一种检测鲤IGF2a基因单核苷酸多态性的方法及引物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测鲤IGF2a基因单核苷酸多态性的方法及引物，通过鲤IGF2a基因外显子和内含子的全基因组扩增，获得该基因的DNA全长，并划分成不同长度的片段进行扩增，获得IGF2a基因不同片段的SNP信息，完成整个基因的基因组扫描。本发明提供的方法可用于检测与经济性状相关的鲤IGF2a基因SNP位点，也可用起分析该位点与该基因表达量的关系等后续工作。
【专利说明】
-种检测绳IGF2a基因单核昔酸多态性的方法及引物
技术领域
[0001] 本发明属于鱼类分子设计育种技术领域，尤其设及一种检测經IGF2a基因SNP的方 法及引物。
【背景技术】
[0002] 經是我国养殖面积广、抗逆性强、产量大的重要淡水经济鱼类。据《中国渔业统计 年鉴》，2011年我国大宗淡水鱼产量达1698.50万吨，其中經鱼产量为271.82万吨。可W看 出，經鱼的生产在我国占有举足轻重的地位。
[0003] 类膜岛素生长因子（insulin-like growth factor, IGF)是一种促细胞分裂的多 肤，包括IGFl和IGF2,其结构与膜岛素相类似。IGF是生长激素发挥作用的中间信使，即生长 激素首先作用于IGF，再由IGF作用于祀器官，进而发挥其促进生长发育的作用。目前IGF2已 经在金头觸、罗非鱼、斑马鱼、河豚、經、大麻哈鱼中是确定表达的。值得提出的是，斑马鱼存 在IGF2a和IGF2b 2种基因。在对經的IGF2基因进行研究发现，Tse等在2002年首先成功克隆 了經的IGF2基因，其在經肝脏、屯、脏、脑等组织中广泛表达。同样Su等2012年发现在經体内 同样存在IGF2a、IGF化巧巾基因，而Tse等发现的为IGF化基因。但目前为止还未见到对该基 因进行基因组扫描寻找SNP的报道，仅有本实验室发表的关于该基因小片段SNP检测，无法 从根本上、整体上检测该基因SNP位点与与經生长性状的相关性。本研究为了克服运些不 足，研究透该基因SNP位点与經生长形状的相关性，找到了一种可W检测到与經生长形状有 关的所有该基因的SNP位点的方法。
【发明内容】
[0004] 解决的技术问题:本发明的目的在于寻找与生长性状关联的IGF2a基因潜在SNPs 的检测手段，提供一种經基因组中获取候选基因全基因组的SNP方法及引物。
[0005] 技术方案：
[0006] 一种引物组，该引物组用于扩增經鱼IG的a基因CDNA序列，该引物组包括W下引 物：IGF2ai"正向引物5'-3' ：GACAGCCACAAGCATCACT，IGF2ai"反向引物5'-3' ： TTTCTCCATCTGCCTCCTA;IGF2a 22#正向引物5'-3' ：CTCTTCACAAGGACACCATA，IGF2a 22#反向引 物5 ' -3 ' ： AAGCTTCCATTGACTTTACT; IGF2a 33#正向引物5 ' -3 ' ： GTGCCTCTTATTGCTTTCTACC， IGF2a 33#反向引物5 '-3 ' ： GAAACATCTCGCTCGGACTT。
[0007] -种引物组，该引物组用于扩增經鱼IGF2a基因序列，该引物组包括W下引物： IGF2a"正向引物5 ' -3 ' ： CCACAAGCATCACTCAAAGAA，IGF2a"反向引物5 ' -3 ' ： CCGTAGTCAACCCGTATCG;IGF2a 2#正向引物5'-3' ：AAATCAGCACAGTCACAGCAG，IGF2a 2#反向引 物5 '-3 ' ： GGGGAAGTTCTCCGTCATC; IGF2a 3#正向引物5 '-3 ' ： GTGCCTCTTATTGCTTTCTACC，IGF2a 3#反向引物5'-3' ：GAAACATCTCGCTCGGACTT;IGF2a 4#正向引物5'-3' ： GCAAAGCCTGTGAAGTCCG，IGF2a 4#反向引物5'-3' ：CATATTTCCATGCCAAGAGCA;IGF2a 5#正向引 物5'-3' ：AAAATCTTGTGCCATGTGCTC，IGF2a 5#反向引物5'-3' ：GGCTTTCTTTGCCATACTTCA; 16尸23 6#正向引物5'-3'：(：164門4〔6(：〔46(：門661'，16尸23 6#反向引物5'-3'： GTTTCCGGTTTGAGTTTCTGT; IGF2a 7#正向引物5 '-3 ' ： AATGACAGTGAAGACGATTTGC，IGF2a 7#反 向引 物5'-3' ：TCTGTCTTGCTTGCACCCTA;IGF2a 8# 正向弓| 物5' - 3' ： GCAGGTAAAGGACTCTAATCTCG，IGF2a S#反向引物5'-3' ：AAATGGGAACAAACAAGGGA;IGF2a 9#正 向引物5 ' -3 ' ： AGAAAGACGGTGGGCGAGTG，IGF2a 9#反向引物5 ' -3 ' ： ACAAGGACACCATAGGAGGG。 [000引一种检测經IGF2a基因单核巧酸多态性的方法，包括W下步骤：
[0009] (1)对待测經鱼样本IG的a基因CDNA序列通过权利要求1所述的引物组进行扩增， 得到扩增片段一；
[0010] (2)对待测經鱼样本IGF2a基因序列通过权利要求2所述的引物组进行扩增，得到 扩增片段二；
[0011] (3)将步骤(1)与步骤(2)得到的扩增片段一与扩增片段二分别进行琼脂糖凝胶电 泳，然后回收、纯化、测序，再按照斑马鱼基因组序列排列顺序进行拼接，最后得到扩增后的 IGF2a基因全基因组序列，同时与斑马鱼基因组序列比较并记录差异位点的具体位置；
[0012] (4)对待测經鱼样本与另一种經鱼样本进行正反交组合，对子代利用权利要求1和 权利要求2所述的引物组进行基因扩增并按照斑马鱼基因组序列排列方式进行拼接，得到 子代IG的a基因序列；
[0013] (5)将子代IG的a基因序列与亲本原始IG的a基因进行比对，通过检测进一步确认 目标序列的变异位点，并与步骤(3)记录的差异位点进行对照，最终得到单核巧酸多态性位 点。
[0014] 所述的检测經IGF2a基因单核巧酸多态性的方法，步骤（1)或（2)中扩增反应体系 可W为IOXbuffer 1扣L，25mmol/L的Mg叫化，各2mmol/L的dNTPs 化L，10mmol/L的上游引 物luL、10mmol/L的下游引物化L、模板DNA化L，化qDNA聚合酶1U，其余为dd出0。
[0015] 所述的检测經IGF2a基因单核巧酸多态性的方法，步骤（1)或（2)中扩增反应条件 可^为94°(：预变性3111111;94°(：变性2〇3，溫度50~58°(：退火2〇3,72°(：延伸3〇3,33个循环；72 °C 延伸 IOmin。
[0016] 所述的检测經IGF2a基因单核巧酸多态性的方法，步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳使用 的是8%非变性聚丙締酷胺凝胶。
[0017]有益效果
[0018] 用IGF2a基因全基因组SNPs检测方法，可对该基因整个基因组序列进行扫描，设计 的引物片段都适合直接测序或是结合酶切展开大样本分析，也可针对某一选定区域进行单 核巧酸位点检测。运种分析方法可W找出与体重相关的SNP位点，也可用起分析该位点与该 基因表达量的关系等后续工作。
[0019] 此种分析方法应用于鱼类W分子标记辅助选择为基础的新品种选育，也可用于开 展候选基因功能研究的科学实验。
[0020] 本研究设计引物进行该基因与經生长性状相关的IGF2a单核巧酸多态性(single nucleotide polymo巧hism，SNP)检测，为研究该多态位点与生长性状的关系W及为分子辅 助选择育种奠定基础。
【附图说明】
[0021] 图I为本发明实施例1中黄河經和建經的正反交组合后IGF2a基因序列比对结果 图；
[0022] 图2为本发明实施例1中IGF2a4#引物检测到的1816号多态位点与建經体重体长比 的关系图。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1
[0024] 从NCBI (WWW. neb i .nlm.nih.gov )数据库中查取IGF2a基因 cDM序列 (歷641129.1 )，设计引物进行外显子扩增（引物组见表1 )，然后与斑马鱼基因组序列比对， 寻找潜在的外显子和内含子的剪切位置，设计引物进行全基因组扩增（引物组见表2)。
[0025] 表1經IGF2a cDNA扩增所需引物 [OOMl
[
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[0030] W建經和黄河經为研究对象各3尾，提取基因组DNA模板和总RNA模板，并反转录成 CDNA模板(使用化KaRad的DNA、RNA提取试剂盒，RNA反转录试剂盒），分别使用上表1和表2中 提供的引物组，使用如下反应体系和条件进行PCR扩增：
[00別]反应体系为10Xbufferl扣L，25mmol/L的Mg2+l化，各2mmol/L的dNTPsl化， 1 Ommo 1/L的上游引物IuL、IOmmo 1 /L的下游引物化L、模板DNA化L，I^qDNA聚合酶IU，其余为 dd出0,总量化化。
[0032] 上述的PCR反应程序为:94°C预变性3min; 94°C变性20s，溫度50~58 °C退火20s，72 。(:延伸30s，33个循环；72 °C延伸IOmin。
[0033] 上述琼脂糖凝胶电泳中使用的是8%非变性聚丙締酷胺凝胶。
[0034] W上所有IG的a基因组扫描包含經待测全基因组DNA为模板，W引物对目标基因组 进行PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化、测序，并按照 斑马鱼基因组序列排列方式进行拼接，得到待测建經和黄河經IGF2a基因组全序列，其中黄 河經IG的a基因组全序列如SEQ ID NO.25所示，通过与斑马鱼基因组序列进行比对，确定出 其中第2772位-3115位，第3255位-4000位，第4174位-5017位为内含子序列，其余为CDNA序 列。
[0035] 根据扩增到的DNA基因组序列和扩增所需引物，W黄河經和建經的正反交组合(各 30尾)为例（正交就是黄河經雄鱼和建經雌鱼进行杂交的后代，而反交则是黄河經雌鱼和建 經雄鱼杂交的后代），进行扩增和候选SNP位点的筛选，扩增采取的上述表1和表2中的引物 和PCR反应体系进行PCR扩增，筛选是根据测序的结果进行多重序列比对，找出所关注序列 的变异位点，即筛选出的SNP位点。首先是直接测序法测序，然后进行序列比对，结果见图1， 黑色字体是原始序列，黑色背景的白色字体分别是黄河經作父本建經作母本的后代和建經 作父本黄河經做母本的后代样本中IGF2a的测序结果。
[0036] 在筛选到潜在的SNP位点后，分析所在的序列的特点（如果该SNPs可用较为经济的 酶切方法进行检测，也可采用直接测序法），本发明采用直接测序法进行多态性位点检测， 表3为检测到各个位点的位置。
[0037] 表3經IGF2aDNA扩增所需引物及检测到的SNP位点
[003只1
[0039」如果检测多个祥本，可从关屯、的潜在SNP位点，寻找引物进斤PCR扩增，然后直接测 序比对，获得所需要的检测信息。综合W上步骤，我们可W得到一种通过基因组扫描經 IGF2a基因 SNP的方法，该方法通过經IGF2a基因外显子和内含子的全基因组扩增，获得该基 因的DNA全长，并划分成不同模块扩增，获得經IGF2a基因不同片段的SNP信息，完成整个基 因的基因组扫描，并通过潜在SNPs位点的统计，根据实际需要选择对应引物进行该标记位 点的检测。
[0040]基于本发明检测到的位点基础上，采集建經30尾，对其进行IGF2a4#引物多态位点 检测，使用上述方法提取DNA，并用对应的反应体系进行PCR扩增，然后进行测序、比对，显著 性检测，发现1816号位点处存在巧IjA的突变，发现杂合基因型AG体重体长比(mm/g)。
【主权项】
1. 一种引物组，该引物组用于扩增鲤鱼為基因 cDNA序列，其特征在于，该引物组包 括以下引物： '之 a11# 正向引 物5'一3' iGACAGCCACAAGCATCACIMi；/^'之 a11# 反向引 物5'一3' ： ITTCTCCATCTGCCTCCTA; /?/?? 22#正向引物5 ' -3 ' ： CTCTTCACAAGGACACCATA，iG/Ca 22#反向引 物5 ' -3 ' ： AAGCTTCCATTGACTTTACT;凡/Ca 33#正向引物5 ' -3 ' ： GTGCCTCTTATTGCTTTCTACC， 33#反向引物5 ' -3 ' ： GAAACATCTCGCTCGGACTT。2. -种引物组，该引物组用于扩增鲤鱼基因序列，其特征在于，该引物组包括以 下引物： 正向弓丨物5'-3' ： CCACAAGCATCACTCAAAGAA，Ii?/^a1#反向弓丨物5'-3' ： CCGTAGTCAACCCGTATCG;凡/Ca 2#正向引物5 '-3 ' ： AAATCAGCACAGTCACAGCAG，凡/Ca 2#反向引 物5 ' -3 ' ： GGGGAAGTTCTCCGTCATC; 3#正向引物5 ' -3 ' ： GTGCCTCTTATTGCTTTCTACC， '之a 3#反向引 物5 ' 一3 ' ： GAAACATCTCGCTCGGACTT; '之a 4#正向引 物5 ' 一3 ' ： GCAAAGCCTGTGAAGTCCG，iG/Ca 4#反向引物5 ' -3 ' ： CATAITTCCATGCCAAGAGCA; iG/Ca 5#正向引 物5 '-3 ' ： AAAATCTTGTGCCATGTGCTC，5#反向引物5 '-3 ' ： GGCTTTCTTTGCCATACTTCA; '之a 6#正向引 物5'一3' ： CTGATTACGCCAGCTTGGT，'之a 6#反向引 物5 ' 一3 ' ： GTTTCCGGTTTGAGTTTCTGT; /(6/?? 7#正向引物5 ' -3 ' ： AATGACAGTGAAGACGATTTGC，iG/Ca 7#反向 引物5 '-3 ' ： TCTGTCTTGCTTGCACCCTA; iG/Ca 8#正向引物5 '-3 ' ： GCAGGTAAAGGACTCTAATCTCG， AGAAAGACGGTGGGCGAGTG，9#反向引物5 ' -3 ' ： ACAAGGACACCATAGGAGGG 〇3. -种检测鲤/?/??基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 对待测鲤鱼样本為基因 cDNA序列通过权利要求1所述的引物组进行扩增，得到 扩增片段一； (2) 对待测鲤鱼样本基因序列通过权利要求2所述的引物组进行扩增，得到扩增 片段二； (3) 将步骤（1)与步骤(2)得到的扩增片段一与扩增片段二分别进行琼脂糖凝胶电泳， 然后回收、纯化、测序，再按照斑马鱼基因组序列排列顺序进行拼接，最后得到扩增后的 基因全基因组序列，同时与斑马鱼基因组序列比较并记录差异位点的具体位置； (4) 对待测鲤鱼样本与另一种鲤鱼样本进行正反交组合，对子代利用权利要求1和权利 要求2所述的引物组进行基因扩增并按照斑马鱼基因组序列排列方式进行拼接，得到子代 /(6/??基因序列； (5 )将子代IfZUa基因序列与亲本原始IfZUa基因进行比对，通过检测进一步确认目标 序列的变异位点，并与步骤(3)记录的差异位点进行对照，最终得到单核苷酸多态性位点。4. 根据权利要求3所述的检测鲤/(6/??基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤 (1)或（2)中扩增反应体系为IOXbuffer 15 yL，25mmol/L的Mg2+IyU各2mmol/L的dNTPs 1 yL，10 mmol/L的上游引物luL、10 mmol/L的下游引物lyL、模板DNA I yL，TaqDNA聚合酶 1U，其余为dd H20。5. 根据权利要求3所述的检测鲤/(6/??基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤 (1)或(2)中扩增反应条件为94°C预变性3 min;94°C变性20s，温度50~58°C退火20s，72°C延 伸30s，33个循环；72°C延伸lOmin。6.根据权利要求3所述的检测鲤/(6/??基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，步骤 (3)中琼脂糖凝胶电泳使用的是8%非变性聚丙烯酰胺凝胶。
【文档编号】C12N15/11GK105925704SQ201610415917
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】苏胜彦, 董在杰
【申请人】中国水产科学研究院淡水渔业研究中心