一种lgr4基因检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种LGR4基因检测试剂盒，所述试剂盒含有m36b4、mPEPCK、mG6pase、mHNF4a、mChREBP、mSREBP1c、mFAS、mSCD1和mLGR4的引物对。本发明检测灵敏度高，经过本发明试剂盒的检测，得到肝脏糖代谢的关键基因表达以及相关通路的验证，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
【专利说明】
一种LGR4基因检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于2型糖尿病领域，特别涉及一种LGR4基因检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于肥胖、不健康的饮食和生活方式以及人口老龄化等原因，世界各国糖 尿病的发病率急剧增加，死亡率仅次于癌症和心血管疾病，成为威胁人类健康的第三大类 疾病。根据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation,IDF)的最新数据显示， 2014年全世界糖尿病患者已经达到3.8亿;预计到2035年，全球糖尿病患者将达到5.9亿，这 其中，90%-95%是2型糖尿病患者。在我国，糖尿病发病率也日益增高，而且发病人群有年 轻化的趋势。2型糖尿病已成为严重威胁人类生命健康和生活质量的重要疾病之一。
[0003] 肝脏的胰岛素抵抗是导致2型糖尿病的一个重要推动因素，尤其是肝脏的脂肪异 位沉积、内质网应激以及炎症都可能使肝脏发生胰岛素抵抗，进而影响全身的胰岛素敏感 性。有报道给予小鼠或大鼠3天的高脂饮食，在未出现肥胖等全身代谢紊乱的症状之前，即 可诱导出肝脏的胰岛素抵抗，而且肝脏发生胰岛素抵抗之后，会通过肝-脂肪、肝-骨骼肌的 组织对话来影响外周组织的胰岛素敏感性，进而加剧全身的胰岛素抵抗，多项研究表明改 善肝脏的胰岛素抵抗则可以改善这种状况。
[0004] LGRs(Leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled Receptors)，是一 类特别的G蛋白偶联受体家族，是因为其拥有特别大的胞外结构域来识别配体。LGR4又称 GPR48，LGR4基因位于染色体11ρ13-14区段，全长约106kb，含18个外显子，编码951氨基酸， 其中胞外548个氨基酸残基，富含亮氨酸，有5个糖基化位点，又属于糖蛋白激素受体。近年 来，LGR4得到越来越多的重视和研究，LGR4在肿瘤发生、干细胞及组织发育过程中的作用已 开始被逐渐研究和揭示。遗憾的是，目前很少有研究组对LGR4在营养、代谢等方面的功能进 行研究。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种LGR4基因检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏 度高，经过本发明试剂盒的检测，得到肝脏糖代谢的关键基因表达以及相关通路的验证，为 临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
[0006] 本发明的一种LGR4基因检测试剂盒，所述试剂盒含有下列引物对：
[0009] 所述试剂盒还包括DNA提取试剂、R0X染料和PCR缓冲液。
[0010] 所述试剂盒的PCR反应条件为：95°(：158,95°(：158,601€308，共40个循环；95 1€ 5min〇
[0011] 所述试剂盒的PCR反应结束后1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察 并确认条带位置。
[0012] 抽提组织总RNA后先进行逆转录再使用试剂盒。
[0013] 有益效果
[0014] 本发明检测灵敏度高，经过本发明试剂盒的检测，得到肝脏糖代谢的关键基因表 达以及相关通路的验证，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
【附图说明】
[0015] 图1(a)为给予腹腔注射葡萄糖后，小鼠血糖浓度变化；（b)为肝脏中糖异生相关基 因的表达；
[0016] 图2(a)为小鼠肝脏甘油三酯含量；（b)为肝脏组织透射电镜；（c)为肝脏中脂质合 成相关基因的表达；
[0017] 图3 (a)为体内营养水平波动时，肝脏内LGR4表达；（b)、（c)、（d)为不同代谢紊乱动 物模型中，肝脏LGR4表达；
[0018] 实验数据用均数土标准误表示，*P〈0 · 05，**Ρ〈0 · 01，· 001。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0020] 实施例1
[0021] 1.组织总RNA抽提
[0022] (1)组织匀浆:每份肝脏约取20-30mg加入lmLTRIZOL试剂裂解。在冰浴条件下用匀 衆仪勾衆，将样品转移至1.5mL离心管，室温放置5min。
[0023] (2)液相分离：在RNA提取专用通风橱内操作，按0.2mL/mL Trizol的比例加入氯 仿，剧烈振荡混勾后放置于室温2_3min，然后以12000g的转速4°C离心15min。
[0024] (3)RNA沉淀:小心转移上层水相至新的1.5mL离心管，按照1:1的比例加入异丙醇， 放置于室温l〇min后，12000g，4°C，离心15min。
[0025] (4)RNA漂洗：离心后管底出现白色沉淀，去上清，以75 %乙醇（DEPC水配置)漂洗 RNA沉淀，7500g，4°C，离心5min。
[0026] (5)RNA重溶:去除乙醇后，干燥5-10min，将RNA重新溶解于RNase-free的DEPC去离 子水中。
[0027] (6)检测RNA纯度及RNA定量:取lyL样品检测A260和A260/A280。
[0028] 2.逆转录反应
[0029] (1)按照测定的RNA浓度，计算后取一定体积RNA，使RNA总量达到lOOOng，再加入 DEPC水将总体积补至1 OyL，70 °C预变性1 Omin。
[0030] (2)按照下表配制反应体系
[0032] (3)将上述混合液按照42 °C 60min，95 °C 5min的程序逆转录成cDNA。cDNA放置于-20 °C保存。
[0033] 3.Real time PCR
[0034] 反应体系如下：
[0036]将上述体系加入96孔PCR板中，然后放入ABI 7300荧光定量PCR仪中开始荧光定 量。
[0037]反应条件为：
[0039]所有引物序列如下，引物均根据NCBI提供序列设计，并由sangon上海公司合成：
[0042] 4.结果
[0043] (1)全身性敲除LGR4改善小鼠的胰岛素抵抗，抑制肝脏糖异生。
[0044] 通过实验发现，不论是在正常饮食条件下，还是给予高脂喂养，与野生型小鼠相 比，全身LGR4K0小鼠与肝脏糖代谢相关的指标都得到显著改善:腹腔注射葡萄糖耐量试验 (IPGTT)显示其胰岛素抵抗状况得到改善（图la)，对LGR4K0小鼠肝脏进行分子生物学初步 分析的结果显示，与野生型小鼠相比，LGR4K0小鼠的肝脏中PEPCK、G6pas e、HNF4a等糖异生 相关基因受到显著抑制（图lb)。
[0045] (2)全身敲除LGR4减少小鼠肝脏脂质沉积，抑制肝脏脂质合成的基因表达。
[0046] 通过对LGR4K0小鼠与野生型小鼠肝脏组织甘油三酯含量的测定，发现无论是正常 饮食还是高脂喂养情况下，LGR4K0小鼠肝脏内TG含量都显著低于野生型小鼠（图2a)，说明 其肝脏脂质沉积减少，透射电镜结果也显示肝细胞内线粒体增多，脂滴变少（图2b)。 Rea 11 ime PCR结果也显示，与野生型小鼠相比，LGR4K0小鼠的肝脏中ChREBP、SREBP1 c、FAS、 SCD1等脂质合成相关基因的表达受到显著抑制（图2c)。
[0047] (3)机体营养水平及代谢紊乱状况对肝脏LGR4的影响。
[0048]在分析上述结果的同时，综合LGR4K0小鼠的各代谢指标，认为LGR4在肝脏的糖脂 代谢过程中可能发挥了重要的生物学作用。
[0049]进一步分析了体内营养水平充足或缺乏时LGR4在肝脏中的表达情况，发现正常喂 食的老鼠经过长时间禁食(Fasting)以及禁食后再进食6小时(Refed)后，LGR4在肝脏中的 表达发生了非常剧烈的变化（图3a)，这一结果表明LGR4的表达变化与体内的营养水平的波 动存在某种程度的一致性。
[0050] 其次，利用了几种经典的胰岛素抵抗和2型糖尿病的动物模型分析了 LGR4在肝脏 组织中的表达情况。不论是高脂饮食诱导的肥胖小鼠，还是在遗传性肥胖的db/db、ob/ob小 鼠中，与对照组或野生型相比，LGR4在肝脏中的表达水平都是显著升高的（图3b，c，d)。
[0051] 本实施例发现，全身敲除LGR4能改善肝脏胰岛素抵抗引起的一系列代谢紊乱的症 状:LGR4K0小鼠胰岛素敏感性增加，肝糖异生减少;肝脏脂肪沉积减少，脂质合成相关的基 因表达下调。这种改善在高脂喂养引起的代谢紊乱的小鼠模型中表现得尤为明显。这些发 现都提示LGR4可能在肝脏的糖脂代谢中起到重要的调控作用，而肝脏是机体营养物质代谢 的重要器官。此外，对于代谢紊乱的动物模型肝脏中LGR4表达的分析，也证实了机体代谢状 态可能影响肝脏内LGR4的表达。
【主权项】
1. 一种LGR4基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒含有下列引物对： m36b4 F:5 '-AAGCGCGTCCTGGCATTGTCT-3 '； R:5，-CCGCAGGGGCAGCAGTGGT-3，； mPEPCK F:5 '-ATGAAAGGCCGCACCATGTA-3 '； R:5 '-GCACAGATATGCCCATCCGA-3 '； mG6pase F:5 '-GCTGGAGTCTTGTCAGGCAT-3 '； R:5 '-ATCCAAGCGCGAAACCAAAC-3 '； mHNF4a F:5 '-ATGCGACTCTCTAAAACCCTTG-3 '； R:5 '-ACCTTCAGATGGGGACGTGT-3 '； mChREBP F:5 '-AGATGGAGAACCGACGTATCA-3 '； R:5 '-ACTGAGCGTGCTGACAAGTC-3 '； mSREBP1c F:5 '-CGGAAGCTGTCGGGGTAG-3 '； R:5，-GGGAAGTCACTGTCTTGGTTG-3，； mFAS F:5 '-AGAGATCCCGAGACGCTTCT-3 '； R:5，-GCCTGGTAGGCATTCTGTAGT-3，； mSCD1 F:5 '-TTCTTGCGATACACTCTGGTGC-3 '； R:5 '-CGGGATTGAATGTTCTTGTCGT-3 '； mLGR4 F:5 '-TTGTGGGTAACTTCCAGCTGA-3 '； R:5 '-GTGGCATTTGCTGCATCTGTA-3 '。2. 根据权利要求1所述的一种LGR4基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括 DNA提取试剂、ROX染料和PCR缓冲液。3. 根据权利要求1所述的一种LGR4基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒的PCR反 应条件为：95°(：158,95°(：158,60 1€308，共40个循环；951€511^11。4. 根据权利要求3所述的一种LGR4基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒的PCR反 应结束后1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察并确认条带位置。5. 根据权利要求1所述的一种LGR4基因检测试剂盒，其特征在于：抽提组织总RNA后先 进行逆转录再使用试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK105936942SQ201610527682
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】宁光, 张翼飞, 张志国, 姚霜霜, 王计秋
【申请人】上海市内分泌代谢病研究所, 上海交通大学医学院附属瑞金医院