纳米级透明质酸提纯工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种纳米级透明质酸提纯工艺，包括以下步骤：(1)将发酵液采用三氯乙酸调节pH至4.5?5.5，加入絮凝剂絮凝后，过滤，得到滤液；(2)将滤液采用硅藻土脱色，然后采用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0?6.5，再经乙醇沉淀，得到乙醇沉淀物；(3)将乙醇沉淀物用0.05?0.15mol/L氯化钠溶液溶解后，加入络合剂进行络合沉淀，沉淀物用盐解离，过滤，滤液再经乙醇沉淀，最后将沉淀物经脱水，干燥；(4)将干燥后的沉淀物进行超细研磨即得。本发明纳米级透明质酸提纯工艺，采用絮凝剂絮凝、硅藻土脱色去除透明质酸中的杂质，添加剂常见易得，操作相对简单，杂质含量更低。生产易于控制，适合工业化大规模生产，收率高，并且大大降低了生产成本。
【专利说明】
纳米级透明质酸提纯工艺
技术领域
[0001] 本发明涉及生物多糖提取技术领域，具体涉及一种纳米级透明质酸提纯工艺。
【背景技术】
[0002] 透明质酸即玻璃酸（Sodium Hyaluronate)、玻尿酸，简称HA，是一种酸性粘多糖。 其分子结构是由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过β-l，4和β-l，3糖苷键反复交替连接而 成，分子量在10万至400百万之间。分子中两种单糖即β-D-葡萄糖醛酸(glucuronicacid)和 N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine)按1:1的摩尔比组成。
[0003] 自然界中，透明质酸广泛的存在于动物的各种组织内，如结缔组织、肪带、皮欣、关 节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡赃、兔卵细胞、动脉和静脉壁。其中以哺乳动物的玻璃 体、挤带和关节滑液屮透明质酸产量最高。在这些组织中，透明质酸长与蛋白质结合，并与 其它點多糖共存，以溶解的形式存在于玻璃体和滑液中，而以凝胶的形式存在于鸡冠与肪 带中。
[0004] 透明质酸具有很大粘性，对骨关节具有润滑作用。还能促进物质在皮肤中的扩散 率、调节细胞表面和细胞周围的〇& 2+，1%2+，1(+，似+离子运动。在组织中的强力保水作用是其 最重要的生理功能之一，故被称为理想的天然保湿因子，其理论保水值高达800ml/g，在结 缔组织中的实际保水值为80ml/g。此外，透明质酸还有促进纤维增生、加速创伤愈合作用。
[0005] 透明质酸作为药物主要应用于眼科治疗手术，如晶体植入、摘除，角膜移植，抗青 光眼手术等，还用于治疗骨关节炎、外伤性关节炎和滑囊炎以及加速伤口愈合。透明质酸在 化妆品中的应用更为广泛，它能保持皮肤湿润光滑、细腻柔嫩，富有弹性，具有防皱，抗皱、 美容保健和恢复皮肤生理功能的作用。
[0006] 目前微生物发酵法生产透明质酸采用的工艺发酵周期长、产物相对分子量低、产 品透光率差、蛋白质含量高、葡萄糖醛酸含量低。有的透明质酸的形态为纤维状，不易溶解。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种纳米级 透明质酸提纯工艺。
[0008] 本发明目的是通过如下技术方案实现的：
[0009] -种纳米级透明质酸提纯工艺，包括以下步骤：
[0010] (1)将发酵液采用三氯乙酸调节pH至4.5-5.5,加入絮凝剂絮凝后，过滤，得到滤 液；
[0011] (2)将滤液采用硅藻土脱色，然后采用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0-6.5,再 经乙醇沉淀，得到乙醇沉淀物；
[0012] (3)将乙醇沉淀物用0.05-0.15mol/L氯化钠溶液溶解后，加入络合剂进行络合沉 淀，沉淀物用盐解离，过滤，滤液再经乙醇沉淀，最后将沉淀物经脱水，干燥；
[0013] (4)将干燥后的沉淀物进行超细研磨即得。
[0014] 优选地，所述的步骤（1)中絮凝剂的添加量为15-25mg/L，絮凝温度为60-80°C，絮 凝时间为40_50min。
[0015] 优选地，所述步骤（1)中絮凝剂为海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸中一种或多种的 混合物。
[0016] 更优选地，所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸混合而成，所述 海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸的质量比为(1-3) :(1-3): (1-3)。
[0017]优选地，所述步骤(2)中硅藻土脱色，娃藻土的添加量为5.5-7.5g//L，脱色温度为 65-75 °C，脱色时间为40-50min。
[0018] 优选地，所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:十六烷基三甲基 溴化铵1_5份、氯化十六烷基啦啶1_5份、十二烷基二甲基氯化铵1_5份、水80-100份。
[0019] 优选地，所述步骤(3)中沉淀物用盐解离时，先用0.05-0.15mol/L氯化钠溶液洗涤 2-3次，然后再加入与发酵液等体积的0.4-0.6mol/L氯化钠溶液中搅拌解离16-19小时。
[0020] 优选地，所述脱水采用乙醇脱水。
[0021 ]优选地，所述干燥采用真空干燥，干燥温度为40_60°C，干燥时间为2-4小时。
[0022]本发明纳米级透明质酸提纯工艺，采用絮凝剂絮凝、硅藻土脱色去除透明质酸中 的杂质，添加剂常见易得，操作相对简单，杂质含量更低。生产易于控制，适合工业化大规模 生产，收率高，并且大大降低了生产成本。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。 [0024]实施例中各原料介绍：
[0025]发酵液采用专利申请号：201310351005.4中实施例1的方法制备，其中发酵液中透 明质酸含量为1.17g/L，透明质酸中蛋白质含量为0.025wt%。
[0026]三氯乙酸，CAS 号：76-03-9。
[0027] 硅藻土，CAS号：61790-53-2，采用灵寿县沃源矿产品加工厂提供的型号为WY-200 的食品级硅藻土，粒径325目。
[0028] 氢氧化钠，CAS 号：1310-73-2。
[0029] 乙醇，CAS 号：64-17-5。
[0030] 氯化钠，CAS 号：7647-14-5。
[0031] 海藻酸钠，CAS号：31581-02-9，采用珠海味佳食品添加剂有限公司提供的食品级 海藻酸钠。
[0032]木质素，CAS号：9005-53-2，采用山东高唐多元木质素有限公司提供的纯度为 99.6%的优级品木质素。
[0033] 聚天冬氨酸，CAS号：25608-40-6，采用广东翁江化学试剂有限公司提供的聚天冬 氨酸。
[0034] 十六烷基三甲基溴化铵，CAS号：57-09-0。
[0035] 氯化十六烷基吡啶，CAS号：123-03-5。
[0036] 十二烷基三甲基氯化铵，CAS号：112-00-5。
[0037] 实施例1
[0038] 纳米级透明质酸提纯工艺，包括以下步骤：
[0039] (1)取25L发酵液采用三氯乙酸调节pH至4.7,加热至70°C后加入絮凝剂搅拌混合 均匀进行絮凝，保温30min后真空抽滤，得到24L滤液；
[0040] (2)将24L滤液加热至72°C后添加144g硅藻土，以转速为100转/分搅拌脱色45min 后真空抽滤，得到24L脱色液，用2.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.5，加入72L 95%乙醇沉 淀，得到乙醇沉淀物；
[0041 ] (3)将乙醇沉淀物用25L 0. lmol/L氯化钠溶液溶解，在以转速为300转/分搅拌条 件下加入络合剂，加入络合剂后搅拌5min，再静置1小时后母液上排，沉淀再用O.lmol/L氯 化钠溶液洗涤3次，每次洗涤0 . 1 m ο 1 / L氯化钠溶液用量为1L，然后向沉淀中加入2 5 L 0.5mo 1/L氯化钠溶液中以转速为150转/分搅拌解离16小时，真空抽滤，滤液再经75L 95 % 乙醇沉淀3小时，用无水乙醇脱水后，将沉淀物置于旋转式真空干燥器中，在干燥温度为60 °C下真空干燥3小时，得到干燥后的沉淀物；
[0042] (4)将干燥后的沉淀物采用超细研磨机(超细研磨机为无锡市飞鸣机械有限公司 生产的型号为CXM的超细研磨机)进行超细研磨至500nm。得到实施例1的纳米级透明质酸。 [0043]所述的步骤(1)中絮凝剂的添加量为20mg/L，絮凝温度为70°C，絮凝时间为45min。
[0044] 所述步骤（1)中絮凝剂由海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸按质量比为1:1:1搅拌混 合均匀得到。
[0045] 所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成:十六烷基三甲基溴化铵3 份、氯化十六烷基吡啶3份、十二烷基三甲基氯化铵3份、水91份。将十六烷基三甲基溴化铵、 氯化十六烷基吡啶、十二烷基三甲基氯化铵加入水中搅拌混合均匀即得。
[0046] 实施例2
[0047] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述步骤(1)中絮凝剂由木质素、聚天冬氨酸 按质量比为1:1搅拌混合均匀得到。得到实施例2的纳米级透明质酸。
[0048] 实施例3
[0049] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、聚天冬氨 酸按质量比为1:1搅拌混合均匀得到。得到实施例3的纳米级透明质酸。
[0050] 实施例4
[0051] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、木质素按 质量比为1:1搅拌混合均匀得到。得到实施例4的纳米级透明质酸。
[0052] 实施例5
[0053] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原 料制备而成:氯化十六烷基吡啶4.5份、十二烷基三甲基氯化铵4.5份、水91份。将氯化十六 烷基吡啶、十二烷基三甲基氯化铵加入水中搅拌混合均匀即得。得到实施例5的纳米级透明 质酸。
[0054] 实施例6
[0055] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原 料制备而成：十六烷基三甲基溴化铵4.5份、十二烷基三甲基氯化铵4.5份、水91份。将十六 烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵加入水中搅拌混合均匀即得。得到实施例6的纳 米级透明质酸。
[0056] 实施例7
[0057] 与实施例1基本相同，区别仅仅在于:所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原 料制备而成：十六烷基三甲基溴化铵4.5份、氯化十六烷基吡啶4.5份、水91份。将十六烷基 三甲基溴化铵、氯化十六烷基吡啶加入水中搅拌混合均匀即得。得到实施例7的纳米级透明 质酸。
[0058] 测试例1
[0059] 将实施例1-7得到的纳米级透明质酸得率进行统计。计算方法:得率（％ )=纳米级 透明质酸质量/25L发酵液中透明质酸质量X 100，具体测试结果见表1。
[0060] 表1:成活率结果表
[0062]比较实施例1和实施例2-4,实施例1(海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸复配)得率明 显高于实施例2_4(海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸中任意二者复配）。比较实施例1与实施例 5-7，实施例1 (十六烷基三甲基溴化铵、氯化十六烷基吡啶、十二烷基三甲基氯化铵复配)得 率明显高于于实施例5_7(十六烷基三甲基溴化铵、氯化十六烷基吡啶、十二烷基三甲基氯 化铵中任意二者复配）。
【主权项】
1. 一种纳米级透明质酸提纯工艺，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将发酵液采用三氯乙酸调节pH至4.5-5.5，加入絮凝剂絮凝后，过滤，得到滤液； (2) 将滤液采用硅藻土脱色，然后采用lmol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0-6.5,再经乙 醇沉淀，得到乙醇沉淀物； (3) 将乙醇沉淀物用0.05-0.15mo 1/L氯化钠溶液溶解后，加入络合剂进行络合沉淀，沉 淀物用盐解离，过滤，滤液再经乙醇沉淀，最后将沉淀物经脱水，干燥； (4) 将干燥后的沉淀物进行超细研磨即得。2. 如权利要求1所述的纳米级透明质酸提纯工艺，其特征在于:所述的步骤（1)中絮凝 剂的添加量为15-2511^/1，絮凝温度为60-80°(：，絮凝时间为40-501^11。3. 如权利要求1所述的纳米级透明质酸提纯工艺，其特征在于:所述步骤（1)中絮凝剂 为海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸中一种或多种的混合物。4. 如权利要求3所述的纳米级透明质酸提纯工艺，其特征在于:所述步骤（1)中絮凝剂 由海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸混合而成，所述海藻酸钠、木质素、聚天冬氨酸的质量比为 (1-3):(1 -3):(1-3)。5. 如权利要求1所述的纳米级透明质酸提纯工艺，其特征在于:所述步骤(2)中娃藻土 脱色，硅藻土的添加量为5.5-7.5g/L，脱色温度为65-75°C，脱色时间为40-50min。6. 如权利要求1或3所述的纳米级透明质酸提纯工艺，其特征在于:所述步骤(3)中的络 合剂由下述重量份的原料制备而成：十六烷基三甲基溴化铵1-5份、氯化十六烷基吡啶1-5 份、十二烷基二甲基氯化铵1 _5份、水80_100份。7. 如权利要求1所述的纳米级透明质酸提纯工艺，其特征在于:所述步骤(3)中沉淀物 用盐解离时，先用〇. 05-0.15mol/L氯化钠溶液洗涤2-3次，然后再加入与发酵液等体积的 0.4-0.6mol/L氯化钠溶液中搅拌解离16-19小时。8. 如权利要求1所述的纳米级透明质酸提纯工艺，其特征在于：所述脱水采用乙醇脱 水。9. 如权利要求1所述的纳米级透明质酸提纯工艺，其特征在于：所述干燥采用真空干 燥，干燥温度为40-60°C，干燥时间为2-4小时。
【文档编号】C08B37/08GK105936651SQ201610554133
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】田娟
【申请人】上海新肌生物科技有限公司