贻贝粘蛋白Mgfp-5基因重组表达载体的构建方法及转化菊苣的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种含有贻贝粘蛋白Mgfp?5基因的植物表达载体,其将贻贝粘蛋白Mgfp?5基因与植物表达载体pRI101?AN重组得到表达质粒pRI101?Mgfp,所构建的植物表达载体pRI101?Mgfp含有植物表达所需要的启动子和终止子,适合携带外源基因片段进入植物基因组。本发明以植物作为受体,不仅有着对翻译后的重组蛋白更高的糖基化和磷酸化等比较高级的真核蛋白合成途径,可以增加黏蛋白的粘附性能,而且在规模化生产、安全性和生产成本方面也有较大优势。
【专利说明】
贻贝粘蛋白Mgf p-5基因重组表达载体的构建方法及转化菊苣
技术领域
[0001] 本发明涉及一种适合在菊苣、烟草、拟南芥等双子叶植物中表达含有贻贝粘蛋白输 5基因的表达载体pRI101-Mgfp,属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 贻贝(Mytilus galloprovincialis )属于海洋软体动物门瓣鲍纲,大多数隶属贻 贝科,贻贝足腺能分泌足丝蛋白(mussel foot protein,Mfp)或称贻贝粘蛋白(mussel adhesive protein,MAP),使其能够黏附并固定在外界各种固体表面(基体),尤其是在水环 境下能够展现出强黏附性能。
[0003] 研究发现贻贝足丝蛋白有着特殊的氨基酸组成和结构,多肽链中存在大量的重复 单元,几乎每种多肽链都包含酪氨酸经翻译后羟基化修饰的3,4-二羟基苯丙氨酸残基(多 巴,D0PA),残基的苯酚基团有强的金属螯合能力和与蛋白质等极性聚合物形成强氢键的能 力,可在材料表面产生极强的粘附力。贻贝足丝蛋白是由多种蛋白组成的复合体,目前已鉴 定主要有Mfp-Ι~Mfp-6的6种类型粘附蛋白以及3种胶原蛋白质前体(precollagen, preCoI, preCoI-D, preCoI-P, preCoI-NG)。其中,足丝蛋白Mfp-5主要分布在贻贝足丝盘 与外界基质的接触面上,被认为是贻贝足丝蛋白发挥黏附功能的主要蛋白分子,并且D0PA 的含量最高(25-30%)。
[0004] MAP具有无毒、无害、无免疫原性以及良好生物相容性;具有的高强度、高韧性、防 水及耐腐蚀性等特征。可作为各个研究领域的优质的粘合剂。目前贻贝粘合蛋白主要从天 然贻贝中提取(美国BD公司)获得,但是贻贝天然分泌的蛋白量极少(10 000只贻贝分泌量 约lg蛋白),且极易在短时间内固化,造成其提取成本高、价格昂贵,迫使人们尝试利用基因 工程途径解决贻贝粘合蛋白材料来源短缺的问题,促进其临床应用实现。目前已有报道在 原核生物中转化和表达,但粘附性能不及天然的提取的蛋白,然而利用植物基因工程表达 粘合蛋白目前依然是具有挑战性的研究。
【发明内容】
[0005] 本发明利用植物基因工程构建含有地中海贻贝蛋白(i i』s foot protein 5; Mgfp-5)基因的表达载体pRI101-Mgfp,通过农杆菌 介导法导入到菊苣等植物当中,获得含有输的转基因植株,为植物中表达Mgfp-5蛋白、 用基因工程技术获得优质粘合剂提供了重要的实验材料,也为后期植物表达的重组粘蛋白 的黏附等性能研究奠定基础。
[0006] 本发明实现过程如下: 一种含有贻贝粘蛋白徐基因的植物表达载体,将贻贝粘蛋白徐//^5基因与植物表 达载体PRI101-AN重组得到表达质粒pRI101-Mgfp,所构建的植物表达载体pRI101-Mgfp含 有植物表达所需要的启动子和终止子,适合携带外源基因片段进入植物基因组。
[0007]上述贻贝粘蛋白输//H5基因重组表达载体的构建方法,包括以下步骤: (1) 前期输办4基因保存在PUC57克隆载体上,根据植物表达载体pRI 101-AN的多克隆 位点设计引物,在徐基因5端添加 M/el酶切位点,3 端添加沿Ml酶切位点,其引物序 列为: 正向引物:5 ' -GGAATTCCATATGAGTTCTGAAGAA-3 ' ; 反向引物:5 ' -GGGGTACCCTAATGGTGATGGTG-3 ' ; (2) 将PCR扩增后的反应液和植物表达载体pRIlOl-AN用M/el和双酶切,并将得到 的pRI 101-AN载体片段去磷酸化,纯化回收得到的输/扩5基因片段和pRI 101-AN载体片段用 T4 DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5a,挑取单克隆扩大培养,提取质粒双酶切验证,将阳性 重组质粒命名为pRIl〇l-Mgfp。
[0008]上述的重组表达质粒pRI 101 -Mgf p的遗传转化方法,包括以下步骤: (1) 制备农杆菌LBA4404感受态,然后将重组质粒pRI 101-Mgfp通过冻融法转化到根癌 农杆菌,得到含有徐/扩5基因的根癌农杆菌LBA4404; (2) 将获得的阳性农杆菌LBA4404侵染菊苣获得转徐/扩5基因菊苣; (3 )提取菊苣基因组DNA和RNA通过PCR及RT-PCR鉴定阳性转基因植株。
[0009] 本发明以植物作为受体,不仅有着对翻译后的重组蛋白更高的糖基化和磷酸化等 比较高级的真核蛋白合成途径,可以增加黏蛋白的粘附性能,而且在规模化生产、安全性和 生产成本方面也有较大优势。
【附图说明】
[0010] 图 1 pRI101-Mgfp 载体的构建; 图2为重组质粒双酶切验证; 图3为农杆菌阳性菌落PCR鉴定; 图4为阳性菌落测序比对; 图5为菊苣的遗传转化及转化植株获得; 图6为部分阳性植株PCR检测; 图7为部分转基因植株的RT-PCR检测。
【具体实施方式】
[0011] 本发明含有贻贝粘蛋白徐基因的重组植物表达载体并举例转化受体植株,包 括如下步骤: 1.贻贝粘蛋白徐//^5基因重组表达载体的构建方法 (1)前期输办4基因保存在PUC57克隆载体上,根据植物表达载体pRI 101-AN的多克隆 位点设计引物,在徐基因5端添加 M/el酶切位点,3 端添加沿Ml酶切位点,其引物序 列正向引物:5 ' -GGAATTCCATATGAGTTCTGAAGAA-3 ' ;反向引物:5 ' -GGGGTACCCT AATGGTGATGGTG-3';PCR反应体系fag酶0.5 yl,PCR Buffer 2 μL,正向引物(10 μπιο?/ 1)和反向引物(10 ymol/l)各1.0 μL,模板1.0 yl,ddH20 14.5 μL,总体积20 μL。扩增程 序:95°C预变性5 min;94°C变性40 s,55°C退火40 s,72°C延伸40s,循环34次;72°C延伸10 min。取3μ1 PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并对PCR纯化产物进行M/e I和五 I双酶切,试剂盒纯化回收PCR酶切产物,备用; (2 )用你/31和双酶切植物表达载体pRI 101 -ΑΝ,40μ1体积的酶切反应体系为:
37°C水浴过夜,酶切完成后的产物进行琼脂糖凝胶电泳,切胶回收所需载体pRIlOl-AN 片段,由于M/e I酶切出的突出末端比一般的2个碱基突出末端的连接效率低,所以必须使 用平末端的连接条件,即将PRI101-AN片段进行去磷酸化反应,去磷酸化完成后进行DNA的 纯化回收。50μ1体积的去磷酸化反应体系为:
(3) 回收的物基因片段和pRI 101-ΑΝ载体片段,二者用Τ4 DNA连接酶连接,16°C连 接过夜。体系为:
(4) 将上述连接反应体系转化大肠杆菌DH5a,挑取单克隆扩大培养,提取质粒双酶切验 证(图2),结果显示在260bp处出现特异性条带,对照没有出现。将阳性重组质粒命名为 pRI101-Mgfp; 2. pRI 101-Mgfp转化农杆菌 (1)感受态细胞的制备:在YEB固体培养基上划线培养农杆菌LBA4404单菌落; (a) 农杆菌LBA4404菌液涂在含有利福平(Rif)25mg/1、链霉素(Str)100mg/1的YEB固体 培养基中,28 °C倒置培养2d; (b) 挑取单菌落接种于10ml含YEB液体培养基中Rif25mg/l、Str100 mg/l,28°C,200 rpm 振荡培养; (C)按1:100接种于50ml YEB培养基中扩大培养,待0D6Q()=0.4~0.5时,菌液倒入预冷的 50ml的离心管中,冰浴lOmin,4°C,4 000 rpm,lOmin离心,弃上清,收集菌液,在超净工作台 上倒置lmin; (d) 用10ml预冷的70 mmol/1 CaCh重新悬浮沉淀,冰浴30 min; (e) 4°C,4 000 rpm离心10min,弃上清,加入2ml预冷的70 mmol/1 CaCl2(15%的甘油) 悬浮细胞,分装,-80 °C保存。
[0012] (2)冻融法转化农杆菌 取0· lyg重组质粒pRI101-Mgfp加入到100μΙ的LBA4404感受态细胞中,冰置60-90 min; 液氮速冻5min,迅速取出,28°C水浴热激5min;加入500μ1 YEB液体培养基,28°C,100 rpm培 养2-3h;将菌液均匀涂布在含有Rif (25mg/l)、Str (100mg/l)和Kan( 50mg/l)的YEB固体 培养基上进行筛选;挑取单克隆进行菌液PCR,用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示在 260bp处出现特异性的目标条带(图3),与预期条带大小相符。挑取阳性克隆送进行公司测 序,目的基因序列与Genebank中的序列(GenBank:AY521220.1)100%相同,且插入位点正确 (图4),说明含徐/扩5基因的重组质粒pRI 101 -Mgfp已成功转入到农杆菌LBA4404中。
[0013] 3.菊苣的遗传转化 将测序正确的阳性单菌落培养在相应抗生素的YEB液体培养基中培养至0D6QQ=0.5~ 0.6,备用。
[0014]叶盘转化法:a.用培养好的含有目的基因的LBA4404侵染菊苣叶片lOmin,期间不 停摇晃;b.取出叶片,用无菌的滤纸吸干,然后转移到共培养基MS+6-BA2mg/l+NAA0.2mg/l 中暗培养3d (图5A); c ·将叶片转到筛选培养基MS+6-BA2mg/l+NAA0 · 2mg/l+Kan50mg/l + Cef500 mg/1,置于25±2°C,光/暗16h/8h培养,进行抗性愈伤组织及不定芽的筛选(图5B);d. 将形成的2~3cm抗性芽(图5C)切下转到生根培养基MS+NAA0.2mg/l+Kan50mg/l+Cef500mg/l 上(图5D),置于25 ± 2°C,光/暗16h/8h培养,及时淘汰非转化芽体;待根长1~3cm时,炼苗移 栽(图 5E-5F)。
[0015] 4.转基因菊苣的阳性鉴定 为了验证输办-5基因是否转到菊苣基因组中及转录表达,取菊苣叶片提取全基因组 DNA和RNA并进行PCR及进行RT-PCR鉴定; (1)采用CTAB法从转基因株系中提取叶片的基因组DNA,以野生(未转目的基因的植株 做空白对照)进行PCR检测,具体步骤如下: (a) 取0.2g叶片,液氮充分研磨,加650μ1 2XCTAB 65°C水浴lh期间每隔10 min摇一 次;然后加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),室温放置30 min,12 000 rpm离心10min,取上 清(用减过的枪头,避免破坏基因组DNA),重复一次;上清加入2倍体积-20°C预冷的无水乙 醇,沉淀2h以上,12 000 rpm离心10 min,用70%的无水乙醇洗涤沉淀两次,离心,彻底吸干 乙醇,待干燥后,加入200μ1的ddH20,4°C过夜溶解,置-20 °C保存备用; (b) 为排除目的片段与引物二聚体重叠,根据载体及目的基因的DNA片段,设计引物扩 增约500bp的目标条带。引物序列分别为: 正向引物:5 ' -CCAGGCAATACTTACCACTA-3 ' 反向引物:5 ' -ACTTCTTGTAACCCTTTCTATG-3 ' 反应程序:95°C预变性5min,94°C变性40s,59°C退火40s,72°C延伸40s,34个循环,72 °C延伸lOmin。结果用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示在部分转化的植物中扩增出特异 性条带,而对照没有(如图6),说明徐//H5基因已经整合到植物菊苣当中。
[0016] (2)菊苣总RNA的提取以及进行RT-PCR检测,具体步骤如下: (a) 采用TRIzol试剂法总RNA的提取,具体步骤如下:取0.2g叶片,液氮充分研磨,迅速 转入预冷的1.5ml的EP管中,加入lml TRIzol试剂混匀;15~30°C放置5min,使核酸蛋白复合 物完全分离;4°C,10 000 rpm离心10min,取上清;加0.2ml氯仿盖好管盖,剧烈震荡15s,室 温放置3min;4°C,10 000 rpm离心10 min,样品分三层(底层有机相/中间相/上层无色水 相),RNA存在于水相最上层,转移水相至新EP管,加入0.5ml异丙醇沉淀,4°C,10 000 rpm离 心10 min,取上清;加 lml 75%乙醇(使用DEPC处理过的水配制)洗涤沉淀,4°C,7 500 rpm离 心10 min,弃上清;室温放置晾干,沉淀为RNA,加25~200μ1 DEPC水,55~60°C放置lOmin溶 解,置-8〇°C保存备用; (b) 基因组DNA的去除:往微量离心管中配制下列反应液,体系为50μ1:
37°C反应20-30min,加入50ylDEPC水,加入100μ1的本分/氯仿/异戊醇(25:24:1) 4°C, 12 000 rpm离心10min,取上清,再加入100μ1的氯仿/异戊醇(24:1)充分混匀,4°C,12 000 rpm离心15min,上清加入10μ1的3mol/l的醋酸钠 (Ph 5.2),再加入250μ1的预冷的无水乙 醇,-28°C放置30-60min,4°C,12 000 rpm离心10min回收沉淀,室温干燥,往沉淀加入25~ 200ylDEPC水溶解沉淀,进行电泳检测; (c) RNA反转录cDNA使用TaKaRa的PrimeScriptTMn 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒将RNA反转录为cDNA作为RT-PCR的模板;引物序列为: 正向引物:5 ' -GGAATTCCATATGAGTTCTGAAGAA-3 ' ; 反向引物:5 ' -GGGGTACCCTAATGGTGATGGTG-3 ' 反应程序:95 °C预变性5min,94 °C变性40s,55 °C退火40s,72 °C延伸40s,34个循环,72 °C 延伸10min。结果用1%的琼脂糖凝胶电泳检测(野生的为空白对照),RT-PCR结果显示(图7), 260bp处出现特异性条带,对照没有。结果表明,徐//^5基因能够成功的在菊苣中转录表达。
【主权项】
1. 一种含有贻贝粘蛋白输基因的植物表达载体,其特征在于:将贻贝粘蛋白输 5基因与植物表达载体pRIlOl-AN重组得到表达质粒pRI101-Mgfp,所构建的植物表达载体 pRI101-Mgfp含有植物表达所需要的启动子和终止子,适合携带外源基因片段进入植物基 因组。2. 权利要求1中所述贻贝粘蛋白你·//HS基因重组表达载体的构建方法,包括以下步骤: (1) 前期物基因保存在PUC57克隆载体上,根据植物表达载体pRIlOl-AN的多克隆 位点设计引物,在徐基因5端添加 M/el酶切位点,3 端添加沿Ml酶切位点,其引物序 列为: 正向引物:5 ' -GGAATTCCATATGAGTTCTGAAGAA-3 ' ; 反向引物:5 ' -GGGGTACCCTAATGGTGATGGTG-3 ' ; (2) 将PCR扩增后的反应液和植物表达载体pRIlOl-AN用#办1和^>/31双酶切,并将得到 的pRI 101-AN载体片段去磷酸化,纯化回收得到的输/扩5基因片段和pRI 101-AN载体片段用 T4 DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5a,挑取单克隆扩大培养,提取质粒双酶切验证,将阳性 重组质粒命名为pRIl〇l-Mgfp。3. 权利要求1所述的重组表达质粒pRI 101 -Mgf p的遗传转化方法,包括以下步骤: (1)制备农杆菌LBA4404感受态,然后将重组质粒pRI101-Mgfp通过冻融法转化到根癌 农杆菌,得到含有徐/扩5基因的根癌农杆菌LBA4404; (2 )将获得的阳性农杆菌LBA4404侵染菊苣获得转你基因菊苣; (3 )提取菊苣基因组DNA和RNA通过PCR及RT-PCR鉴定阳性转基因植株。
【文档编号】A01H5/00GK105936916SQ201511006800
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2015年12月30日
【发明人】吕亚维, 王睿劼, 吕玉伟, 杨泽熵, 张雨靖, 王英娟
【申请人】西北大学