一种水稻褐变穗病菌的pcr检测引物组及其检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种水稻褐变穗病菌的PCR检测引物组及其检测方法。根据水稻褐变穗病菌的DNA设计了一对PCR特异性扩增引物：上游引物HBS?F，序列如序列表SEQ ID No.1所示；下游引物HBS?R，序列如序列表SEQ ID No.2所示。经过PCR扩增可在褐变穗病菌纯DNA及带菌的植株中特异性地扩增出长度为170bp的基因产物。本发明的特异性检测引物及其用法可被用于水稻生产中水稻褐变穗病菌感染的植株的快速检测，同时可用于田间水稻褐变穗病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为由Alternaria alternate引起的水稻褐变穗病的防治提供可靠的技术和理论依据。
【专利说明】
-种水稻褐变穗病菌的PCR检测引物组及其检测方法
技术领域
[0001 ] 本发明设及一种水稻褐变穗病菌(Alternaria alte;rnate)PCR检测引物组及其检 测方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是中国重要的粮食作物之一，中国有60 % W上人口 W稻米为主食，水稻每年 播种面积3000万公顷，约占全国耕地面积的25% W上，产量1.85亿吨，约占世界的1/3。因 此，中国是世界上最大的稻米生产国和消费国。随着我国人口的增加，农业用地减少、经济 快速发展、环境破坏W及粮食安全等问题日益凸显，水稻的高产稳产意义更为重要。
[0003] 水稻褐变穗病是一种真菌性病害。20世纪80年代，该病在日本北海道发生，尤其在 偏东风地带发生较多。在国内，水稻褐变穗病在2005年第一次被报道，主要发生在黑龙江各 水稻主产区。水稻感染该病后其结实率降低，受害的稻粒多数变成褐色，有的谷粒空痕，黑 米率提高。该病害不仅影响水稻的产量，而且严重影响着水稻谷粒的品质，一般减产5%左 右，严重的减产10%甚至达到20%。近年来该病在黑龙江省水稻主产区的部分品种上严重 发生，发生面积不断扩大，病田率及病株率不断增大，日趋严重，已经成为黑龙江省水稻主 要病害之一。穆娟微等对黑龙江省具有代表性的18个农场进行了病害调查，均有水稻褐变 穗病害发生。范玉宝等对影响黑龙江省八五八农场水稻产量和品质的主要病害进行调查， 结果表明主要病害是稻攝病和褐变穗，特别是水稻褐变穗的发生越来越严重，有重发生的 趋势。该病害田间发病主要集中在7月中下旬到8月上旬，水稻出穗后不久，遇强风易发生， 谷粒颖壳上出现褐色斑点或变褐，病斑不规则形，整个穗部呈现褐变症状，称之为"褐变 穗"，但水稻叶銷几乎不发生褐变。发病严重时病斑变浓褐或黑褐色，进而形成空痕粒，远看 稻田一片黑。与水稻粒攝病症状相似。20世纪末，日本北海道中央农试场研究表明，从处于 发病初期的颖壳上可W高频率地分离出链格抱(Altemaria altemata)，从而证明褐变穗的 主要病原菌为链格抱(Alternata altemata)。在国内，对水稻褐变穗病原菌的报道少之又 少。乔金玲等指出水稻褐变穗的病原菌主要是链格抱(Alternaria alternata)。穆娟微等 从佳木斯的水稻植株的50个病穗上分离培养，共获得27个分离物，根据培养性状和形态特 征，参照Ainswo;rth分类系统鉴定优势种为链格抱(Alternaria alternata)。
[0004] 由于水稻褐变穗病是近年来水稻生产中发生的新病害，目前国内对其防治的研究 报道很少。又由于其发病症状与水稻稻攝病的相似，且发病时期均为水稻穗期，所W很容易 当成水稻稻攝病来防治。使得防治效果不佳，进而耽误防治时机，造成产量损失较大。水稻 褐变穗病害的正确识别鉴定是防治的基础。传统的鉴定方法主要通过形态学，如菌丝及抱 子的形态来鉴定，但形态学鉴定方法繁琐，该病菌按常规方法分离过程中，病菌生长缓慢， 易污染，给病害的准确诊断造成很大的困难。形态特征为基础的常规病害诊断技术，由于其 耗时长，效率和灵敏度均较低，难W满足对水稻褐变穗病诊断的需要，很容易错过病害防治 最佳时期。随着分子生物学技术的迅速发展，分子标记已成为鉴定链格抱菌的主要手段，与 常规的形态鉴定法相比，分子标记能准确、快速地出不同病菌类型，为准确快速分析病菌的 群体分布、特点和鉴定诊断提供新的方法。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中水稻褐变穗病菌的生物学检测方法所需周期时间长、目前没有水 稻褐变穗病菌分子检测方法的现状，本发明的目的在于提供一种水稻褐变穗PCR检测引物 组及其检测方法，用于带菌的植株高灵敏度快速分子检测。
[0006] 本发明的目的通过如下技术手段实现:一种水稻褐变穗病菌的PCR检测引物组，上 游引物皿S-F，序列如序列表SEQ ID No. 1所示;下游引物皿S-R，序列如序列表SEQ ID No.2 所示。
[0007] 本发明还具有如下技术特征：
[0008] 1、如上所述的一种水稻褐变穗病菌PCR检测引物组，对水稻褐变穗病菌特异性扩 增出17化P的产物。
[0009] 2、如上所述的一种水稻褐变穗病菌PCR检测引物组，在水稻褐变穗病菌监测及诊 断鉴定方面的应用。
[0010] 3、如上所述的一种水稻褐变穗病菌的PCR检测引物组，其PCR检测方法的检测体系 如下所示：混合液在94°C预变性85s;95°C变性35s，65°C退火55s，72°C延伸45s，共35个循 环;72 °C延伸IOmin，扩增产物4 °C保存。
[0011] 4、如上所述的一种水稻褐变穗病菌的PCR检测引物组的PCR检测方法，所述的混合 液的成分如下所示：
[0012]
[0013] 本方法检验结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，可用于带菌的植株高灵敏 度快速分子检测。同时，对于水稻褐变穗病菌引起病害显症之前的早期监测、确定病害的防 治最佳时期具有重要的作用，为防治策略的制定提供了科学依据。
【附图说明】
[0014] 图1为各菌株基因组DNA电泳图谱；
[0015] 其中，M:DNA Maker 2000;1:水稻褐变穗病菌菌株A98(A.Alternata);2:水稻褐变 穗病菌菌株A21(A.Alte;rnata) ;3:水稻褐变穗病菌菌株A47(A.Alternata) ;4:水稻恶苗病 菌(F.moniliforme) ;5:水稻稻曲病菌化.virens) ;6:水稻稻攝病菌(M.oryzae) ;7:水稻立 枯病菌(F. O巧sporium) ;8:水稻纹枯病菌(R. solani) ;9:马铃馨早疫病菌A. solani ; 10:白 菜黑斑病菌A.brassicae; 11:向日葵黑斑病菌A.helianth; 12:胡萝h黑斑病菌(A.Dauci); 13:黄瓜黑斑病菌(4.州州11161'；[]1日）；14:大葱紫斑病菌(4.?〇1'1'；〇。
[0016]图2为PCR检测水稻褐变穗病菌的特异性试验；
[0017] 其中，M:DNA Maker 2000;泳道1~14:同图1图注；泳道15:无菌水。
[001引图3为DNA水平上PCR检测的灵敏性；
[0019] 其中，M:DNA Maker 2000;1 ~7:模板DNA浓度分别为l〇-3ngAiL、l〇-2ngAiL、l〇-ing/ 化、1. Ong/uL、1 Ong/uL、102ng/化、103ng/化;泳道 8:无菌水。
[0020] 图4为不同接种时间发病组织中PCR检测的灵敏性；
[0021] 其中，M:DNA Maker 2000;1 ~5:接种24h、4她、72h、96h、120h的水稻发病穗粒；6: 无菌水。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] 供试菌株的培养
[0024] 将4°C下保存的水稻褐变穗菌株和表1中其他菌株进行活化，转入PDA培养基中，25 °C恒溫箱培养7d后，用玻璃片刮取菌丝，放入锡纸中，然后放入超低溫冰箱中保存备用。
[00剧表1供试菌株 [00。" 123456 实施例2
2
[002引菌株DNA的提取 3 采用CTAB法提取各供试菌株的DNA，具体步骤如下： 4 1、将IOOmg供试菌丝在液氮中研磨，然后装入1.5mL离屯、管中。 5 2、加入65°C预热的2 X CTAB提取缓冲液70化L，颠倒混匀充分后，放入65°C恒溫水 浴锅中，保溫60min，每IOmin上下颠倒混匀一次。 6 3、在通风楓中加入等体积(约70化L)的氯仿/异戊醇(24:1 )，室溫下1200化/m离屯、 15min0
[0033] 4、将上清液转入新的1.5mL的离屯、管中，加入等体积（约700iiL)的氯仿/异戊醇 (24:1)，颠倒混匀，室溫12000r/m离屯、1 Omin。
[0034] 5、取上清液，重复4操作1次。
[0035] 6、取上清液，转入新的1.5mL离屯、管中，加入等体积(约70化L)异丙醇沉淀缓冲液， 混匀，-20°C下放置30min，观察沉淀生成，可延长放置时间，使沉淀增加。
[0036] 7、1200化/m离屯、IOmin，去上清液，用70%乙醇洗3次，将沉淀吹干。每管加25化 TE,室溫下溶解。
[0037] 8、保存的DNA溶液用超纯水稀释一定倍数，利用紫外分光光度法将测定其OD260和 0D28日纯度，检测DNA的浓度。
[003引9、将提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为化L，结果如图1所示。 所提取的各供试菌株基因组DNA电泳条带显示出各条带清晰，无拖尾现象，说获得的DNA纯 度较高。可用于后续研究。
[0039] 10、将基因组DNA样本于-20 r保存备用。
[0040] 实施例3
[0041 ]检测水稻褐变穗病菌特异性引物设计
[0042] 在GenBank中下载表1中各菌株序列，利用BioEdit软件进行多序列比对，找出 A.曰1 tena化的差异基因，再用Primer3v. 0.4.0软件设计一对检测水稻褐变穗病菌的特异性 引物皿S-F和皿S-R。其序列如下：
[0043] 皿S-F:5'-CTTTGAACGCACATTGCG-3 '
[0044] 皿S-R:5'-CGACTTGTGCTGCGCTCC-3 '
[0045] 实施例4
[0046] PCR检测水稻褐变穗病菌特异性试验
[0047] 利用实施例3设计的特异性引物对各供试菌株基因组DNA进行PCR扩增。W检测引 物的特异性。
[004引将混合液在94°C预变性85s;95°C变性35s，65°C退火55s，72°C延伸45s，35个循环； 72 °C终延伸IOmin，扩增产物4 °C保存。
[0049] H术泡合漏化累如下所元，
[(K)加]
[0化1 ]
[0052]将PCR扩增产物于1%的琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为化L。结果如图2所示，对只 有水稻褐变穗病菌A.alternata(l~3)扩增出了长度为17化P的单一条带;而其他供试菌株 及阴性对照(无菌水)均未扩增出目的条带(4~15)。运表明本研究所设计的引物对水稻褐 变穗病菌具有特异性，可用于水稻褐变穗病菌的检测。
[0化3] 实施例5
[0054] PCR检测水稻褐变穗病菌灵敏度试验
[0055] 1、对水稻褐变穗病菌DNA的灵敏度检测
[0056] 先用紫外分光光度计测定试验所用菌株的DNA浓度，将水稻褐变穗病菌DNA从 IO3IigAiL依次稀释至l(T3ngAiL，利用上述PCR反应体系、反应程序，确定反应的灵敏度。结果 如图3所示。本发明设计的特异性引物只有在DNA浓度为l.OngAiUlOng/化、IO2IigAiU 103ng/iiL(4 ~7)时，扩增出一条 170bp 的条带，在 DNA 浓度为 l〇-3ngAiL、l〇-2ngAiL、l〇-ingAiL (1~3)和阴性对照(8)中，均未扩增出目的条带。说明该PCR反应的最小检测浓度为1 .^gAi L。
[0057] 2、PCR检测水稻病粒的灵敏度检测
[005引采用离体接种法，剪取生育期一致的健康水稻穗，无菌水冲洗3次，放入铺有湿润 的无菌滤纸的大培养皿中，配制浓度为1 X IO6个/mL的水稻褐变穗病菌抱子悬浮液均匀喷 在穗上，用无菌的湿棉球保湿，放入28 °C恒溫箱中培养。在培养时间为24h、48h、72h、96h、 12化时进行取样，每次取样本质量约为Ig，用锡纸包裹，放入超低溫冰箱中保存备用。水稻 样本基因组DNA的提取采用CTAB法。利用上述PCR反应体系和反应程序，分别对接种24h、 4她、72h、96h、120h的水稻样本DNA进行PCR扩增，确定反应灵敏度。
[0化9] 如图4所示，当接种时间为4她、72h、96h、12化的水稻褐变穗的发病组织中扩增出 170bp的条带(2~5)。随着接种时间的增加，扩增出的条带越亮，病组织中的菌含量越多。在 病原菌接种水稻穗粒4她时，并无明显发病症状时，便可检测到水稻褐变穗病原菌。因此，此 特异性引物可W用来鉴定水稻植株是否感染水稻褐变穗病菌。
【主权项】
1. 一种水稻褐变穗病菌的PCR检测引物组，其特征在于，上游引物HBS-F，序列如序列表 SEQIDNo.l所示；下游引物HBS-R，序列如序列表SEQIDNo.2所示。2. 根据权利要求1所述的一种水稻褐变穗病菌的PCR检测引物组，其特征在于，对水稻 褐变穗病菌特异性扩增出170bp的产物。3. 根据权利要求3所述的一种水稻褐变穗病菌的PCR检测引物组，在水稻褐变穗病菌监 测及诊断鉴定方面的应用。4. 根据权利要求1所述的一种水稻褐变穗病菌的PCR检测引物组，其特征在于，PCR检测 方法的检测体系如下所示:混合液在94°C预变性85s; 95°C变性35s，65°C退火55s，72°C延伸 45s，共35个循环;72°C延伸lOmin，扩增产物4°C保存。5. 根据权利要求4所述的一种水稻褐变穗病菌的PCR检测引物组的PCR检测方法，其特 征在于，所述的混合液的成分如下所示： 浓度为〗OOng/pL的DNA模板 ：2.:0 WL: 含有浓度为 15 mM 的 MgCl2 的 lOxPOUmffei· 2.5 mL 浓度为1〇μΜ的上游引物HBS-F 0.5 μL 浓度为ΙΟμΜ的下游引物HBS-R 0.5μL 浓度为 2,5 mM 的 dNTPs 0.2^L 浓度为lU/pL的Taq酶 Ι.ΟμΙ ddH：0 补个.25μΙ^β
【文档编号】C12Q1/68GK105925682SQ201610308116
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】张俊华, 潘春清, 陈宇飞, 杨明秀, 韩雨桐
【申请人】东北农业大学