一种利用重组枯草芽孢杆菌生产γ-氨基丁酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用重组枯草芽孢杆菌生产γ?氨基丁酸的方法。以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为宿主细胞，通过表达大肠杆菌脱羧酶基因(gadA)或共表达其辅酶磷酸吡哆醛的再生基因(pdxH)，进一步对利用重组菌B.subtilis 168/pHT01?gadA?pdxH全细胞转化谷氨酸合成γ?氨基丁酸的条件进行了优化，其较优条件为：转化缓冲体系为pH 6.5的0.1M Tris?HCl，转化温度35℃，激活剂为5mmol/L Ca2+与5mmol/L Mg2+。在上述条件下，转化24h，生成的GABA浓度达到327g/L，转化体系中L?谷氨酸的残留小于1％。本文所获得的重组菌具有较高的转化效率，具有一定的工业化前景。CGMCC No. 555020111208
【专利说明】
一种利用重组枯草芽孢杆菌生产γ -氨基丁酸的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种生产γ -氨基丁酸，特别是一种微生物催化生产γ -氨基丁酸的方 法。
【背景技术】
[0002] γ-氨基丁酸是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重 要的抑制性神经传达物质，约50%的中枢神经突触部位以GABA为递质。GABA除具有镇静、降 血压和抗惊厥等生理作用外，还在促进动物生长、调节食欲和抗应激方面表现出良好的效 果，受到人们愈来愈多的关注。由于GABA具有良好的生理功效，目前在日本和美国已被广泛 应用于食品、医药和化妆品中。在我国食品行业，国家卫生部于2009年9月27日第十二号公 告批准GABA为新资源食品，其相关的保健制品也在国内保健品市场上快速成长起来。
[0003] 目前，国内GABA的生产主要以化学合成法为主，分离提取法和生物发酵法。化学法 生产的GABA不能用于食品行业，而分离提取法生产GABA受到技术和原材料的限制，虽然可 以小规模产业化生产，但价格一直高居不下，限制了其应用。基于此，微生物催化法生产γ _ 氨基丁酸由于其所用原料安全，生产过程中不引入任何有毒化合物，所得产品绿色无污染， 且安全系数高，越来越引起研究人员的关注。
[0004] 发酵法生产GABA主要是通过谷氨酸脱羧酶对谷氨酸脱羧而生成的，其转化过程需 要磷酸吡哆醛作为其辅酶。发酵法生产GABA的菌株主要有大肠杆菌、乳酸菌，枯草芽孢杆 菌、红曲和霉葡萄汁酵母等。乳酸菌，红曲和霉葡萄汁酵母等野生菌株的转化率均较低，虽 然大肠杆菌转化效率比较高，但生产过程抗生素的添加及后处理过程中内毒素的出去限制 了其应用。莫征杰等尝试运用安全的宿主细胞枯草芽孢杆菌转化GABA，但由于枯草芽孢杆 菌中没有磷酸吡哆醛的再生途径而转化效率较低且转化要求酸性条件，控制pH值为4.5。所 以，我们希望使用基因工程手段来获得一株重组枯草芽孢杆菌，通过液体发酵产生高活力 的L-谷氨酸脱羧酶，增加辅酶磷酸吡哆醛的量而加强菌株对谷氨酸的转化效率。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种利用重组枯草芽孢杆菌生物催化生产γ -氨 基丁酸方法，生产工艺为：
[0006] 以表达L-谷氨酸脱羧酶(gadA)基因的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为生产 菌株，催化缓冲体系为0.謂1^8-!1(：1，？!1为6.5，转化温度35°(：，激活剂为5111111〇1/1^ &2+或 5mmol/L Mg2+〇
[0007] 为了提高催化效率，本发明采用的催化缓冲体系为ο. 1M Tr is-HCl，pH为6.5，转化 温度35°C，激活剂为5mmol/L Ca2+或5mmol/L Mg2+。
[0008] 所述生产菌株在表达L-谷氨酸脱羧酶的基础上共表达磷酸吡哆醛的再生基因 (pdxH)〇
[0009] 所述L-谷氨酸脱羧酶基因（gadA)与其辅酶磷酸吡哆醛的再生基因（pdxH)来源于 大肠杆菌，所述共表达为载体串联表达。
[0010]为了实现本发明的目的，可以使用的载体为ρητο?。
[0011 ]为了提高催化效率，本发明采用的催化缓冲体系为〇. 1M Tris-HCl，pH为6.5，转化 温度35°C，激活剂为5mmol/L Ca2+或5mmol/L Mg2+。
[0012]所述L-谷氨酸脱羧酶基因（gadA)与其辅酶磷酸吡哆醛的再生基因（pdxH)来源于 大肠杆菌。
[0013] 本发明使用的重组枯草芽孢杆菌，于2011年12月08号保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所，菌种保藏编号为CGMCC No. 5550,菌种分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)〇
[0014] 本发明获得的基因工程菌于对照菌B. subtilis 168/pHT01(0.1U/mL)相比，重组 菌B·subtilis 168/pHT01_gadA(86·7U/mL)、Β·subtilis 168/pHT01-gadA_pdxH(88·2U/ mL)CGMCC No.5550均有大幅的提高，高达850倍以上。
[0015] 重组菌B. subtilis 168/pHTOl-gadA和B. subtilis 168/pHTOl-gadA-pdxH的全细 胞催化过程中，在催化反应前期（4h以内），二者的催化效率相当，但是随着催化时间的延 长，带有pdxH基因的重组菌B.subtilis 168/pHTOl-gadA-pdxH的催化效率明显高于 B · subtilis 168/pHTOl-gadA。反应24h时，生成的GABA浓度达到252g/L，比B· subti 1 is 168/^!11'01-8&(^提高了约618/匕
[0016] L-谷氨酸脱羧酶酶活力单位定义:在反应液中，每分钟催化底物生成Ιμπιο?γ-氨 基丁酸所需的酶量为1个活力单位(U)。
[0017] GABA含量的检测:按照国标QB/T 4587-2013进行。
[0018]所述的酶促反应最适催化缓冲体系为〇. 1M Tris-HCl，pH为6.5，转化温度35°C，激 活剂为5111111〇1/1^&2+或5_)1/11% 2+，特别是5111111〇1/11%2+能够使相对转化效率提高21%。 采用最优条件进行了细胞转化，按照添加 L-谷氨酸470g/L的浓度进行全细胞转化，最终 GABA浓度达到357g/L，并且在转化体系中L-谷氨酸的残留小于1 %，这为后续的GABA分离纯 化奠定了良好的基础。
【具体实施方式】
[0019] 1.重组枯草芽孢杆菌基因工程菌的构建
[0020] (1)大肠杆菌gadA和pdxH基因的克隆
[0021] 采用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取大肠杆菌DH5a基因组DNA。以该基因组DNA为 模板，P1和P2为引物，PCR扩增gadA基因，以引物P3和P4为引物扩增pdxH基因。利用PCR产物 回收试剂盒，纯化PCR扩增产物gadA基因片段和pdxH基因片段。将纯化PCR产物与pUCm-T载 体连接，连接反应产物转化大肠杆菌DH5a。涂布蓝白斑筛选平板，选取平板上的白色菌落， 提取其中的质粒，对质粒进行双酶切鉴定，筛选得到重组菌DH5a/pUCmT-gadA和DH5a/ pUCmT-pdxH。提取质粒，送上海生工生物工程有限公司测序；
[0028] (2)表达载体 pHTO 1 -gadA和pHTO 1 -gadA-pdxH的构建
[0029] 采用BamHI和XbaI双酶切pUCmT-gadA和pHTO 1，回收gadA基因片段和pHTO 1片段，T4 连接酶连接回收的片段，转化大肠杆菌DH5a，筛选重组菌DH5a/pHT01-gadA，送上海生工生 物工程有限公司进行测序验证。
[0030] 采用Xbal和Xmal双酶切质粒pUCmT-pdxH和pHTOl-gadA，回收pdxH基因片段和 pHTO 1 -gadA片段。T4连接酶连接后转化大肠杆菌DH5a，筛选重组菌DH5a/pHT01 -gadA-pdxH， 送上海生工生物工程有限公司进行测序验证。
[0031] (3)枯草芽孢杆菌B.subtilis 168的转化
[0032] 将重组质粒 pHTOl-gadA 和 pHTOl-gadA-pdxH 分别转化 B. subtilis 168。
[0033] (4)工程菌Β· subtil is/pHT01-gadA和Β· subtilis 168/pHTOl-gadA-pdxH的表达
[0034] 将工程菌B.subtilis/pHTOl-gadA、B.subtilis 168/pHTO 1-gadA-pdxH和 B. subti 1 i s 168/pHTO 1分别接种至发酵培养基中，于37 °C下，200rpm下振摇培养至对数中 期，加入终浓度lmm〇l/L IPTG诱导6h，离心收集菌体，测定gadA的酶活。同时取等量的菌体 进行工程菌的催化过程分析，考察B. subtil is/pHT01-gadA和B.subtilis 168/pHTOl-gadA-pdxH催化性能的差异。
[0035] 2 .gadA酶活测定
[0036] 取0.5mL发酵液，10000r/min离心5min，去上清液，加0.2mol/L的谷氨酸溶液 (pH4.6) 10mL，于37°C恒温水浴中，200r/min下振荡反应lOmin后，立即沸水浴lOmin终止反 应，10000r/min离心5min，收集上清液;量取1. OmL上清液于三角瓶中，加入39. OmL蒸馏水， 混匀，吸取1. OmL于带塞试管中，加入lmL质量分数6%的苯酚和0.4mL次氯酸钠(活性氯质量 分数彡5.2% )，充分混勾，沸水浴lOmin后冰水浴20min，再加入3. lmL蒸馏水，然后在630nm 处测吸光度；制作γ-氨基丁酸含量与吸光度关系的标准曲线，根据标准曲线和所测吸光 度，计算出酶活。酶活力单位定义:在反应液中，每分钟催化底物生成Ιμπιο?γ-氨基丁酸所 需的酶量为1个活力单位(U)。
[0037] 3.重组枯草芽孢杆菌的催化过程的优化
[0038] 重组菌Β · subti 1 is 168/pHTO Ι-gadA-pdxH接种至发酵培养基中，37 Γ、220r/min 下培养24-30h，至gadA酶活不再增加，8000r/min离心收集菌体备用。
[0039] (1)催化反应体系缓冲液的选择
[0040] 分别用？財.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5的0.謂1^8-!1(：1及0.謂磷酸盐缓冲液 悬浮菌体至体积与离心前发酵液体积相等，考察其对谷氨酸的转化的影响。
[0041] (2)催化反应温度的选择
[0042] 在pH7.0的0.1M Tris-HCl催化反应体系中分别在25、30、35、40、45°(：进行谷氨酸 的转化实验，考察其对谷氨酸的转化的影响。
[0043] (3)金属离子对催化反应的影响
[0044]在ρΗ7·0的0· 1M Tris-HCl催化反应体系中分别加入Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn 2+、Cu2+、Fe2+ 等离子，考察其对谷氨酸的转化的影响。
[0045] 重组菌B. subtilis 168/pHTOl-gadA和B. subtilis 168/pHTOl-gadA-pdxH的全细 胞催化过程中，在催化反应前期（4h以内），二者的催化效率相当，但是随着催化时间的延 长，带有pdxH基因的重组菌B.subtilis 168/pHTOl-gadA-pdxH的催化效率明显高于 B · subtilis 168/pHTOl-gadA。反应24h时，生成的GABA浓度达到357g/L，比B· subti 1 is 168/^!11'01-8&(^提高了约618/匕
[0046] 生物催化缓冲体系为1^8-!1(：1，？!1为6.5-7.5，转化温度32-37°(：，激活剂为3-6mmol/L Ca2+或3-6mmol/L Mg2+，均能获得较高GABA产率，GABA浓度达到270g/L以上，转化 体系中L-谷氨酸的残留小于5%。
[0047] 使用最佳催化缓存体系0.謂1^8-!1(：1，？!1为6.5，转化温度35°(：，激活剂为5111111 〇1/ L Mg2+，L-谷氨酸470g/L的浓度进行全细胞转化，最终GABA浓度达到357g/L，并且在转化体 系中L-谷氨酸的残留小于1 %。
[0048]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种利用重组枯草芽孢杆菌生物催化生产γ-氨基丁酸方法，其特征在于生产工艺 为： 以表达L-谷氨酸脱羧酶（gadA)基因的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)为生产菌 株，生物催化缓冲体系为Tris-HCl，pH为6.5-7.5，转化温度32-37 °C，激活剂为3-6mmol/L Ca2+或3_6mmol/L Mg2+〇2. 权利要求1所述的方法，其特征在于所述生产菌株在表达L-谷氨酸脱羧酶的基础上 共表达磷酸吡哆醛的再生基因（pdxH)。3. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述L-谷氨酸脱羧酶基因（gadA)与其辅酶磷 酸吡哆醛的再生基因（pdxH)来源于大肠杆菌。4. 权利要求2所述的方法，其特征在于所述共表达为载体串联表达。5. 权利要求2或4所述的方法，其特征在于所述载体为pHTOl。6. 权利要求1所述的方法，其特征在于所述催化缓冲体系为0.1M Tris-HCl，pH为6.5， 转化温度35°C，激活剂为5mmol/L Ca2+或5mmol/L Mg2+。7. 权利要求1或6所述的方法，其特征在于所述激活剂为5mmol/L Mg2+。8. 权利要求2所述的方法，其特征在于所述催化缓冲体系为0.1M Tris-HCl，pH为6.5， 转化温度35°C，激活剂为5mmol/L Ca2+或5mmol/L Mg2+。9. 权利要求2或8所述的方法，其特征在于所述催化缓冲体系为0.1M Tris-HCl，pH为 6.5，转化温度35°(：，激活剂为5臟〇1/11%2+。 10 ·权利要求1所述的方法，其特征在于所述gadA的genbank ID:948027，pdxH的 genbank ID:946806〇
【文档编号】C12R1/125GK105936923SQ201610049417
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年1月25日
【发明人】许伟, 张六六
【申请人】江苏纳克生物工程有限公司