一种绵羊ucp1等位基因型的检测方法及其检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种绵羊UCP1等位基因型的检测试剂盒，包括特异性引物对和绵羊UCP1等位基因标准DNA；特异性引物对为：上游引物：5’?AGATACAAGCGGAAGAGACAC?3’；下游引物：5’?TGAAGGGTTGGGTCTGTCA?3’；绵羊UCP1等位基因标准DNA为序列表中SEQ ID No.1?3。本发明还提供一种绵羊UCP1等位基因型的检测方法。本发明的检测方法对绵羊UCP1不同等位基因型与绵羊胴体脂肪含量性状进行关联分析，研究表明绵羊UCP1等位基因型对绵羊群体的胴体脂肪含量性状具有显著影响（P<0.05）。因此，绵羊UCP1基因能够作为提高绵羊胴体脂肪含量性状的分子标记。
【专利说明】
-种绵羊UCP1等位基因型的检测方法及其检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及基因等位基因的检测与鉴定，具体设及一种绵羊UCPl等位基因型的检 测方法及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 我国是养羊大国，羊饲养量位居世界首位，随着近年来世界养羊格局的变化，肉羊 生产逐渐成为主流，但是国内肉羊群体产肉效率较低，其生产远不能满足国内消费对高质 量羊肉产品的需求。加速改良绵羊肉用性状，提高羊肉产品质量，已成为绵羊选育工作中亟 待解决的问题。脂肪含量是影响肉嫩度的关键因素之一。肉的脂肪特征包括禍体脂肪含量、 背腰厚度、板油率、花油率、IMF和肌间脂肪。禍体脂肪含量是研究脂肪对肉嫩度影响的主要 表型指标。
[0003] 禍体肉质性状与很多经济性状或生产性状相关联，例如增加肉的嫩度需要选择禍 体含脂肪量高的个体，但禍体的脂肪量增加意味着瘦肉率的下降和饲料转化率降低，因为 和机体沉积蛋白相比，沉积相同重量的脂肪需要更多的能量，并且在能量转化为脂肪的过 程中能量利用率低于转化为蛋白质的利用率。W传统的表型选择提高肉质将是一个漫长复 杂的过程。另一方面，和欧美国家相比，我国优质肉用绵羊的培育起步晚，相对落后，如何有 效利用我国现有的优良绵羊种质资源，提高绵羊的肉质性状是一个紧迫的问题。解决运些 问题的关键是在保存现有优良绵羊遗传资源的同时，寻求一种相对快速有效的育种手段提 高绵羊肉质性状。利用和进行分子标记辅助育种是比较实际和可行的技术方法。
[0004]羊肉禍体脂肪含量性状作为复杂的数量性状(quantitative化ait,QT)，其变异 由多基因控制，受遗传和环境的共同影响。此外，大部分数量性状表型变异，除了受微效多 基因控制外，还受一个或多个能对其产生较大效应的主效基因 (major gene)的影响。通过 传统的表型选择提高肉质性状可能是漫长而低效的选种选育过程，随着现代生物技术的发 展W及分子育种理论的不断丰富使我们直接利用分子标记辅助选育成为可能。因此，寻找 和研究运些主效基因，是提高绵羊肉用性能的有效途径之一。
[0005] 解偶联蛋白 Uuncoupling protein 1，UCP1)是褐色脂肪组织（brown adipose tissue,BAT)存在的标志基因。褐色脂肪细胞中含有大量的线粒体，UCPl蛋白大量存在于线 粒体内膜上。通过质子漏的作用，UCPl蛋白消耗一部分氧化憐酸化过程中产生的质子浓度 梯度，使=憐酸腺巧的合成量降低，能量转而W热的形式被释放。因此，作为一种天然耗能 型脂肪，褐色脂肪对于维持体溫和能量平衡起重要作用。
[0006] UCPl基因与脂肪代谢、能量平衡有着密切的联系。初生黑羊脂肪组织中UCPl基因 的表达水平对黑羊出生后的成活率起重要作用。有关UCPl基因单核巧酸多态性（single nucleotide polymor曲ism，SNP)的研究表明，启动子区-3826A>G和-1766A>G，外显子2的 Ala64Thr和外显子5的Met229Leu及内含子4的208T>G的突变与人的体重、身体质量指数 (body mass index,BMI)和腰臀围比、腰围与身高比例、体脂重、脂肪率、腹部皮下脂肪和腹 部内脏脂肪重，W及n型糖尿病的患病几率等存在显著关联。
[0007]前人研究绵羊UCPl基因主要集中在组织表达特征研究，但关于UCPl对禍体脂肪沉 积的研究还不多，同时针对UCPl基因对绵羊禍体脂肪含量的相关研究更少。
【发明内容】
[000引本发明解决的技术问题在于提供一种检测绵羊UCPl等位基因的方法，寻找与经济 性状关联的等位基因型作为分子标记，W加快具有优质禍体脂肪含量性状绵羊种群的建 立。
[0009]本发明通过W下技术方案来实现： 本发明提供一种绵羊UCPl等位基因型的检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物对和 绵羊UCP1等位基因标准DNA; 所述特异性引物对为： 上游引物：5 ' -AGATACAAGCGGAAGAGACAC-3 ' ； 下游引物：5 ' -TGAAGGGTTGGGTCTGTCA-3 ' ； 所述绵羊UCPl等位基因标准DNA为序列表中SEQ ID No. 1-3。
[0010]本发明还提供一种绵羊UCPl等位基因型的检现巧法，步骤如下： (1) 设计特异性引物对： 上游引物：5 ' -AGATACAAGCGGAAGAGACAC-3 ' ； 下游引物：5 ' -TGAAGGGTTGGGTCTGTCA-3 ' ； (2) 对待测样本进行PCR扩增； (3) 用变性剂处理PCR扩增产物后，对变性后的扩增片段和绵羊UCPl等位基因标准DNA 样本同步进行SSCP电泳，根据标准DNA样本电泳结果判定待测样本的UCPl等位基因型;所述 绵羊UCPl等位基因标准DNA为序列表中SEQ ID No. 1-3。
[001。 作为优选，步骤(2)中所述PCR扩增反应程序为:94°C预变性5min，94°C变性30s、退 火溫度60°C 30s、72°C延伸Imin，循环35次，72°C延伸5min，4°C保存。
[0012] 本发明还提供一种绵羊禍体脂肪含量性状的分子标记辅助筛选方法，首先鉴定待 测样本的UCPl等位基因型，然后对结果进行判定:等位基因型为UCP1*B时，绵羊禍体脂肪含 量性状为优质；等位基因型为UCP1*A时，绵羊禍体脂肪含量性状为合格；等位基因型为 UCP1*C时，绵羊禍体脂肪含量性状为低劣。
[0013] 作为优选，所述鉴定待测样本的UCPl等位基因型的方法为： (1) 设计特异性引物对： 上游引物：5 ' -AGATACAAGCGGAAGAGACAC-3 ' ； 下游引物：5 ' -TGAAGGGTTGGGTCTGTCA-3 ' ； (2) 对待测样本进行PCR扩增； (3) 用变性剂处理PCR扩增产物后，对变性后的扩增片段和标准DNA样本同步进行SSCP 电泳，根据标准DNA样本电泳结果判定待测样本的UCPl等位基因型。
[0014] 作为优选，步骤(2)中所述PCR扩增反应程序为:94°C预变性5min，94°C变性30s、退 火溫度60°C 30s、72°C延伸Imin,循环35次，72°C延伸5min，4°C保存。
[0015] 本发明还提供优质禍体脂肪含量性状绵羊种群的建立方法，首先鉴定待测样本的 UCPl等位基因型，然后对结果进行筛选:将禍体脂肪含量性状为UCP1*C的绵羊个体淘汰;将 禍体脂肪含量性状基因型为UCPl地W及基因型为UCPl地C的个体留种进行扩繁。
[0016] 作为优选，所述鉴定待测样本的UCPl等位基因型的方法为： (1) 设计特异性引物对： 上游引物：5 ' -AGATACAAGCGGAAGAGACAC-3 ' ； 下游引物：5 ' -TGAAGGGTTGGGTCTGTCA-3 ' ； (2) 对待测样本进行PCR扩增； (3) 用变性剂处理PCR扩增产物后，对变性后的扩增片段和标准DNA样本同步进行SSCP 电泳，根据标准DNA样本电泳结果判定待测样本的UCPl等位基因型。
[0017] 作为优选，步骤(2)中所述PCR扩增反应程序为:94°C预变性5min，94°C变性30s、退 火溫度60°C 30s、72°C延伸Imin,循环35次，72°C延伸5min，4°C保存。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有W下技术效果： 本发明根据已公布绵羊UCPl基因 （GenBank Accession No. JN604985.1)的序列设计 引物，W绵羊的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，通过对扩增产物的SSCP聚丙締酷胺凝胶电 泳W及测序分析发现在绵羊UCPl基因启动子区存在多态性与不同的等位基因型。
[0019] 针对上述绵羊UCPl基因的多态性与等位基因型，本发明还公开了基于SSCP的等位 基因辨型和检测方法，进行PCR扩增后，用变性剂处理待测样本和标准DNA样本，进行SSCP聚 丙締酷胺凝胶电泳，通过与标准DNA带型比对获得待测样本的等位基因型，能够简单、快速、 低成本、精确地检测绵羊UCPl基因的等位基因型。
[0020] 本发明的检测方法为绵羊UCPl不同等位基因型与绵羊禍体脂肪含量性状进行关 联分析，研究表明绵羊UCPl等位基因型对绵羊群体的禍体脂肪含量性状具有显著影响(P< 0.05)。W上研究表明，绵羊UCPl基因能够作为提高绵羊禍体脂肪含量性状的分子标记，W 便用于绵羊禍体脂肪含量性状的分子标记辅助选择，快速建立具有优质肉用性状的遗传资 源绵羊群体。
【附图说明】
[0021] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为绵羊禍体脂肪含量性状特异主效基因等位基因 SSCP带型图。
【具体实施方式】
[0022] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0023] 实施例1 一种用于绵羊禍体脂肪含量性状检测的PCR-SSCP试剂盒 本发明的试剂盒包括： 1、 特异引物对： 上游引物：5 ' -AGATACAAGCGGAAGAGACAC-3 ' ； 下游引物：5 ' -TGAAGGGTTGGGTCTGTCA-3 ' ； 2、 生化试剂： 化qDNA聚合酶;灭菌超纯水； 内含MgCl2、dNTPs的5XBuffer或者为 10XPCR缓冲液、MgCl2和dNTP。
[0024] 注意事项： (1 )DNA的提取可依据不同厂家的全血DNA提取试剂盒要求提取，但需保证DNA的纯度， 若提取效果不佳，需要纯化后再进行后续的试验； (2)反应体系和反应程序可W依据不同的厂家产品要求来操作，但要保证扩增的特异 性和扩增产物的浓度，一面影响后续的试验结果。
[0025] 实施例2筛选与地方绵羊群体肌内脂肪性状显著相关DNA分子标记的方法 本发明首先根据NCBI公布的绵羊基因序列(GenBank Accession No. JN604985.1)设 计引物，W绵羊基因组DNA为模板，进行PCR扩增，通过对扩增产物的SSCP聚丙締酷胺凝胶电 泳W及测序分析发现在绵羊UCPl基因启动子区存在多态性与不同的等位基因型；其次，对 待测群体进行等位基因型的PCR-SSCP检测;最后，根据在群体中检测到的等位基因型，进行 群体遗传统计分析和禍体脂肪含量性状的关联分析，筛选出与绵羊肌内脂肪性状密切相关 的分子标记。
[0026] 用于选育地方绵羊群体肌内脂肪性状的分子标记方法，利用PCR-SSCP技术筛选与 地方绵羊群体肌内脂肪性状显著相关DNA分子标记的方法，具体内容如下： 一、基因组DNA提取 采集待测绵羊颈静脉血液5ml，构祿酸钢抗凝，-20°C保存； 参照《分子克隆实验指南》，用酪氯仿抽提法提取基因组DNA，-2(TC保存。
[0027] 配制1%琼脂糖凝胶:琼脂糖Ig,溶于100mL的0.5XTBE，微波炉加热至充分溶解，待 降至室溫后倒入插有梳子的胶槽内，冷却凝固后待用。
[0028] 利用配制的1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压100V，电流50mA，电泳30分钟。经漠 化已锭染色15分钟后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察条带的大小和亮度，判断DNA的提 取质量。
[0029] 二、PCR 扩增 (I)PCR扩增用引物 特异性扩增UCPl基因，所用引物对P的序列分别为： 引物P的上游引物序列5 '-AGATACAAGCGGAAGAGACAC-3 ' ； 引物P的下游引物序列5 ' -TGAAGGGTTGGGTCTGTCA-3 ' ； 扩增片段大小为35化P。
[0030] (2)PCR扩增反应体系参见表1。
[0031] 表1 PCR扩增反应体系
上述特异等位基因扩增引物的PCR反应条件为:94 °C预变性5min，94 °C变性30 s、退火溫 度60°C 30s、72°C延伸Imin，循环35次，72°C延伸5min，4°C保存。
[0032] 特异性扩增的两组PCR产物均由1%琼脂糖凝胶电泳检测，电压100V，电泳30min，经 漠化已锭邸染色15min后，于Bio-RAD凝胶成像仪紫外灯下照射，观察扩增条带的大小和亮 度，判断PCR产物扩增质量。
[0033] S、SSCP检测与待测样本的辨型 (1) 14%非变性聚丙締酷胺凝胶的配制 25ml 14%非变性聚丙締酷胺凝胶的配制方法:40%丙締酷胺溶液8.75ml、10 X T肥溶液 1.25ml，10%APS溶液15化1，TEM抓溶液13.64iU，蒸馈水14.84ml。揽拌均匀后匀速灌入制胶 器，并插入梳子，待胶凝固后，缓缓拔出梳子。
[0034] (2)PCR扩增产物和标准DNA样本变性 取化1的PCR产物，加入7iil变性缓冲液，95%甲酯胺、lOmmol/L抓TA、0.05%漠酪兰、 0.05%二甲苯青，瞬时离屯、后，在PCR仪中98°C变性lOmin，取出后立即置于冰上，IOmin后全 部上样。
[00巧](3)SSCP聚丙締酷胺凝胶电泳 将适量0.5 X T邸缓冲液加入上下槽，用注射器将产生的气泡赶出，并冲洗点样孔;按正 负极合上电泳槽盖，预电泳30min后，用微量进样器吸取变性后的PCR产物加入点样孔;点样 完成后，在电压250V，溫度15°C下电泳1她。
[0036] (4)染色、显色： 从电泳槽中取出凝胶，用蒸馈水漂洗2次后，加入染色液(0.1%硝酸银)250ml，放于摇床 避光轻轻摇15min，倒出染色液； 加入显色液(2%氨氧化钢+0.1%甲醒)250ml，浸没凝胶，边摇边观察，直到凝胶上显现电 泳带;倒出显色液，迅速用去离子水冲洗2-3次，拍照。
[0037] 将绵羊UCPl等位基因标准DNA与待检测DNA双链样本同步进行SSCP电泳，标样DNA 共有=个等位基因，其核巧酸序列分别为： UCP1*A 标准 DNA: 曰g曰t曰C曰曰gcgg曰曰g曰g曰C曰C曰C曰cctttgtcttttg曰tg曰g曰gg曰曰tctgcg曰曰tetgcttt曰曰曰曰CC曰C曰t C曰邑曰t邑邑曰曰CC曰Ct邑曰邑曰曰曰邑曰C曰曰t邑C曰C曰邑邑邑tt邑邑t邑曰邑tt邑邑邑tt邑t邑邑邑tt邑邑邑邑曰tt曰tcc曰邑tt邑曰t曰邑C gattcaccttttatgcattataacgaacattcccaatctgcttagccatcatcctcacaacctaataacttcaccac agctgcactctctaaggtgaccaattatgttagagccaaatccaatagttttctttgtttttattctcttttgacat tttttctaaacattacagtatgactacttgacagacccaacccttcaa UCPl地标准DNA: 过g过t过C过过gcgg过过g过g过C过C过C过cctttgtcttttg过tg过g过gg过过tctgcg过过t过tgcttt过过过过CC过C过t cagatggaaccactgagaaagacaatgcacagggttggtgagttgggttgtgggttggggattatccagttgatagc gattcaccttttatgcattataacgaacattcccaatctgcttagccatcatcctcataacctaataacttcaccac agctgcactctctaaggtgaccaattatgttagagccaaatccaatagttttctttgtttttattctcttttgacat tttttctaaacattacagtatgactacttgacagacccaacccttcaa UCP1*C 标准 DNA: 过g过t过C过过gcgg过过g过g过C过C过C过cctttgtcttttg过tg过g过gg过过tctgcg过过t过tgcttt过过过过CC过CSt cagatggaaccactgagaaagacaatgcacagggttggtgagttgggttgtgggttggggattatccagttgatagc gattcaccttttatgcattataacgaacattcccaatctgcttagccatcatcctcataacctaataacttcaccac agctgcactctctaaagtgaccaattatgttagagccaaatccaatagttttctttgtttttattctcttttgacat tttttctaaacattacagtatgactacttgacagacccaacccttcaa 绵羊UCPl等位基因标准DNA样本的核巧酸序列与待检样本的等位基因在序列上完全相 同，等位基因标准DNA样本是制备的单链DNA，其唯一特点是标样的单链DNA在SSCP电泳时条 带非常清晰明亮，标样DNA与待检测DNA双链样本同步进行SSCP电泳时，可W用肉眼直接通 过比较标样DNA带型与待测DNA样本带型差别，W此来鉴定待测样本的UCPl等位基因型，结 果参见附图1。
[003引四、DNA测序 选取引物P扩增基因片段中不同基因型个体的PCR产物，送往上海生物工程技术有限责 任公司进行测序，利用DNAman软件分析对比DNA序列，确定等位基因序列。
[0039]五、关联分析 利用软件SPSS19.0,对不同基因型间的禍体脂肪含量性状进行统计分析，分析方法如 下： 应用一般线性混合模型(General Linear Mixed Model,GLMM)评估UCPl等位基因存 在/缺失对肌内脂肪性状的影响。分别将存在定义为"r，缺失定义为"0"，考虑等位基因效 应，性别效应W及出生等级（单黑、双黑等)为固定因素 (Fixed Factors),家系效应为随机 因素，配合下列模型进行最小二乘方差分析， Yukng=l^+Mi+Gj+Wg+Ck+Xn+eijkng 其中：Yi化ng为禍体脂肪含量性状;ii为性状群体平均值;Mi为UCP1基因型，等位基因效 应;Gj为出生等级效应;Wg为性别效应;Ck为家系效应;Xn为互作效应;eijkng为随机误差效应。 P<0.05为具有显著效应。
[0040] 根据上述分析鉴定结果，待测样本带型与UCP1*B带型一致的W及待测样本与 UCPl地C基因型一致的其绵羊禍体脂肪含量性状为优质;待测样本与UCP1*A标准DNA样本带 型一致的绵羊禍体脂肪含量性状为合格;待测样本带型与UCP1*C标准DNA样本带型一致的 绵羊禍体脂肪含量性状为低劣。
[0041] 根据上述分析，将禍体脂肪含量性状UCP1*C个体淘汰;优质禍体脂肪含量性状基 因型UCPl地W及基因型UCPl地C的个体留种进行扩繁，将形成一个优良的肉质性状群体。
[0042] 结果如下表2和表3。
[0043] 表2不同尊位基因间的禍体脂肪含量性状进行差异显著性枪骑表
*显著性水平在0.05，较显著水平在0.05-0.10之间。
[0044] 表3不同基因型间的禍体脂肪含量性状进行差异显著性检验表
*显著性水平在0.05，较显著水平在0.05-0.10之间。
[0045] 实施例3优质禍体脂肪含量性状绵羊种群的建立 应用实施例2中的方法鉴定待测样本的UCPl等位基因型，然后对结果进行筛选:将禍体 脂肪含量性状为UCP1*C的绵羊个体淘汰;将禍体脂肪含量性状基因型为UCP1*BW及基因型 为UCPl地C的个体留种进行扩繁，建立优质禍体脂肪含量性状绵羊种群。
[0046] 最后应说明的是：W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 W对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种绵羊UCPl等位基因型的检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括特异性引物 对和绵羊UCP1等位基因标准DNA; 所述特异性引物对为： 上游引物：5 ' -AGATACAAGCGGAAGAGACAC-3 ' ； 下游引物:5 ' -TGAAGGGTTGGGTCTGTCA-3 ' ； 所述绵羊UCPl等位基因标准DNA为序列表中SEQ ID No. 1-3。2. -种绵羊UCPl等位基因型的检测方法，其特征在于:步骤如下：（1)设计特异性引物 对： 上游引物：5 ' -AGATACAAGCGGAAGAGACAC-3 ' ； 下游引物:5 ' -TGAAGGGTTGGGTCTGTCA-3 ' ； (2) 对待测样本进行PCR扩增； (3) 用变性剂处理PCR扩增产物后，对变性后的扩增片段和绵羊UCPl等位基因标准DNA 样本同步进行SSCP电泳，根据标准DNA样本电泳结果判定待测样本的UCPl等位基因型;所述 绵羊UCPl等位基因标准DNA为序列表中SEQ ID No. 1-3。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述PCR扩增反应程序为:94°C 预变性5min，94°C变性30s、退火温度60°C 30s、72°C延伸lmin，循环35次，72°C延伸5min，4 °C保存。4. 一种绵羊胴体脂肪含量性状的分子标记辅助筛选方法，其特征在于:首先鉴定待测 样本的UCPl等位基因型，然后对结果进行判定:等位基因型为UCP1*B时，绵羊胴体脂肪含量 性状为优质;等位基因型为UCP1*A时，绵羊胴体脂肪含量性状为合格;等位基因型为UCP1*C 时，绵羊胴体脂肪含量性状为低劣。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述鉴定待测样本的UCPl等位基因型的方 法为： (1) 设计特异性引物对： 上游引物：5 ' -AGATACAAGCGGAAGAGACAC-3 ' ； 下游引物:5 ' -TGAAGGGTTGGGTCTGTCA-3 ' ； (2) 对待测样本进行PCR扩增； (3) 用变性剂处理PCR扩增产物后，对变性后的扩增片段和标准DNA样本同步进行SSCP 电泳，根据标准DNA样本电泳结果判定待测样本的UCPl等位基因型。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述PCR扩增反应程序为:94°C 预变性5min，94°C变性30s、退火温度60°C 30s、72°C延伸lmin，循环35次，72°C延伸5min，4 °C保存。7. 优质胴体脂肪含量性状绵羊种群的建立方法，其特征在于：首先鉴定待测样本的 UCPl等位基因型，然后对结果进行筛选:将胴体脂肪含量性状为UCP1*C的绵羊个体淘汰;将 胴体脂肪含量性状基因型为UCP1*B以及基因型为UCP1*BC的个体留种进行扩繁。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述鉴定待测样本的UCPl等位基因型的方 法为： (1)设计特异性引物对： 上游引物：5 ' -AGATACAAGCGGAAGAGACAC-3 ' ； 下游引物:5 ' -TGAAGGGTTGGGTCTGTCA-3 ' ； (2) 对待测样本进行PCR扩增； (3) 用变性剂处理PCR扩增产物后，对变性后的扩增片段和标准DNA样本同步进行SSCP 电泳，根据标准DNA样本电泳结果判定待测样本的UCPl等位基因型。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述PCR扩增反应程序为:94°C 预变性5min，94°C变性30s、退火温度60°C 30s、72°C延伸lmin，循环35次，72°C延伸5min，4 °C保存。
【文档编号】C12Q1/68GK105925701SQ201610397209
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】杨果, 段子渊, 赵凯, 张玉宝, 王小琪, 谢忠奎
【申请人】中国科学院寒区旱区环境与工程研究所