCACA ATGAGCGCCATCo4. 根据权利要求1所述的阳性质控品，其特征还在于制备方法包括以下主要步骤： 1) 提取2例野生型人类外周全血基因组DNA; 2) 突变阳性质粒的制备； △:八了？78_23336>1\6邛2_235(161(：、冊8_0)41-42、？厶!1_7286>4四种突变基因片段的设 计及人工合成阳性序列； B:四种突变基因片段的扩增引物设计及合成； C:构建重组质粒并转化合成宿主菌后，进行菌落PCR电泳验证； D:提取阳性宿主菌内的突变阳性质粒； 3) 野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒的定量及混合； A:构建4条QPCR标准曲线； B:计算野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒的拷贝数； C:分别将2例野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒按拷贝数以1: 1、1: 2和1:3三个梯 度混合制成6组待测阳性质控品； 4) 确定阳性质控品中野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒的最佳混合比例并验证； A:将步骤3)中获得的6组阳性质控品分别构建文库并定量； B:模板制备和模板富集后上机测序； C:测序结果分析并确定最佳混合比列； D:阳性质控品重复性与稳定性的验证。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征还在于步骤2)中所述的四种突变基因片段 的扩增引物对分别为： HBB:CD41-42: F:5 '-CTTCACCTTAGGGTTGCCCATAA-3 ' R:5 '-CTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCA-3 ' GJB2：235delC： F:5 '-TCTTCTTCTCATGTCTCCGGTAGG-3 ' R:5 '-CATTTTTCGCATTATGATCCTCGTTGT-3 ' ATP7B：2333G>T： F:5 '-CATGGTGTTCAGAGGAAGTGAGA-3 ' R:5 '-GGCCACAAGCATTGCTTATGTT-3 ' PAH：728G>A： F:5 '-CATGGTGTTCAGAGGAAGTGAGA-3 ' R:5 '-GGCCACAAGCATTGCTTATGTT-3 '。
【文档编号】C12Q1/68GK105925672SQ201610250730
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月16日
【发明人】李明, 杨学习, 吴英松, 高旭年, 李尔华, 杨旭, 王小丽
【申请人】广州市达瑞生物技术股份有限公司, 广州邦德盛生物科技有限公司