一种荧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了一种荧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法，所述引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述探针如SEQ ID NO:3所示，所述方法为以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，再进行荧光定量PCR扩增反应，收集荧光信号，绘制曲线。本发明的检测猪delta冠状病毒的引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，能够检测出猪delta冠状病毒，可以对各种临床样品进行检测，从而可以快捷的对临床中猪delta冠状病毒感染情况进行监测，操作简单、实用。
【专利说明】
-种黄光定量PCR检测猪de I ta冠状病毒的引物、探针、试剂盒 及方法
技术领域
[0001 ]本发明属于动物病毒学和分子生物学技术领域，更具体地，本发明设及一种巧光 定量PCR检测猪de 1 ta冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 猪delta冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是近年来新发现的可引起 猪只，特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒，其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率，是造成 新生仔猪死亡的重要原因之一。猪deUa冠状病毒属于尼多病毒目，冠状病毒科，delta冠状 病毒属的成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒。
[0003] 该病毒与2012年由Woo等首次在香港检出（Woo，P.C.，Lau，S.K.，Lam，C.S.，Lau， C.C.,Tsang，A.K.，Lau，J.H.，Bai，民.，Teng，J.L.,Tsang，C.C.,Wang,M.,Zheng，B.J.,Chan, K.H.,Yuen,K.Y.,2012.Discovery of sevennovel Mammalian and avian coronaviruses in the genus delt过coro打过virussupports b过t coro打过viruses 过s the gene source of 过Iphscoroosvirus 过打dbet过coro打过virus 过打d 过vi过打 coro打过viruses 过s the gene source of gammacoronavirus and deltacoronavirus .J. Virol.86，3995-4008)。而第if歹ij PDCoV腹泻的病例则在2014年美国报道（Ma^haler，D.，Raymond，L.，Jiang，Y. ,Collins， J.，Rossow，K.，Rovira，A.，2014b.Rapiddetection，complete genome sequencing,and phylogenetic analysis of poreinedeItacoronavirus.Emerg. Infect.Dis.20,1347- 1350)。最近又报道显示，在2004年到2012年间，中国腹泻的仔猪中即存在猪deUa冠状病毒 (Dong，N.,Fang,L.,Zeng,S.,Sun,Q.,Chen,H.,Xiao,S.,2015.Porcinedeltacoronavirus in mainland China.Emerg.Infect.Dis.21,2254-2255DWang,Y.W.，Yue，H.,Fang,W.， Huang,Y.W.,2015b.Complete genome sequence ofporcine deltacoronavirus strain CH/Sichuan/S27/2012from mainland China.Genome Announc.3,e00945-15.)〇
[0004] PDCo V基因组与PEDV基因组结构相似，大约为25kb，包含5'和3'非翻译区及7个开 放阅读框，分别编码多聚蛋白（polymerase protein) la/b、纤突（spike，S)蛋白、小膜 化nvelope，E)蛋白、膜（Membrane，M)蛋白、非结构蛋白6(nonstructural protein6，NS6)、 核衣壳（Nucleocapsid，N)蛋白及非结构蛋白 7 (nonstructural protein 7，NS7)〇 Marthaler等（Marthaler，D.，民aymond，L.，Jiang，Y.，Collins，J.，民ossow，K.，民ovira，A.， 2014b.民apiddetection,complete genome sequencing,and phylogenetic analysis of porcinedeltacoronavirus .Emerg. Infect .DiS .20,1347-1350)检测了293份粪便、肠道、饲 料^及环境样本，发现PDCoV的检出率为30% (89/293)，且与其他病毒的共感染现象较为严 重，其中与轮状病毒的共感染率高达58%(52/89)DMa等(Ma Y M，Zhang Y，Laing X Y，Lou F F,Oglesbee !,Krakowkaa S，Li J 民.Origin,evolution and virulence of porcine deltacoronaviruses in the United States.! Bio,2015,6(2):e00064-15.)将分离的 PDCoV病毒接种悉生仔猪和新生商品仔猪，接种猪只均发生水样腹泻、呕吐等流行性腹泻症 状，证明了该病毒可导致仔猪的腹泻。研究人员还发现，无论是自然感染还是人工感染的情 况下，PDCo V造成的仔猪腹泻症状及病理变化与PEDV及TGEV等造成的症状都非常相似，临床 上很难区分。因此需要采用实验室手段进行鉴别诊断。
[0005] 巧光定量PCRW特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快的诸多优点成为 分子生物学研究W及检测中的重要工具。本发明拟通过分析PDCoV的相关序列从而建立一 种灵敏、特异的PDCoV巧光定量PCR检测方法。
【发明内容】
[0006] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明通过对猪delta冠状病毒N基因的 分析，设计了引物和报告基团标记的探针，并建立了巧光定量PCR方法，可W对猪delta冠状 病毒进行快捷的检测。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明采取了 W下技术方案：
[000引一种巧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的引物，所述引物如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示。
[0009] 本发明还公开了一种巧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的探针，所述探针如SEQ ID NO:3所示。
[0010] 在其中一些实施例中，所述探针的5'端和3'端分别标记FAM和肌Ql。
[0011] 上述引物和探针在制备巧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的试剂盒中的应用。
[0012] -种巧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和 探针。
[0013] 在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括RT预混液1、RT预混液2、Realtime PCR Master Mix及无菌蒸馈水。
[0014] 在其中一些实施例中，所述RT预混液1包括随机引物和dNTP mix;RT预混液2包括5 倍反转录缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶和不含RNA酶的双蒸水。
[0015] -种巧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的方法，采用上述引物和探针，包括W下 步骤：W待检测样品的RNA为模板，反转录得到CDNA，再进行巧光定量PCR扩增反应，收集巧 光信号，绘制曲线；
[0016] 其中，所述反转录步骤为：将RNA与RT预混液1混匀，65°C反应5min，然后迅速置于 冰上2min，再加入到RT预混液2中，混匀后进行PCR扩增反应，所述PCR扩增的反应程序为:30 °C IOmin;42°C60min; 70°C 15min;反转录体系中，RT预混液 1 的成分为:Ramdom 9mer和dNTP mix各化LRT预混液2的成分为：5XP；rimeSci;rpt Buffer 4]iL，Rnase Inhibitor 0.!5化， PrimeScript Reverse Transcriptase luL,Rnase free 出0 4.5化；
[0017] 所述巧光定量PCR扩增反应的反应体系为：
[001 引
[0019] 所述巧光定量PCR扩增反应
的反应程序为：95°C 20s ;然后95°C 5s，55 °C4s，72°C 30s，共进行40次循环;72 °C时收集巧光。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有W下显著效果：
[0021] 本发明的巧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的引物和探针具有很高的特异性和 灵敏度，能够检测出猪delta冠状病毒，可W对各种临床样品进行检测，从而可W快捷的对 临床中猪delta冠状病毒感染情况进行监测，操作简单、实用。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例1中对样品扩增的曲线图；
[0023] 图2为本发明试验例1的特异性检验结果，其中曲线1为PDCoV阳性，曲线2-7分别为 猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪圆环病毒、猪攝病毒、 猪伪狂犬病毒；
[0024] 图3为本发明试验例2的灵敏度检验结果，其中，曲线1、2、3、4、5、6、7、8代表的拷贝 数分别为 l.〇lXl〇9、l.〇lXl〇8、l.〇lXl〇7、1.01Xl〇6、l.〇lXl〇5、1.01Xl〇4、l.〇lXl〇3、 1.01Xl〇2。
【具体实施方式】
[0025] W下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
[0026] W下实施例中设及的实验材料如无特殊说明，均来源于市售，W下实施例中所采 用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。
[0027] 实施例1 一种巧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的引物、探针和方法 [002引 1、引物设计
[00巧]根据NCBI登陆的猪delta冠状病毒基因组序列，登录号：KJ601780、KJ601778、 KU051649、KU051641、KR131621、KJ601777提供的信息，经过比对分析，设计了巧光定量PCR 的引物和探针，分别为F、R、P:
[0030] 上游引物F:GAGCTGACACTTCTATTAAA(SEQ ID N0:1);
[0031] 下游引物R:TGGAGTTAACAGATTGAGA(沈Q ID N0:2);
[0032] 探针P:TTCCACGCTCCTGAGGTCTTC(沈Q ID N0:3)
[0033] 其中，P的5'端和3'端分别标记FAM和肌Ql。
[0034] 使用上述引物和探针进行巧光定量PCR扩增，可W通过扩增曲线检测猪delta冠状 病毒，省去测序的步骤，节省了时间和成本。
[00巧]2、检测方法
[0036] 包括W下步骤：
[0037] (1 )、待检样品RNA提取
[0038] 200化细胞培养液(感染自主分离毒株JS，该毒株经鉴定为delta冠状病毒KlOOmg 的肠道病料和IOOmg粪便（病料和粪便未知是否感染病毒）W及DMEM(细胞培养基，不含 阳DV)作为待检样品，分别进行W下操作：
[00例加入ImL PBS缓冲液进行充分研磨，-20°C反复冻融3次，SOOOrpm离屯、IOmin，取上 清液20化L，加入0.2mL氯仿，震荡混匀15s后在室溫下（15°C~30°C)放置2~3min后，12000g (2 °C~8 °C )离屯、15min;取上层水相置于新EP管中，加入0.5mL异丙醇，在室溫下（15 °C~30 °C )放置IOmin，12000g(2°C~8°C)离屯、IOmin;弃上清，加入ImL 75 %乙醇进行洗涂，满旋混 合，7500g( 2 °C~8 °C)离屯、Smin，弃上清；让沉淀的RNA在室溫下自然干燥后加入20化 化as e-Free出0溶解，即为RNA模板。提取的RNA放于-80°C保存。
[0040] (2)提取的RNA加入到反转录预混反应液中进行反转录，得到CDNA模板
[0041 ] 反转录体系及过程:祉L的RNA与化L RT预混液1混匀，65°C反应5min，然后迅速置 于冰上2min。此反应混合溶液再加入到RT预混液2中，混匀后置于PCR仪上，按如下条件反 应：30°(：10111111;421：60111111;70°(：15111111(无循环）。其中，1?1'预混液1:1?日111(1〇11191116^50础）和 dNTP mix(lOmM)各化LRT预混液2:5 XPrimeScbpt Buffer 化L Jnase Inh;Lbito;r(40U/ii L)0.5化,PrimeScript Reverse Transcriptase(200U/jiL)IuURnase free 此O 4.5化，均 购自大连TaKaRa公司。
[0042] (3)巧光定量PCR
[0043] 将化L CDNA模板加入到定量PCR预混液中，配制20化反应体系，并混合均匀，将PCR 管置于ABI公司750(Fas t定量PCR仪上进行扩增反应。其中定量PCR预混液：raUNDERBIRD Probe qPCR Mix 10化、50XR0X reference dye 0.04化，购自TOYOBO公司；F和R(均为 2化mol)各0.化L，P(20pmol )0.3化，由上海基康生物技术有限公司合成;无菌双蒸水6.96y U自制。
[0044] 扩增条件为：
[0045]
[0046] (4)结果判定
[0047] 有扩增曲线出现的即是delta冠状病毒阳性，若无扩增曲线产生，则说明样品中不 含delta冠状病毒。其中扩增曲线CT值小于35的判为阳性，CT值大于35而小于40的判为可 疑，需重复试验。第二次CT值仍在运个范围的判为阳性。
[0048] 本实施例的样品的检测结果见图1和表1。
[0049] 表1待检样品检测结果 「00 加 1 '[0051]试验例1特异性检验 '
' '
[0052] W存在分离毒株JS的病毒液作为阳性对照，同时取猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状 病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒、猪圆环病毒、猪攝病毒、猪伪狂犬病毒的培养液进行 特异性检测，使用实施例1的方法与引物和探针，结果除含有JS毒株的病毒液阳性对照外均 没有扩增曲线(见图2)。
[0053] 试验例2灵敏度检验
[0054] 将实施例1的存在分离毒株JS的病毒液的巧光定量PCR扩增出的产物（186bp，SEQ ID NO. 4)连接到克隆载体pMD 18-T(大连宝生物工程有限公司）制备含有N基因的标准阳性 质粒(pMD-N)，经测定其浓度分别为1.01 X l〇iicopiesAiL。
[0055] 将阳性质粒pMD-N用配置的灭菌双蒸水10倍递增稀释作为模板，每个稀释度各取2 yL作为模板，按实施例1方法进行检测，观察扩增曲线，W出现阳性预期曲线所用模板量的 最高稀释度计算其敏感性，结果表明最小检出量为1.01 X 102。
[0056] W上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种荧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID N0:GPSEQIDN0:2K*。2. -种荧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的探针，其特征在于，所述探针如SEQ ID NO: 3所示。3. 根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的探针，其特征在于，所述 探针的5 '端和3 '端分别标记有FAM和BHQ1。4. 权利要求1所述的荧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的引物、或权利要求2或3所述 的检测猪delta冠状病毒的探针在制备检测猪delta冠状病毒的试剂盒中的应用。5. -种荧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权 利要求1所述的检测猪delta冠状病毒的引物、以及权利要求2或3所述的检测猪delta冠状 病毒的探针。6. 根据权利要求5所述的荧光定量PCR检测猪del ta冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒还包括RT预混液1、RT预混液2、Realtime PCR Master Mix及无菌蒸馏水。7. 根据权利要求6所述的荧光定量PCR检测猪del ta冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所 述RT预混液1包括随机引物和dNTP mix;RT预混液2包括反转录缓冲液、RNA酶抑制剂、反转 录酶和不含RNA酶的双蒸水。8. -种荧光定量PCR检测猪delta冠状病毒的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的 检测猪delta冠状病毒的引物、以及权利要求2或3所述的检测猪delta冠状病毒的探针，包 括以下步骤：以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，再进行荧光定量PCR扩增反应， 收集荧光信号，绘制曲线； 其中，所述反转录步骤为:将RNA与RT预混液1混匀，65 °C反应5min，然后迅速置于冰上 2min，再加入到RT预混液2中，混匀后进行PCR扩增反应，所述PCR扩增的反应程序为：30°C lOmin; 42°C60min; 70°C 15min;反转录体系中，RT预混液 1 的成分为：Ramdom 9mer和dNTP mix各lyL;RT预混液2的成分为：5XPrimeScirpt Buffer 4yL，Rnase Inhibitor 0.5yL， PrimeScript Reverse Transcriptase lyL，Rnase free H2O 4.5yL； 所述荧光定量PCR扩增反应的反应体系为： THUNDERBIRD Probe qPCR Mix 10pL 5〇xRDX reference dye 0:04 μ.Ε SEQ ID NO; 1 0.3μL SEQ IDNO:2 0 3pL SEQ ID NO:3 0 3pL cDNA 2pL Rnase Free H20 加至 20|iL; 所述荧光定量PCR扩增反应的反应程序为:95°C20s;然后95°C5s，55°C4s，72°C3〇S，共 进行40次循环;72°C时收集荧光。
【文档编号】C12Q1/68GK105925729SQ201610509065
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】王东东, 田小艳, 潘永飞, 李春梅, 宋延华
【申请人】广东温氏食品集团股份有限公司