产生重组微生物的方法

产生重组微生物的方法
【专利摘要】本发明提供一种用于在微生物中插入、替换、缺失或以其它方式操控核酸序列以产生重组微生物的遗传工具。值得注意的是，本发明利用同源重组，其是其中核苷酸序列在两个相似或等同的DNA分子之间进行交换的遗传重组的一种类型。因为本发明涉及三个同源重组事件，所以其称为“三重交叉”方法。
【专利说明】产生重组微生物的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2014年1月28日提交的美国临时专利申请案61 /932，737的权益，其 全部内容以引用的方式并入本文中。
[0003] 序列表
[0004] 本申请包括在此同时提交的核苷酸/氨基酸序列列表并且鉴别如下：35,226字节 ASCII (本文）文件，名称为"LT099W01_ST25. txt"，创建于2015年1月28日，其全部内容以引 用的方式并入本文中。
【背景技术】
[0005] 存在精密及变化的遗传工具，用于操控所建立的模式微生物（如大肠杆菌 (Escherichia coli)和啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae))的基因组。然而，对于生 物技术关注的许多其它微生物，只有极其基本的遗传工具是可用的，这使得难以评估并优 化用于医学、化学或工业应用的此类微生物。
[0006] 举例来说，遗传工具缺乏梭菌属(Clostridium)，其包括形成孢子的革兰氏阳性厌 氧菌。如艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)和产气 荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的种是病原性的和/或具有重要医学应用。此外，如 丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii)、 解纤维梭菌(Clostridium celluloyticum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、丁酸 梭菌（Clostridium butyricum)和产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)的种发酵 糖、生物质以及气体以产生各种生物燃料和生化产品。
[0007] 相比于用于模式微生物（如大肠杆菌和啤酒酵母菌）的遗传工具，用于梭菌属 (Clostridium)的现有遗传工具（如ClosTron(Heap，微生物学方法杂志（J Microbiol Meth)，70: 452-464,2007 )，等位基因耦合交换（ACE) (Heap，核酸研究（Nucleic Acids 1^8)，40:659,2012)和反向选择标记(呢，科学公共图书馆综合卷(？1^0呢），8:656051， 2013 ;A1-Hinai，应用环境微生物学（Appl Environ Microbiol)，78: 8112-8121，2012; Cartman，应用环境微生物学（Appl Environ Microbiol)，78:4683-4690,2012;W02010/ 084349))仅允许基本的遗传操控。此外，确实存在的遗传工具通常需要多个步骤以实现期 望的修饰、繁琐的突变体筛选过程和易变的转化步骤。因此，存在对于稳健的遗传工具和操 控非模式微生物(如梭菌属细菌)基因组的的方法的强烈需要。

【发明内容】

[0008] 本发明提供一种用于在微生物中插入、替换、缺失或以其它方式操控核酸序列以 产生重组微生物的遗传工具。具体来说，本发明提供一种产生重组微生物的方法，其包含：
[0009] (a)提供包含遗传元件的微生物，所述遗传元件包含靶核酸T1、靶核酸T2和靶核酸 T3，
[0010] (b)提供DNA构建体，其包含与T1同源的左同源臂LHA1、与T2同源的右同源臂RHA1 和与T3同源的右同源臂RHA2，其中RHA2位于LHA1和RHA1之间，
[0011] (c)使(a)的遗传元件经历与(b)的DNA构建体的同源重组，从而T1与LHA1对准并且 T2与RHA1对准以将LHA1和RHA1之间的DNA构建体的部分(包括RHA2)插入到T1和T2之间的遗 传元件中，以及
[0012] (d)使(c)的遗传元件经历自身同源重组，从而T3与RHA2对准以去除T3和RHA2之间 的遗传元件的部分。
[0013] 在一个实施例中，（a)的遗传元件包含5' -T3-T1-T2-3' ; (b)的DNA构建体包含5'-LHA1-RHA2-RHA1-3';包含有包含5' -T3-T1-RHA2-T2-3'的遗传元件的微生物形成于(c)中； 并且包含有包含5' -T3-T2-3'的遗传元件的微生物形成于(d)中，使得T1从所述遗传元件中 缺失。
[0014] 在一个实施例中，（a)的遗传元件包含5' -T3-T1-T2-3' ; (b)的DNA构建体包含5'-LHA1-RHA2-IS1-RHA1-3'，其中IS1 为插入核酸;包含有包含S'-TS-Tl-RHAS-ISl-TS-S'的遗 传元件的微生物形成于(c)中；并且包含有包含5' -T3-IS1-T2-3'的遗传元件的微生物形成 于(d)中，使得在遗传元件中T1被IS1替换。
[0015] 在一个实施例中，（a)的遗传元件包含5^1^34442-37，其中T1包括T3并且T4为 靶核酸；（b)的DNA构建体包含5' -LHA1RHA2-RHA2-RHA1-3'，其中LHA1包括RHA2;包含有包含 5~TlT3-RHA2-T2-3l勺遗传元件的微生物形成于（c)中；并且包含有包含Υ-Τ1 τ3-Τ2-31 勺 遗传元件的微生物形成于(d)中，使得Τ4从所述遗传元件中缺失。
[0016] 在一个实施例中，（a)的遗传元件包含5' -T1T3-T2-3'，其中T1包括T3; (b)的DNA构 建体包含5/-1^骱1議2-1?骱2-131-1?骱1-3/，其中^^1包括1?说2并且131为插入核酸 ;包含有 包含S^TIts-RHAS-ISI-TS-S'的遗传元件的微生物形成于(c)中；并且包含有包含 IS1-T2-3'的遗传元件的微生物形成于(d)中，使得IS1插入于所述遗传元件中。
[0017] 在一个实施例中，（a)的遗传元件包含57-1^34442-37，其中T1包括T3并且T4为 靶核酸；（13)的0嫩构建体包含5/-1^骱1議2-1?说2-131-1?骱1-3/，其中^^1包括1?骱2并且131 为插入核酸;包含有包含5'-T1T3-RHA2-IS1-T2-3'的遗传元件的微生物形成于(c)中；并且 包含有包含的遗传元件的微生物形成于(d)中，使得在遗传元件中T4被 IS1替换。
[0018] 在一个实施例中，（b)的DNA构建体进一步包含在LHA1上游的反向选择标记CS1和 在LHA1和RHA2之间的正向选择标记PS1以及反向选择标记CS2。在又一实施例中，（c)之后进 行选择表达PS1和选择不表达CS1的步骤并且(d)之后进行选择不表达CS2的步骤。CS1和CS2 可独立地选自由以下各者组成的群组：pheS*、upp、sacB、tetAR、thyA、ccdB、lacY、rpsL、 codA、pyrE、HSTK(thiK)、gatA_l和mazF;并且PS1可以选自由以下各者组成的群组：catP、 tetA(c)、七6七]\1、&&(19、&&(^、&&(^2和61'11113。
[0019] 在一个实施例中，（b)的DNA构建体进一步包含在LHA1上游的反向选择标记CS1和 在LHA1和RHA2之间的正向选择标记PS1。在又一实施例中，（c)之后进行选择表达PS1和选择 不表达CS1的步骤。CS1可以选自由以下各者组成的群组：pheS*、upp、sacB、tetAR、thyA、 ccdB、lacY、rpsL、codA、pyrE、HSTK(thiK)、gatA_l和mazF;并且PS1可以选自由以下各者组 成的群组：carP、tetA(C)、七6七]\1、&&(19、&&(^、&&(^2和61'11113 〇
[0020] 在一个实施例中，LHA1比RHA2长。具体来说，LHA1的长度可等于或大于约1000个碱 基对并且RHA2的长度可等于或小于约300个碱基对。
[0021] 在一个实施例中，LHA1和RHA1每个均比RHA2长。具体来说，LHA1和RHA1每个的长度 可等于或大于约1000个碱基对并且RHA2的长度可等于或小于约300个碱基对。
[0022] 在一个实施例中，微生物为细菌、古细菌、病毒或真菌。举例来说，微生物属于梭菌 属（Clostridium)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、穆尔氏菌属(Moore 11a)、丁酸杆菌属 (Butyribacterium)、布劳特氏菌(Blautia)、产醋酸杆菌属(Oxobacter)、嗜热厌氧杆菌属 (Thermoanaerobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、发酵 单胞菌属(Zymomonas)、梓檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌 属（Salmonella)、沙雷氏菌属（Serratia)、乳杆菌属（Lactobacillus)、乳球菌属 (Lactococcus)、肠球菌属（Enterococcus)、小球菌属（Pediococcus)、链球菌属 (Streptococcus)、酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属汉逊酵母 属（Candida Hansenula)、耶氏酵母属（Yarrowia)、红酵母属（Rhodotorula)、根霉菌属 (Rhizopus)、毛芽胞酵母属（Trichosporon)、油脂酵母属（Lipomyces)、曲霉属 (Aspergillus)、木霉属（trichoderma)、外瓶霉属(Exophila)、毛霉属(Mucor)、芽枝霉属 (〇1&(1〇8。01'；!_11111)、毛平革菌属（？1^1161'0(31^6七6)、克拉迪氏菌属（(^13(1；!_(^11；!_131(^110從）、拟 青霉菌属(Paecilomyces)、足放线病菌属（Scedosporium)、欧菲斯特氏菌属（Ophistoma)、 芽孢杆菌属(Bacillus)、寡养菌属(01 igotropha)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜碳菌属 (Carbophilus)、氢菌属（Hydrogenophaga)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、扎瓦尔金氏菌 属（Zavazinia)、贪铜菌属（Cupravidus)、森丘氏菌属（Senechocystis)、绿屈烧菌属 (Chlorof lexus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌 属(Methylococcus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基球形菌属(Methylosphera)、甲 基暖菌属（Methylocaldum)、甲基孢囊菌属（Methylocystis)、甲基弯曲菌属 (]\^也71〇8；!_而8)、甲焼杆菌属(]\^七11&110匕&(^61'；!_11111)、甲焼球菌属(]\^七11&110(30(3(3118)、产甲焼 菌属（Methanogenium)、甲焼八叠球菌属（Methanosarcina)、甲焼球形菌属 (Methanoshera)、甲焼热菌属（Methanothermobacter)、甲焼丝菌属（Methanotrix)、棒状杆 菌属(Corynebac ter ium)、不动杆菌属(Ac ine tobac ter)、放线菌属(Actinomyces )、拟杆菌 属(8&(^61'；!_0(168)、伯克氏菌属(811^11〇1(161'13)、短杆菌属(8^￥；^3(^61'；!_11111)、火球菌属 (Pyrococcus)、地杆菌属（Geobacter)、土芽抱杆菌属（Geobacillus)、类芽抱杆菌属 (Paenibacillus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas )、栖热 抱菌属（1'1161'11^丨〇83)、嗜热厌氧杆菌属（1'1161'11103紐61'(^3(^61')、链霉菌属（3奸6卩丨01117〇68)、 红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、双叉杆菌 属(8丨：[^(1(^&(^61'；!_11111)、丙酸杆菌属(？1'0卩；!_011；^&(^61'；!_11111)、梭杆菌属$118(^&(^61'；!_11111)、弯 曲杆菌属(0311^71(^3(^61')、韦荣氏球菌属(￥6；!_110116113)、水居菌属(八911；!_11(3013)、节杆菌 属(六!^111'(^3(^61')、莫拉菌属(]\1〇從16113)或嗜冷杆菌属(？87(3111'(^3(^61') 〇
【附图说明】
[0023] 图1为示出其中使用DNA构建体使遗传元件上的DNA的一部分缺失的实施例的示意 图。
[0024] 图2为示出其中使用DNA构建体使遗传元件上的DNA的一部分缺失并且由插入序列 替换的实施例的示意图。
[0025]图3为示出其中使用DNA构建体使遗传元件上的DNA的一部分缺失的实施例的示意 图。
[0026]图4示出其中使用DNA构建体将DNA的一部分插入到遗传元件中的实施例的示意 图。
[0027]图5为示出其中使用DNA构建体使遗传元件上的DNA的一部分缺失的实施例的示意 图。
[0028]图6A为示出其中使用DNA构建体将DNA的多个部分插入到遗传元件中的第一轮多 序列插入循环策略的示意图，。图6B为示出第二轮多序列插入循环策略的示意图。图6C为示 出第三轮多序列插入循环策略的示意图。图6D为示出显示最后一轮多序列插入循环策略的 示意图。在此实施例中，最后一轮包含插入最终序列和去除标记和第一靶核酸序列。
[0029]图7为示出其中DNA构建体和阻抑基因被整合到遗传元件中并且其中阻抑基因的 表达由延长的PS1选择控制的实施例的示意图。
[0030] 图8为示出其中DNA构建体缺乏第二反向选择标记的实施例的示意图。
[0031] 图9为示出其中DNA构建体包含非复制质粒并且缺乏第一反向选择标记的实施例 的示意图。
[0032] 图10为示出其中DNA构建体包含转换线性的DNA并且缺乏第一反向选择标记的实 施例的示意图。
[0033]图11为示出其中DNA构建体包含适合于λ-red重组系统中的较短同源臂的实施例 的示意图。
[0034]图12为示出TXp3质粒特征的示意图。
[0035]图13为示出与DNA构建体(如ΤΧρ3质粒)一起使用的基因组组织的示意图。
[0036] 图14为示出双重交叉重组基因型的示意图。
[0037]图15为示出三重交叉重组基因型的示意图。
[0038]图16为示出用于等位置换(Α)和DNA插入(Β)的示例质粒结构的一组示意图。
[0039] 图17为示出使用质粒ΤΧρ3筛选双重交叉重组体的结果的凝胶图像。
【具体实施方式】
[0040] 本发明提供一种用于在微生物中插入、替换、缺失或以其它方式操控核酸序列以 产生重组微生物的遗传工具。值得注意的是，本发明利用同源重组、其中核苷酸序列在两个 相似或等同的DNA分子之间进行交换的遗传重组的一种类型。然而，与典型方法相比，其涉 及具有2个同源臂的一个阳性和一个阴性的选择标记，本发明一般利用具有三个同源臂的 一个阳性和两个阴性选择标记。如同典型方法一样，本发明仅需要两个选择步骤，但不是在 第一步中筛选第一交叉体和在第二步中用再循环的标记筛选第二交叉体，本发明促使双重 交叉在第一步中直接使用插入核酸上的正向选择标记和构建体主链上的阴性选择标记的 组合。在第二步中，选择标记可以通过第三次交叉事件中的第三同源臂和第二反向可选标 记再循环。因为本发明涉及三个同源重组事件，所以其可以称为"三重杂交"方法。
[0041] 本发明提供优于本领域中已知方法的许多优点。举例来说，本发明允许在任何位 点处对基因组进行修饰。相比之下，如ACE的方法限制在特定预定位点处（例如，在pyrE/ pyrF轨迹处或在先前修饰基因组中的位点处)对基因组进行修饰。本发明也允许使用单系 统进行整合、缺失和/或突变(例如，移码，SNP)，而现有方法需要多个系统的组合以实现相 似的结果，如ClosTron/同源重组或FRT/Cre-Lox。本发明允许对基因组进行"无痕"修饰，而 没有留下人工产物，如残余碱基对或选择标记。此外，本发明不需要制备或"引发"微生物的 基因组，使得相比于如在Argyos，应用与环境微生物学(ApplEnviron Microbiol)，77: 8288-8294,2011中描述那些方法，其可以直接在野生型基因组上执行。此外，本发明导致在 非靶位点处的零或最小的非所期望的整合，这可以是现有方法(如ClosTron)的问题。最后， 本发明在大多数条件下实现几乎100%效率。换句话说，相比于现有方法的低至10%的效 率，根据本发明制备并且选择的几乎所有的微生物展现出期望的重组。
[0042] -般来说，本发明提供一种产生重组微生物的方法，其包含：
[0043] (a)提供包含遗传元件的微生物，所述遗传元件包含靶核酸T1、靶核酸T2和靶核酸 T3，
[0044] (b)提供DNA构建体，其包含与T1同源的左同源臂LHA1、与T2同源的右同源臂RHA1 和与T3同源的右同源臂RHA2，其中RHA2位于LHA1和RHA1之间，
[0045] (c)使(a)的遗传元件经历与(b)的DNA构建体的同源重组，从而T1与LHA1对准并且 T2与RHA1对准以将LHA1和RHA1之间的DNA构建体的部分(包括RHA2)插入到T1和T2之间的遗 传元件中，以及
[0046] (d)使(c)的遗传元件经历自身同源重组，从而T3与RHA2对准以去除T3和RHA2之间 的遗传元件的部分。
[0047] 所述方法的变形可以用于在微生物中插入、替换、缺失或以其它方式操控核酸序 列以产生重组微生物。
[0048] 本发明可以用于从微生物中使核酸(例如，T1)缺失。在一个实施例中，本发明提供 一种产生重组微生物的方法，其包含：
[0049] (a)提供包含遗传元件(其包含5' -T3-T1-T2-3')的微生物，
[0050] (b)提供包含5' -LHA1-RHA2-RHA1-3'的DNA构建体，
[0051 ] (c)使(a)遗传元件经历与(b)的DNA构建体的同源重组，从而T1与LHA1对准并且T2 与RHA1对准以将LHA1和RHA1之间的DNA构建体的部分(包括RHA2)插入到T1和T2之间的遗传 元件中，以形成包含有包含5' -T3-T1-RHA2-T2-3'的遗传元件微生物，以及 [0052] (d)使(c)的遗传元件经历自身同源重组，从而T3与RHA2对准以去除T3和RHA2之间 的遗传元件的部分以形成包含有包含5' -T3-T2-3'的遗传元件的微生物，以使得T1从遗传 元件中缺失。
[0053] 所述实施例示出在图1中。位于RHA2和RHA1之间的任何碱基对将插入到遗传元件 中。当在DNA构建体上RHA1和RHA2彼此紧邻时，此实施例可以用于使T1缺失而不会在所得 DNA序列中留下任何残余碱基对。此方法称为"无痕"缺失。DNA构建体可任选地含有一种或 多种选择标记，如CS1、PS1和CS2。在步骤(c)之后不选择CS1和选择PS1选择其中DNA构建体 的期望的部分整合到遗传元件中的微生物。在步骤(d)之后不选择CS2选择已经经历期望的 自身同源重组的微生物。位于LHA1和RHA1之间（但不包括LHA1和RHA1)的DNA构建体的部分 可以称为核酸盒序列(NS1)。在图1中，NS1包含5' -PS1-CS2-RHA2-3'。
[0054]本发明可以用于用不同的核酸(例如，IS1)替换微生物中的核酸（例如，T1)。在一 个实施例中，本发明提供一种产生重组微生物的方法，其包含：
[0055] (a)提供包含遗传元件(其包含5' -T3-T1-T2-3')的微生物，
[0056] (b)提供包含S'-LHAl-RHAS-ISl-RHAl-S'的DNA构建体，其中IS1为插入核酸，
[0057] (c)使(a)遗传元件经历与(b)的DNA构建体的同源重组，从而T1与LHA1对准并且T2 与RHA1对准以将LHA1和RHA1之间的DNA构建体的部分(包括RHA2)插入到T1和T2之间的遗传 元件中，以形成包含有包含5' -T3-T1-RHA2-T2-3'的遗传元件的微生物，以及
[0058] (d)使(c)的遗传元件经历自身同源重组，从而T3与RHA2对准以去除T3和RHA2之间 的遗传元件的部分，以形成包含有包含5'-T3-T1-RHA2-IS1-T2-3'的遗传元件的微生物，使 得在遗传元件中T1被IS1替换。
[0059] 此实施例示出在图2中。位于RHA2和RHA1之间的任何碱基对将插入到遗传元件中。 当在DNA构建体上IS1紧邻于RHA2时，此实施例可以用于使T1缺失并且同时插入IS1(即，用 IS1替换T1)而不会在所得DNA序列中留下任何残余碱基对(无痕）ANA构建体可任选地含有 一种或多种选择标记，如CS1、PS1和CS2。在步骤(c)之后不选择CS1和选择PS1选择其中DNA 构建体的期望的部分整合到遗传元件中的微生物。在步骤(d)之后不选择CS2选择已经经历 期望的自身同源重组的微生物。位于LHA1和RHA1之间（但不包括LHA1和RHA1)的DNA构建体 的部分可以称为核酸盒序列(NS1)。在图2中，NS1包含5'-PS1-CS2-RHA2-IS1-3'。
[0060] 在此实施例的变型方案中，包含T1和IS1两者的中间物微生物可以通过对于PS1的 恒定选择而保持。此方法能够观察T1和IS1对微生物表现型的影响。对于PS1的恒定选择意 指经历第三次自身同源重组事件的任何微生物将不能够存活。在一个具体实施例中，T1为 其的表达导致产生一种形式的产物的基因并且IS1包含其的表达导致产生不同形式的产物 的基因。举例来说，不同形式的产物可以是不同的立体异构体，具有不同的官能团或具有不 同的辅因子或底物特异性。当微生物包含遗传元件(其包含两个基因）时，可以观察到两种 产物在反应混合物中的影响。在一个实施例中，T1编码对2，3-丁二醇的R立体异构体编码的 基因并且IS1编码对内消旋_2,3_ 丁二醇立体异构体编码的基因。术语"内消旋_2,3_ 丁二 醇"是指2,3_ 丁二醇的（S，R)和(R，S)立体异构体两者。当遗传元件包含两个基因时，可以观 察到具有两种立体异构体存在于反应混合物中的的影响。去除对于PS1的恒定选择将允许 微生物经历第三次自身同源重组事件。
[0061] 在此实施例的另一变型方案中，表达T1的微生物的培养物可以被转变为缺乏T1的 表达。起初，T1可以通过对于PS1的选择而保持，并且然后，随后，T1可以通过停止选择PS1经 由自身同源重组而缺失。微生物的培养物将由所有微生物表达T1的群体转变为一些微生物 表达T1的群体，转变为没有微生物表达T1的群体。若T1的缺失对微生物的生长没有显著的 不利影响，这将随着时间推移在生物反应器中发生，甚至在没有第二反向选择步骤的情况 下也是如此。若T1的缺失对微生物的生长有不利影响，则保留T1的微生物将过生长所交换 的基因型并且可在反应器中保持优势菌株。当考虑到同源臂的大小时，RHA2应该足够大以 允许在足够高的频率下与T3重组，从而允许随着时间推移由一个基因型转变为另一基因 型。然而此外，RHA2应该足够小，以使重组将不会足够频繁地发生从而当选择PS1时杀死大 部分的细胞。一般来说，与约300bp大小的RHA2大小耦联的约l，000bp大小的RHA1/LHA1提供 效率和细胞生长的良好平衡。对于PS1的选择可以在任何期望的时间处停止。举例来说，当 培养物达到特定的细胞密度或特定的生长期时（例如，当培养物离开稳定期生长并且进入 指数期生长时），可以停止选择PS1。由此，当基因不再赋予生长优势时可以使所述基因缺 失，优化资源的使用。
[0062] 本发明还可以用于阻抑使用诱导型启动子系统的路径。在此实施例中，DNA构建体 可包含阻遏子，其作为NS1的部分被插入到微生物的遗传元件中。对于PS1的选择将选择包 含NS1(包含所述阻遏子）的微生物。停止选择PS1将允许发生第三次自身同源重组事件发 生，不仅去除PS1及任选地CS2，而且去除阻遏基因。此实施例在图7中，其中NS1包含LHA1、 PS1、阻遏子tetR、RHA2、通过tetR转录IS1 (感兴趣的基因）所阻遏的诱导型启动子和RHA1。
[0063] 本发明可以用于从微生物中使核酸(例如，T4)缺失。在一个实施例中，本发明提供 一种产生重组微生物的方法，其包含：
[0064] (a)提供包含遗传元件(其包含5^1^31412-37 )的微生物，其中T1包括T3并且T4 为靶核酸，
[0065] (b)提供包含5' -LHA1RHA2-RHA2-RHA1-3'的DNA构建体，其中LHA1 包括RHA2，
[0066] (c)使（a)的遗传元件经历与（b)的DNA构建体的同源重组，从而T1 (T1T3)与LHA1 (LHA1RHA2)对准并且T2与RHA1对准以将LHA1 (LHA1RHA2)和RHA1之间的DNA构建体的部分(包括 RHA2)插入到Τ1(Τ1Τ3)和T2之间的遗传元件中，以形成包含有包含的遗 传元件的微生物，并且
[0067] (d)使(c)的遗传元件经历自身同源重组，从而T3与RHA2对准以去除T3和RHA2之间 的遗传元件的部分，形成包含有包含5' -T1T3-T2-3'的遗传元件的微生物，以使得T4从遗传 元件中缺失。
[0068] 此实施例示出在图3中。在LHA1上的下标(LHA1rha2)表明LHA1的序列包括RHA2的序 列，以使得LHA1的部分(例如，所述Y部分)与T3同源。在T1上的下标(Τ1Τ3)表明T1的序列包 括Τ3的序列，以使得Τ1的部分(例如，所述3'部分)与RHA2同源。这些嵌套序列的存在允许本 发明方法的附加变形。具体来说，当Τ4被Τ1和Τ2侧接而无需要使Τ1或Τ2缺失时，此实施例允 许使Τ4缺失。位于RHA2和RHA1之间的任何碱基对将插入到遗传元件中。当在DNA构建体上 RHA2紧邻于RHA1时，此实施例可以用于使Τ4缺失而不会在所得DNA序列中留下任何残余碱 基对(无痕KDNA构建体可任选地含有一种或多种选择标记，如CS1、PS1和CS2。在步骤(c)之 后不选择CS1和选择PS1选择其中DNA构建体的所期望的部分整合到遗传元件中的微生物。 在步骤(d)之后不选择CS2选择已经经历期望的自身同源重组的微生物。位于LHA1和RHA1之 间（但不包括LHA1和RHA1)的DNA构建体的部分可以称为核酸盒序列(NS1)。在图3中，NS1包 含5 /-卩51-〇52-1?撤2-3/。
[0069] 本发明可以用于将核酸（例如，IS1)插入到微生物中。在一个实施例中，本发明提 供一种产生重组微生物的方法，其包含：
[0070] (a)提供包含有包含5' -T1T3-T2-3'的遗传元件的微生物，其中T1包括T3，
[0071] (b)提供包含5' -LHA1RHA2-RHA2-IS1-RHA1-3'的DNA构建体，其中LHA1 包括RHA2并 且IS1为插入核酸，
[0072] (c)使（a)的遗传元件经历与（b)的DNA构建体的同源重组，从而Τ1(Τ1Τ3)与LHA1 (LHA1RHA2)对准并且Τ2与RHA1对准以将LHA1 (LHA1RHA2)和RHA1之间的DNA构建体的部分(包括 RHA2)插入到Τ1(Τ1Τ3)和Τ2之间的遗传元件中，以形成包含有包含y-TlT3-RHA2-ISl-T2-3 r 的遗传元件的微生物，以及
[0073] (d)使(c)的遗传元件经历自身同源重组，从而T3与RHA2对准以去除T3和RHA2之间 的遗传元件的部分，形成包含有包含5' -T1T3-IS1-T2-3'的遗传元件的微生物，以使得IS1插 入于遗传元件中。
[0074] 此实施例示出在图4中。在LHA1上的下标(LHA1rha2)表明LHA1的序列包括RHA2的序 列，以使得LHA1的部分(例如，所述Υ部分)与Τ3同源。在Τ1上的下标(Τ1Τ3)表明Τ1的序列包 括Τ3的序列，以使得Τ1的部分(例如，所述3'部分)与RHA2同源。这些嵌套序列的存在允许本 发明方法的附加变形。具体来说，此实施例允许插入IS1而不会使Τ1缺失。位于RHA2和RHA1 之间的任何碱基对将插入到遗传元件中。当在DNA构建体上IS1紧邻于RHA2时，此实施例可 以用于插入IS1而不会在所得DNA序列中留下任何残余碱基对(无痕hDNA构建体可任选地 含有一种或多种选择标记，如CS1、PS1和CS2。在步骤(c)之后不选择CS1和选择PS1选择其中 DNA构建体的所期望的部分整合到遗传元件中的微生物。在步骤(d)之后不选择CS2选择已 经经历期望的自身同源重组的微生物。位于LHA1和RHA1之间（但不包括LHA1和RHA1)的DNA 构建体的部分可以称为核酸盒序列(NS1)。在图4中，NS1包含5'-PS1-CS2-RHA2-IS1-3'。 [0075]本发明可以用于用不同的核酸(例如，IS1)替换微生物中的核酸（例如，T4)。在一 个实施例中，本发明提供一种产生重组微生物的方法，其包含：
[0076] (a)提供包含遗传元件(其包含5~Τ1Τ3-Τ4-Τ2-3〇的微生物，其中T1包括T3并且T4 为靶核酸，
[0077] (b)提供包含5' -LHA1RHA2-RHA2-IS1-RHA1-3'的DNA构建体，其中LHA1 包括RHA2并 且IS1为插入核酸，
[0078] (c)使（a)的遗传元件经历与（b)的DNA构建体的同源重组，从而T1 (T1T3)与LHA 1 (LHA1RHA2)对准并且T2与RHA1对准以将LHA1 (LHA1RHA2)和RHA1之间的DNA构建体的部分(包括 RHA2)插入到Τ1(Τ1Τ3)和T2之间的遗传元件中，以形成包含有包含y-TlT3-RHA2-ISl-T2-3 r 的遗传元件的微生物，以及
[0079] (d)使(c)的遗传元件经历自身同源重组，从而T3与RHA2对准以去除T3和RHA2之间 的遗传元件的部分，以形成包含有包含5' -T1T3-IS1-T2-3'的遗传元件的微生物，以使得在 遗传元件中T4被IS1替换。
[0080] 此实施例示出在图5中。在LHA1上的下标(LHA1RHA2)表明LHA1的序列包括RHA2的序 列，以使得LHA1的部分(例如，所述Y部分)与T3同源。在T1上的下标(Τ1Τ3)表明T1的序列包 括Τ3的序列，以使得Τ1的部分(例如，所述3'部分)与RHA2同源。这些嵌套序列的存在允许本 发明方法的附加变形。具体来说，此实施例允许使Τ4缺失并且同时在遗传元件中插入IS1 (即，用IS1替换Τ4)。位于RHA2和RHA1之间的任何碱基对将插入到遗传元件中。当在DNA构建 体上IS1紧邻于RHA2时，此实施例可以用于插入IS1而不会在所得DNA序列中留下任何残余 碱基对(无痕KDNA构建体可任选地含有一种或多种选择标记，如CS1、PS1和CS2。在步骤(c) 之后不选择CS1和选择PS1选择其中DNA构建体的所期望的部分整合到遗传元件中的微生 物。在步骤（d)之后不选择CS2选择已经经历期望的自身同源重组的微生物。位于LHA1和 RHA1之间（但不包括LHA1和RHA1)的DNA构建体的部分可以称为核酸盒序列(NS1)。在图5中， 吧1包含5/-卩51-〇52-1?撤2-151-3 /。
[0081] 已经发现此实施例具有特定的效用，其中待缺失的序列（T4)与待插入的序列 (IS1)具有高度同源性。若IS1和T1具有高度同源性(例如，若IS1和T1为编码立体异构体的 基因），则重组元件的混合物可以存在-一些具有结合的校正序列（IS1)并且一些具有IS1和 T1之间不期望的交叉。此外，在高度同源性序列比LHA1或RHA1更长情况下，由于通过使用更 长的同源性序列所得到更高的效率，不期望交叉的几率将更高。
[0082] 在第一同源重组事件和第二同源重组事件之后（即，在步骤(c)之后），此实施例实 现高效率产生期望的异双螺旋，其中RHA1已与T2交叉并且LHA1已与T1交叉。其中IS1和LHA1 长度相同，理论上此实施例导致1:1的IS1与RHA1之间的交叉比。通过对于正确整合大小的 PCR筛选，在LHA1和RHA1)处的交叉可以被鉴别并且用于随后的三重交叉(等位置换hPCR可 以可用于分析任何实施例，但其对于基因共有高度同源性的情况特别有用。
[0083]在一个实施例中，本发明的方法可以迭代地执行。举例来说，本发明可以用于将一 个以上的插入核酸序列（131、152、153、154等)顺序地插入到微生物的遗传元件中。此策略 允许选择标记的快速再循环，这使得有可能在下一循环中再次使用先前的选择标记。通过 大大减少选择次数并允许快速顺序整合事件，此实施例相比于现有技术提供许多的优点。 举例来说，使用现有技术方法，将三个基因插入到基因组中对于每个基因而言可需要两周， 并且循环将受限于可用的正向选择标记的数目。若仅有三个标记是可用的，则仅可以执行 三个整合循环。相比之下，本发明的方法对于每个基因整合仅需要约六天并且通过重复使 用标记使得循环无限地重复。
[0084] 此实施例示出在图6a至图6d中。
[0085]图6a示出了第一轮插入，其中IS2和PS2通过同源重组整合到遗传元件中，之后进 行选择PS2和不选择CS1。名称PS2和IS2用于将在此实施例中使用的组分与在其它实施例中 使用的组分区分开来。
[0086]图6b示出了第二轮插入，其中DNA构建体包含与之前插入的序列IS2同源的RH1。 DNA构建体也包含PS3和IS3。双重交叉同源重组事件在LHA1与T1重组并且RHA1与IS2重组的 情况下发生，导致包含两个插入序列以及PS3的重组微生物。选择PS3和不选择CS1将导致具 有期望插入序列的基本上纯的微生物培养物。尽管本文中使用名称CS1，但是应了解的是相 比于在此方法的较早轮中使用的反向选择标记，可以使用不同的反向选择标记。
[0087]图6c示出了第三轮插入的产物，其中IS4和PS4存在于DNA构建体(未示出）上。
[0088] 图6d示出了最后一轮插入，其中RHA2与PS1和CS2-起插入。RHA2与遗传元件在上 的第三靶序列T3同源。也示出了另外的插入序列IS1。对于所述轮，RHA1经设计以与待整合 的最后插入序列（IS4)同源。同源重组事件导致PS1、RHA2、IS1和(任选地)CS2整合至遗传元 件。此序列经历自身同源重组（即，RHA2与T3重组）以得到具有缺失的序列T1和插入的多个 序列（IS1至IS4)的微生物。任选的不选择CS2使得具有期望整合的微生物能够分离。尽管图 6a至图6d示出了使T1缺失并且用IS1-IS4替换，但是将要理解的是本文中所描述方法中的 任一可以以迭代的方式执行以实现对遗传元件期望的缺失、插入、替换或其它操控。
[0089] 本发明还提供使用本发明的方法产生的重组细菌。
[0090] 本发明进一步提供用于执行本发明方法的试剂盒。所述试剂盒可包含(例如)DNA 构建体和/或一种或多种用于选择微生物表达阳性或反向选择标记的微生物的化合物。
[0091] 尽管在文献中存在关于同源重组开始的精确过程的异议，但是普遍接受的是在遗 传元件和DNA构建体两者上的链中的至少一个必须是"带切口的"并且双链结构在一定程度 上必须解开。这导致同源臂(LHA1和RHA1)与靶区域(T1和T2)变成单链并且"曝露"。遗传元 件上的3'链和DNA构建体上的互补5'链之间的同源性(或者反过来)导致LHA1: T1和RHA1: T2 之间的互补碱基配对。此方法有时称为"交叉"并且导致交叉的链中间物被称为霍利迪 (Holliday)连接体，其由两个双链核酸分子构成。中间物霍利迪连接体可以通过剪切并且 重新接合所述交叉链而拆分以得到重组和非重组的异双螺旋。
[0092] 第一同源重组事件(LHA1与T1的重组)和第二同源重组事件(RHA1与T2的重组)之 后进行在所得遗传元件内的第三（自身）同源重组事件。具体来说，第三同源重组事件涉及 RHA2与T3的重组以导致另外的重组异双螺旋。
[0093]当使用微生物的培养物执行本发明的方法时，由于在遗传元件上同源性的区域所 引起的天然不稳定性和将发生同源重组的关联倾向性，含有已经经历第三同源重组事件的 异双螺旋的重组微生物将最终在群体中占主导。因为所得异双螺旋不具有同源性区域，所 以第三/最终同源重组事件是不可逆的。
[0094]术语"遗传元件"是指微生物的核酸。通常，遗传元件包含双链DNA。遗传元件通常 位于微生物内的染色体、质粒、巨型质粒或其它染色体外的DNA上。遗传元件可包含(例如） 基因、基因的一部分、启动子区、基因间区、非编码区、调节区、多基因或其任何组合。如本文 中所描述，遗传元件可包含一种或多种被定义为"T"的核酸(例如，T1、T2、T3、T4)。
[0095]术语"靶核酸"是指位于遗传元件内的核酸序列。靶核酸可包含(例如)基因、基因 的一部分、启动子区、基因间区、非编码区、调节区、多基因或其任何组合。如本文中所描述， 靶核酸可包括!'1323334等中的一者或多者。具体来说，1'1为在遗传元件上与1^!^1同源的 靶核酸，Τ2为在遗传元件上与RHA1同源的靶核酸，并且Τ3为在遗传元件上与RHA2同源的靶 核酸。
[0096]术语"DNA构建体"是指经设计以经历与遗传元件同源重组的核酸。通常，DNA构建 体为双链DNA。在一个实施例中，DNA构建体为质粒或载体。DNA构建体可含有核酸区和/或选 择标记。如本文中所描述，遗传元件可包含被定义为LHA(例如，LHA1)、RHA(例如，RHA1、 RHA2)和IS (例如，I SI、IS2、I S3、IS4)的一种或多种核酸。具体来说，LHA1为在DNA构建体上 与T1同源的左同源臂，RHA1为在DNA构建体上与T2同源的右同源臂并且RHA2为在DNA构建体 上与T3同源的右同源臂。DNA构建体可包含一种或多种被定义为CS(例如，CS1、CS2)和PS(例 如，PS1)的选择标记。此外，DNA构建体可包含一种或多种调节元件、复制起点或多克隆位 点。DNA构建体可以是裸露的核酸、甲基化或未甲基化的核酸或用一种或多种试剂配制以有 助于输送至微生物的核酸。此外，DNA构建体可以是复制或非复制的。
[0097] DNA构建体的"主链"是指经设计以从同源重组或整合事件中排除的DNA构建体的 一部分。在一个实施例中，主链构建体包含反向选择标记以允许不选择其中主链被整合的 微生物。主链可含有革兰氏阴性复制子以允许在革兰氏阴性细菌中的质粒复制。另外地或 可替代地，主链可含有革兰氏阳性复制子以允许在革兰氏阳性细菌中的质粒复制。在一个 实施例中，主链含有革兰氏阳性复制子和革兰氏阴性复制子两者以允许在革兰氏阳性细菌 和革兰氏阴性细菌两者中的质粒复制。
[0098] DNA构建体可被描述为"核酸盒序列"，其是指LHA1和RHA1之间（但不包括LHA1和 RHA1)的DNA构建体的部分。举例来说，根据实施例核酸盒序列可包含5'-RHA2-3'或5'-RHA2-IS1-3'或5'-PS1-RHA2-3'或5'-PS1-CS2-RHA2-3'等。通常，RHA1 紧邻于核酸盒序列的 3'端并且LHA1紧邻于核酸盒序列的5'端。
[0099]术语"同源臂"是指允许DNA构建体和遗传元件之间同源重组的DNA构建体的一部 分。通常，同源臂位于经历与细菌宿主染色体同源重组的人工质粒上。同源臂优选具有与遗 传元件上的靶区域100%的互补性。然而，同源臂可具有与遗传元件上的靶区域小于100% 的互补性，只要它们具有充分的互补性以允许同源重组。可以基于对于给定靶微生物的公 开可用的序列信息设计适当的同源臂。
[01 00]同源臂的大小可影响本发明方法的效率。
[0101] 在一个实施例中，RHA2包含比LHA1和RHA1更少的碱基对，这增加了期望的LHA1/T1 和RHA1/T2重组将发生的几率。尽管更小的RHA2减少期望的RHA2/T3重组将发生的几率，但 是阳性选择步骤和反向选择步骤确保足够数目的微生物经历所有期望的重组步骤。由于最 终的重组是稳定且不可逆的，所以微生物的群体将自然地朝向此平衡移动。CS2整合到遗传 元件中允许不选择还未经历RHA2/T3重组的细胞。若所有的同源臂长度相同，则RHA2/T3重 组将以与LHA1/T1和RHA1/T2重组大致相同的频率发生，以使得较大百分比的微生物（~ 50%)由于1?骱2/^3重组而不是1^1/1'1和1?骱1/^2重组将不整合？31或032。然后，这些微生 物将通过随后的选择步骤而被杀死。
[0102] 在一个实施例中，当相比于LHA1:RHA1比率时，存在RHA2与RHA1或LHA1任一者之间 增加的碱基对比率(本文中表达为RHA2:RHA1或RHA2:LHA1)，并且在一定程度上所述更高的 比率将导致有利的LHA1/RHA1交叉。在一具体实施例中，RHA2包含LHA1或RHA1任一者的约三 分之一数目的碱基对，即，对于RHA2: RHA1或RHA2: LHA1的碱基对比率为约1:3。
[0103] 在一个实施例中，LHA1和RHA1中的至少一者包含约50bp至4，OOObp的核酸序列。在 一个优选实施例中，RHA1和LHA1包含约1，OOObp。一般来说，同源臂越长，重组的效率就越 大。约l，000bp或越大长度的同源臂促进有效的同源重组和选择，同时仍允许DNA构建体的 核酸盒序列适当地地变大。同源臂的大小可以增加至2,000bp或更大，尽管增加同源臂的大 小总体上增加质粒的大小，这限制在DNA构建体中其它核酸(如核酸盒序列）的大小。
[0104] 当RHA2比其它同源臂更短时，由于较大同源臂的更高重组几率/效率，LHA1和RHA1 将具有更高的正确整合频率。因此，更多部分的细胞将整合正向选择标记和反向选择标记 到遗传元件中并且随后在选择过程中存活。尽管理论上可以使用任何长度的RHA2,但是约 50bp至500bp的大小是优选的。举例来说，RHA2的长度可以是约300bp。
[0105] 在RHA2的长度没有差异的情况下，可需要三步选择过程以在合理的时间范围内获 得基本上纯的重组微生物培养物。此过程可包括PS1选择、PS1选择+CS1反向选择和CS2反向 选择。一般需要PS1选择步骤以在期望重组体中富集培养物，从而获得克服较低频率的正确 重组所需要的更高细胞密度。然而，若存在导致具有更高频率的已经经历正确双重交叉的 细胞的培养物的正确重组的合理地高的初始几率，则可以省略此步骤。因此，所述过程可包 括仅PS1选择+CS1反向选择和CS2反向选择。
[0106] 在一个实施例中，DNA构建体为非复制质粒，例如，自杀载体。自杀载体系统在本领 域中是众所周知的并且允许对于革兰氏阴性细菌中基因替代的直接选择(Quandt，基因 (Gene)，127:15-21，1993)。如图9所示，可以设计DNA构建体以使得并未结合包含至少PS1和 RHA2的核酸盒序列(例如，NS1)的任何微生物将不能够存活和/或再生。在另一实施例中，如 图10所示，DNA构建体包含线性的DNA。在这些实施例中，之所以不需要CS1，是因为选择PS1 允许有效的选择包含所期望核酸序列盒的微生物。
[0107] DNA构建体可包含一种或多种选择标记，其赋予适合于人工选择的一种特性或多 种特性并且指示转染或意欲将外源性DNA引入到细胞中的其它程序的成功。选择标记可为 正向选择标记(PS)，其赋予宿主微生物选择性优点（例如，抗生素抗性，其使宿主微生物在 抗生素选择中存活）。可替代地或此外，选择标记可为反向选择标记(CS)，其在选择时消除 或抑制宿主微生物的生长(例如，胸苷激酶，其使得宿主微生物对更昔洛韦（ganciclovir) 选择敏感）。选择标记可为用于在特定属或种(例如，梭菌属或产乙醇梭菌）中表达优化的密 码子。阳性与反向选择标记和阳性与反向选择方法在本领域中是众所周知的。
[0108] 正向选择标记可选自本领域中已知的任何正向选择标记。举例来说，（一或多种） 正向选择标记可独立地选自由以下各者组成的群组:catP、teM(C)、tetM、aad9、aadA、aadA2 和ermB。然而，正向选择标记还可以是任何其它抗生素抗性标记、毒素/抗毒素盒、必需基因 (例如，硫胺生物合成或尿嘧啶生物合成基因）等。正向选择标记的序列一般为公开可获得 的。举例来说，GenBank WP_002570989提供catP的序列、GenBankYP_007078965提供ermB的 序列，且GenBank NP_957551.1提供tetA的序列。表达正向选择标记的微生物可以使用本领 域中已知的任何方法鉴别并选择。举例来说，微生物可以在培养基中或在培养基上培养，所 述培养基含有杀死不表达正向选择标记(例如，抗生素抗性基因/蛋白质）的微生物的毒素 (例如，抗生素）。正向选择标记可位于核酸盒序列中，使得有可能选择其中DNA构建体的核 酸盒序列成功地整合到微生物的遗传元件中的微生物。
[0109]反向选择标记可以选自本领域中已知的任何反向选择标记。举例来说，（一或多 种）反向选择标记可独立地选自由以下各者组成的群组：pheS'upp、sacB、tetAR、thyA、 ccdB、lacY、rpsL、codA、pyrE、HSTK(thiK)、gatA_l和mazF。反向选择标记可为来自细菌毒素 抗-毒素系统中的任何抗毒素组分，其中微生物可包含毒素基因，在所述毒素基因中对应的 抗毒素基因对微生物的存活至关重要。在一个实施例中，抗毒素基因可被引入到毒素-阳性 微生物中，其中抗毒素基因被选择直至毒素基因不再存在。在一个实施例中，DNA构建体包 含至少两种不同的反向选择标记以加快具有同源基因型的培养物的分离和选择。表达反向 选择标记的微生物可以使用本领域中已知的任何方法鉴别并选择。举例来说，微生物可以 在培养基中或在培养基上培养，所述培养基含有仅对那些表达反向选择标记的微生物有毒 性的组分。在一个实施例中，反向选择标记为HSTK并且反向选择方法涉及在培养基中或在 培养基上培养微生物，所述培养基含有鸟苷类似物，如更昔洛韦。含有并且表达编码HSTK的 核酸的微生物在鸟苷类似物存在下将不可存活。因此，存活的微生物被选择为不表达HSTK。
[0110] PheS为两个亚单位蛋白质苯丙胺酸tRNA合成酶的α亚单位，其负责tRNAphe与苯丙 胺酸的氨酰化，这是对微生物中蛋白质产生至关重要的过程。酶催化苯丙胺酸与其同源 tRNA的酰化。所得tRNAphe通过延长因子传送至核糖体，然后随后结合至存在于mRNA上的其 同源反密码子。一旦结合，氨基酸就共价连接至其先前氨基酸，从而增加肽链。
[0111] pheS#编码具有从野生型pheS单个碱基对改变的修饰PheS蛋白质，导致氨基酸取 代。修饰pheS$基因、蛋白质以及使用/产生的方法的全部细节在美国专利申请案61/877， 272中描述，其全部内容以引用的方式并入本文中。在一个实施例中，PheS#来源于产乙醇梭 菌并且具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列和SEQ ID NO: 1的核酸序列。修饰的PheS*具有SEQ ID N0:3的序列。还可以使用pheS$或PheS#的功能等效变异体。
[0112] 当使用PheSl乍为反向选择标记时，对于不表达PheS#的微生物的选择涉及在培养 基中或在培养基上培养微生物，所述培养基含有对-氯苯丙胺酸或另一种苯丙胺酸类似物。 在一个实施例中，苯丙胺酸类似物选自氯苯丙胺酸、氟苯丙胺酸和溴苯丙胺酸。在一个实施 例中，苯丙胺酸类似物选自DL-4-氯苯丙胺酸、对-氯苯丙胺酸、对-氟-L-苯丙胺酸、对_氟_ DL-苯丙胺酸和对-溴-L-苯丙胺酸。含有并表达编码PheS$的核酸的微生物在对-氯苯丙胺 酸或苯丙胺酸类似物存在下将不可存活。
[0113] HSTK为催化以下反应的蛋白质：Thd+ATP-TMP+ADP，其中Thd为脱氧胸苷，ATP为 5'-三磷酸腺苷，TMP为脱Y -磷酸氧胸苷，并且ADP为Y -二磷酸腺苷。HSTK也可以称为批-tk、HSTK、HStk和thiK，所有这些均是指相同的蛋白质。HSTK催化脱氧胸苷的磷酸化。HSTK可 以来源于任何适当的生物体。举例来说，HSTK可以来源于1型单纯疱疹病毒或2型单纯疱疹 病毒(HS-TK)、VZV、CMV、HHV7、HHV7、HHV8或EBV。可替代地，HSTK可为这些HSTK蛋白质中任一 项的功能等效变异体。HSTK蛋白质包括在如GenBank(例如，GenBank AB009254.2)的公共数 据库中描述的那些。在一个实施例中，HSTK包含SEQ ID N0:5的氨基酸序列和SEQ ID N0:4 的核酸序列。还可以使用hstk或HSTK的功能等效变异体。
[0114] 选择标记可以处在一种或多种启动子的控制下。启动子可位于编码选择标记的核 酸内或者启动子可以通过插入核苷酸与编码选择标记的核酸分隔开。这种启动子可为组成 型或诱导型的。可以使用本领域中已知的任何启动子。举例来说，启动子可以是T7噬菌体启 动子、T3噬菌体启动子、T5噬菌体启动子、细菌启动子、合成启动子或任何其它启动子。在一 个实施例中，DNA构建体包含驱动(一或多种)选择标记的表达的强启动子，例如，T3启动子、 T7启动子、PrRNA启动子、Ptrc启动子或任何其它强启动子。除启动子之外，DNA构建体可包 含其它调节元件，如操纵子和/或增强子。
[0115] 可以同时地或连续地执行选择步骤。举例来说，可以使用正向选择标记选择具有 单个交叉事件的微生物，并且随后可以使用反向选择标记选择具有双重交叉事件的微生 物。可替代地，可以同时执行阳性和反向选择。在正向选择标记定位在同源臂之外的DNA构 建体上（在DNA构建体的主链中）的情况下，可以使用正向选择标记选择具有单交叉事件的 微生物，并且随后可以使用反向选择标记选择具有双重交叉事件的微生物。在正向选择标 记定位在同源臂之间的DNA构建体上（在核酸盒序列中）的情况下，可以同时执行阳性选择 和反向选择，因为具有整合到其遗传元件中的正向选择标记并且对反向选择标记有抗性的 任何微生物将已经经历双重交叉事件。
[0116] 在一个实施例中，DNA构建体包含反向选择标记CS1。优选地，CS1位于DNA构建体的 主链上。不选择CS1选择具有仅结合构建体的期望组分(例如，核酸序列盒，但是不是DNA构 建体的主链)的微生物。图1至图5示出包含位于DNA构建体主链上的CS1的DNA构建体。
[0117] 在一个实施例中，DNA构建体进一步包含反向选择标记CS2。优选地，CS2位于LHA1 和RHA2之间。图1至图5示出包含位于LHA1和RHA2之间的DNA构建体上的CS2的DNA构建体。
[0118] 在一个实施例中，DNA构建体包含正向选择标记PS 1。优选地，PS1位于LHA1和RHA2 之间。
[0119] 在一个实施例中，DNA构建体包含反向选择标记CS1和反向选择标记CS2以及正向 选择标记PS1。优选地，CS1位于LHA1的上游(在DNA构建体的主链中）并且CS2和PS1位于LHA1 和RHA2之间。CS2和PS1可以以任何次序布置。举例来说，DNA构建体可包含S^CSS-PSl-S'或 S^PSl-CSS-S'。在一个实施例中，使遗传元件经历与DNA构建体同源重组的步骤之后是选 择表达PS1和选择不表达CS1的步骤，并且使遗传元件经历自身同源重组的步骤之后是选择 不表达CS2的步骤。在此实施例中，CS2结合到中间物微生物中，但是在最终微生物中失去。
[0120] 应了解，包括在DNA构建体上的CS2对于使得所述方法能够得到本发明的重组微生 物来说不是必需的，由于第三/最终同源重组事件的不可逆性质决定了缺乏同源区域的重 组微生物无论如何将最终占主导。
[0121] 应了解，在DNA构建体上的组分(例如，1^1、1?说1、_\2、？31、031、032)的次序是可 变的。通常，DNA构建体包含有序的组分，例如，5' -LHA1-RHA2-RHA1-3'。然而，组分的次序可 以是反向的，例如，5/-1?骱1-1?似2-1^骱1 /-3/。若遗传元件包含（例如）5/-1'14243-3/，则 DNA构建体的组分的反向将导致T2而不是T1的缺失/替换。
[0122] 此外，不同于同源臂的次序，阳性和反向选择标记的次序对系统的功能性来说不 是必需的。DNA构建体可包含以任一次序的PS1和CS2，例如，5~PSl-CS2-3 r或Y-CS2-PS1-3,。
[0123] 在一个实施例中，DNA构建体进一步包含至少一个被定义为IS(例如，IS1、IS2、 IS3、IS4等）用于整合到遗传元件中的插入核酸序列，。插入核酸序列可包括(例如)一个或 多个基因、启动子、调控序列或其它遗传元件并且可以是编码或非编码的。其可包括经设计 以将基因修饰引入至遗传元件中的靶核酸序列的核酸序列，所述基因修饰包括对一种或多 种核苷酸的缺失、添加或取代。在一些实施例中，插入核酸序列可以经设计以（例如)通过基 因与用于下游缺失过程步骤的插入核酸序列的关联导致缺失存在于遗传元件中的基因。
[0124] 在一个实施例中，根据噬菌体Ared重组系统继续进行一个或多个同源重组事件 (Murphy，细菌学杂志（JBacteriol )，180:2063-2071，1998和 Murphy，基因 （Gene )，246:321-330,2000)。使用此系统以将所期望盒整合到遗传元件中，导致高的整合效率并且消除对 CS1的需要，因为DNA将是线性的。另外，LHA1和RHA1同源臂仅需要30bp至70bp长。图11示出 了包含适合于在Ared重组系统中使用的同源臂的DNA构建体。用于使用A red重组系统的示 例性方法和方案在本领域中是已知的（Sharan，自然实验手册(Nat Protoc)，4: 206-223， 2009) 〇
[0125] "内源性"是指核酸或蛋白质存在本发明的重组微生物来源于其的野生型或亲本 微生物中或在其中表达。举例来说，内源性基因为天然存在于本发明的重组微生物来源于 其的野生型或亲本微生物的基因。在一个实施例中，内源性基因的表达可以通过如外源性 启动子的外源性调控元件调控。
[0126] "外源性"是指核酸或蛋白质不存在于本发明微生物来源于其的野生型或亲本微 生物中。在一个实施例中，外源性基因或酶可来源于异源菌株或种并且引入于本发明的微 生物中或在本发明的微生物中表达。在另一实施例中，外源性基因或酶可以人工方式或以 重组方式形成并且引入于本发明的微生物中或在本发明的微生物中表达。外源性核酸可经 调适以整合至本发明细菌的基因组中或以染色体外状态保留于本发明的微生物中，例如在 质粒中。
[0127] "突变"是指本发明微生物中的核酸或蛋白质相比于本发明微生物来源于其的野 生型或亲本微生物而言已经被修饰。在一个实施例中，突变可以是编码酶的基因的缺失、插 入或取代。在另一实施例中，突变可以是酶中的一种或多种氨基酸的缺失、插入或取代。
[0128] 术语"基因修饰"广泛地指微生物的基因组或核酸的操控。基因修饰的方法包括异 源基因表达、基因或启动子插入或缺失、改变的基因表达或灭活、酶工程、定向进化、基于知 识的设计、随机突变诱发方法、基因改组以及密码子优化。此类方法描述于（例如） Sambrook，《分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，冷泉港实验 室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约州冷泉港（Cold Spring 他吐(^，阶），2001;?16丨88，生物技术新见（(：11^(^丨118丨(^6(^11〇1)，22:611-617,2011 ;以 及Park，《蛋白质工程与设计（Protein Engineering and Design)》，CRC出版社（CRC Press)，2010中。
[0129]术语"变异体"包括序列不同于参考核酸和蛋白质的序列(如现有技术中所公开或 本文中例示的参考核酸和蛋白质的序列）的核酸和蛋白质。本发明可以使用变异核酸或蛋 白质实施，所述变异核酸或蛋白质执行与参考核酸或蛋白质基本上相同的功能。举例来说， 变异蛋白质可以执行与参考蛋白质基本上相同的功能或催化与参考蛋白质基本上相同的 反应。变异基因可以编码与参考基因相同或基本上相同的蛋白质。变异启动子可具有与参 考启动子基本上相同的启动一个或多个基因的表达的能力。
[0130]此类核酸或蛋白质在本文中可以称为"功能等效变异体"。举例来说，核酸的功能 等效变异体可包括等位基因变异体、基因片段、突变基因、多态性等。来自其它微生物的同 源基因也是功能等效变异体的实例。这些基因包括在如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌或扬氏梭 菌种中的同源基因，其详情在如Genbank或NCBI等网站上公开可获得。功能等效变异体也包 括其序列由于对于特定生物体的密码子优化而变化的核酸。核酸的功能等效变异体将具有 优选与参考核酸的至少约70%、约80%、约85%、约90%、约95%、约98%或更大的核酸序列 同一性（同源性百分比）。蛋白质的功能等效变异体优选将具有与参考蛋白质的至少约 70 %、约80 %、约85 %、约90 %、约95 %、约98%或更大的氨基酸同一性（同源性百分比）。变 异核酸或蛋白质的功能等效性可以使用本领域中已知的任何方法评估。
[0131] 本文中例示的选择标记的功能等效变异体不必具有与变型的选择标记相同的活 性水平。所需要的只是保持某一水平的期望活性。用于评定本文中例示的选择标记活性的 分析在本领域中是已知的。举例来说，pheS$的功能或活性可以通过测量氨酰化而测试。氨 酰化的速度和pheS$的动力学参数可以用于在利用苯丙胺酸中测试pheS$的活性变化(Kast， 分子生物学杂志（J Mol Biol)，222:99-124,2991)。
[0132] 核酸（包括DNA构建体）可以使用本领域中已知的任何方法传送至本发明的微生 物。举例来说，核酸可以以裸露核酸形式传递，或者可以用一种或多种试剂(例如，脂质体） 配制。核酸可以视情况为DNA、RNA、cDNA或其组合。在某些实施例中，可以使用限制抑制剂 (Murray，《微生物学与分子生物学评论（Microbiol Molec Biol Rev)》，64:412_434， 2000)。附加载体可包括质粒、病毒(包括噬菌体）、粘粒和人工染色体。
[0133] 举例来说，DNA构建体或其它核酸的转化(包括转导或转染)可以通过电穿孔、超声 波处理、聚乙二醇-介导转化、化学或天然素质、原生质体转化、前噬菌体诱导或接合实现 (参见，例如，《分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，冷泉港实 验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约州冷泉港（Cold Spring Harbor，NY)，1989)。对于若干一氧化碳营养型产乙酸菌，电穿孔的使用已有过报导，所述一 氧化碳营养型产乙酸菌包括扬氏梭菌（Koepke，PNAS，107 :13087-13092，2010; W0/2012/ 053905)、产乙醇梭菌（W0/2012/053905)、乙酸梭菌（Clostridium aceticum) (Schiel- Benge 1 sdorf，《合成生物学（Synthetic Biol)》，15:2191-2198,2012)以及伍氏乙酸杆菌 (Acetobacterium woodii)(Strttz.，《应用与环境微生物学（Appl Environ Microbiol)》， 60:1033-1037,1994)。电穿孔的使用在梭菌属中也有过报导，所述梭菌属包括丙酮丁醇梭 菌(Mermelstein，《生物技术(Biotechnol )》，10:190-195，1992)和解纤维梭菌(Jennert， 《微生物学(Microbiol )》，146:3071-3080，2000)。原菌体诱导已对于一氧化碳营养型产 乙酸菌得到证明，所述一氧化碳营养型产乙酸菌包括奠味梭菌（C 1 〇 s t r i d i um scatologenes) (Parthasarathy，在奠味梭菌ATCC 25775中开发基因修饰系统以便产生突 变体（Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants)，硕士项目（Masters Project)，西肯塔基大学 (Western Kentucky University)，2010)，并且接合已针对多种梭菌进行描述，所述梭菌包 括艰难梭菌（Clostridium difficile)(Herbert，FEMS微生物学快报（FEMS MicrobiolLett)，229 :103-110,2003)和丙酮丁醇梭菌(Williams，普通微生物学杂志（J Gen Microbiol)，136:819-826，1990)。
[0134] 在具有活性限制酶系统的某些实施例中，可能有必要在将核酸引入本发明细菌中 之前使核酸甲基化。本发明的重组微生物可以使用有助于DNA构建体甲基化的穿梭微生物 产生。举例来说，穿梭微生物可以是阴性限制的大肠杆菌、芽孢杆菌(Ba CillUS)27r〇dUCt27 或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) ANA构建体的甲基化可以通过将（i)以待引入至亲本 微生物的DNA构建体和（i i)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体引入到穿梭微生物 中；表达甲基转移酶基因；将DNA构建体与穿梭微生物分离；以及将DNA构建体引入到亲本微 生物中来实现。甲基化构建体/载体包含甲基转移酶基因。甲基转移酶基因的表达可以是组 成型或诱导型的。诱导可以通过任何合适的启动子，如诱导型lac启动子，其通过添加乳糖 或其类似物(如异丙基-β-D-硫基-半乳糖苷(IPTG))诱导。其它合适的启动子包括ara、tet、 T7、PtRNA、PrRNA、Ppta/ack或为诱导型、条件型或组成型的任何转录活性启动子。甲基化构 建体/载体可具有对穿梭微生物的身份具有特异性的复制起点，使得存在于甲基化构建体/ 载体上的任何基因都在穿梭微生物中表达。甲基转移酶的表达导致存在于DNA构建体上的 基因甲基化，然后可以使用本领域中已知的任何方法使DNA构建体与穿梭微生物分离。在一 个实施例中，同时分离甲基化构建体/载体和本发明的DNA构建体两者。另外地或可替代地， 可以收集并且在体外使用甲基转移酶以甲基化DNA构建体，所述DNA构建体然后可以被引入 到亲本微生物中。在另一实施例中，将甲基转移酶基因引入到穿梭微生物的基因组中，之后 引入DNA构建体，将DNA构建体与穿梭微生物分离并且将DNA构建体引入到亲本微生物中。在 一个特定实施例中，甲基化构建体/载体为质粒。甲基转移酶可以是本领域中已知的任何甲 基转移酶。举例来说，甲基转移酶可以是枯草杆菌噬(Bacillus subtil is)菌体ΦΤ1甲基转 移酶或在W0 2012/053905中描述的甲基转移酶。此外，本领域中已知的任何类型的构建体/ 载体可以用于产生甲基化构建体/载体，包括(例如)在W0 2012/053905中所描述的甲基化 构建体/载体。
[0135] "微生物"为微观生物，尤其为细菌、古细菌、病毒或真菌。本发明的微生物优选为 细菌。如本文所用，"微生物"的引述应理解为涵盖"细菌"。
[0136] 术语"重组"表示核酸、蛋白质或微生物是基因修饰或重组的产物。一般来说，术语 "重组"是指含有来源于多个来源的遗传物质或由来源于多个来源的遗传物质编码的核酸、 蛋白质或微生物，所述多个来源如两种或更多种不同菌株或物种的微生物。如本文所用，术 语"重组"也可用于描述包含突变核酸或蛋白质的微生物，包括内源性核酸或蛋白质的突变 形式。
[0137] "亲本微生物"是用于产生本发明的重组微生物的微生物。亲本微生物可以是天然 存在的微生物（即，野生型微生物）或已经经过预先修饰的微生物（即，突变体或重组微生 物）。本发明的微生物可以经修饰以表达或过度表达一种或多种在亲本微生物中不表达或 不过度表达的酶。类似地，本发明的微生物可以经修饰以含有亲本微生物所不含的一个或 多个基因。具体来说，亲本微生物可以用根据本发明的方法的DNA构建体转化以产生重组微 生物。
[0138] 术语"来源于"表示核酸、蛋白质或微生物从不同的（例如，亲本或野生型)核酸、蛋 白质或微生物经过修饰或调适，以便产生新的核酸、蛋白质或微生物。此类修饰或调适通常 包括核酸或基因的插入、缺失、突变或取代。一般来说，本发明的微生物来源于亲本微生物。
[0139] 亲本微生物可以是任何类型的微生物，如细菌、古细菌、病毒或真菌。
[0140] 在一个实施例中，亲本微生物为ABE细菌，其为能够产生丁醇、乙醇和丙酮或异丙 醇的革兰氏阳性梭菌的细菌(参见，例如，Keis国际系统与进化微生物学杂志（Int J Syst Evol Microbiol ,51:2095-2103,2001)。在一个实施例中，亲本细菌为ABE细菌并且ABE细菌 选自包含以下各者的群组：丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌（Clostridium saccharobutylicum)和糖乙酸多丁醇梭菌（Clostridium saccharoperbutylacetonicum) 〇 在一个实施例中，亲本微生物为丙酮丁醇梭菌ATCC824(DSM792)或EA 2018(CCTCC Μ 94061)。在另一实施例中，亲本微生物为拜氏梭菌NCIMB8052(ATCC51743)和NRRL Β-593 (DSM 6423)。
[0141 ]在一个实施例中，亲本微生物为肠细菌(Enterobacterium)，其为属于有序肠杆菌 科(Enterobacteriacea)的杆状革兰氏阴性细菌并且能够发酵糖以产生乳酸、乙醇、乙偶 姻、2，3-丁二醇和/或其它产物。在一个实施例中，亲本细菌为肠细菌，其选自包含以下各者 的群组:埃希氏杆菌属、克雷伯氏菌属、发酵单胞菌属、梓檬酸杆菌属、肠杆菌属、沙门氏菌 属和沙雷氏菌属。在一个实施例中，亲本微生物为大肠杆菌、运动发酵单孢菌(Zymomonas mobi 1 is)、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia)、oxtoca克雷伯氏菌（Klebsiella oxtoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。
[0142] 在一个实施例中，亲本微生物为乳酸杆菌，其为属于有序乳杆菌目的革兰氏阳性 乳酸菌并且能够发酵糖以产生乳酸、2,3_ 丁二醇、甲基乙基酮(MEK)、2_ 丁醇和/或其它产 物。在一个实施例中，亲本细菌为乳酸杆菌，所述乳酸杆菌选自包含以下各者的群组:乳酸 杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、小球菌属和链球菌属。在一个实施例中，亲本微生物为短乳杆 菌(Lactobacillus brevis)、奠肠球菌(Enterococcus faecalis)或乳酸乳球菌。
[0143] 在一个实施例中，亲本微生物为真菌或酵母。真菌为真核微生物，其中酵母为特定 亚单位，能够发酵糖以产生乙醇、乙偶姻和/或其它产物。在一个实施例中，亲本微生物为真 囷，所述真囷选自包含以下各者的群组：曲霉属、木霉属、外瓶霉属、毛霉属、牙枝霉属、毛平 革菌属、克拉迪氏菌属、拟青霉菌属、足放线病菌属和欧菲斯特氏菌属。在一个实施例中，亲 本微生物为黑曲霉(Aspargillus niger)或里氏木霉（Trichderma resei)。在一个实施例 中，亲本微生物为酵母，所述酵母选自包含以下各者的群组:酵母菌属、毕赤酵母属、假丝酵 母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属、红酵母属、根霉菌属、毛芽胞酵母属、油脂酵母属、曲霉属、 木霉属、外瓶霉属、毛霉属、芽枝霉属、毛平革菌属、克拉迪氏菌属、拟青霉菌属、足放线病菌 属和欧菲斯特氏菌属。在一个实施例中，亲本微生物为啤酒酵母菌、热带假丝酵母 (Candidia tropicalis)、白色假丝酵母（Candidia albicans)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、黑曲霉或里氏木霉。
[0144] 在一个实施例中，亲本微生物为好氧一氧化碳营养菌，其为自然界中普遍存在的 细菌并且从各种环境中分离，包括如人类（King，自然评论?微生物学（Nat Rev Microbiol)，5:107-118，2007)。关于分类级别，此生理群组是非常不同的，包含不同的门如 d_变形菌门、厚壁菌门或放线菌门（King，自然评论?微生物学(Nat Rev Microbiol)，5: 107-118，2007)。所有这些生物被示出在空气存在下在⑶含量>1 %下生长(King，自然评 论?微生物学(Nat Rev ]\^(^〇1^〇1)，5:107-118,2007)。典型的气体混合由50%0)和50% 空气组成（Cypionka《应用与环境微生物学（Appl Environ Microbiol)，69:1980-1989， 2003)。在一个实施例中，亲本微生物为好氧一氧化碳营养菌，其选自包含以下各者的群组： 芽孢杆菌属、寡养菌属、假单胞菌属、嗜碳菌属、噬氢菌属、分枝杆菌属和扎瓦尔金氏菌属。 在一个实施例中，亲本微生物为嗜一氧化碳寡养菌（Oligotropha carboxydovorans)、 Carbophilus carboxidus、伪黄色·氛菌属（Hydrogenophaga pseudof lava)、分枝杆菌 (Mycobacterium sp.)、駿基脱氢化假单胞菌（Pseudomonas carboxydohydrogena)、假单胞 菌（Pseudomonas sp·)、Zavarzinia compransoris或鳄芽抱杆菌（Bacillus schlegelii) 〇
[0145] 在一个实施例中，亲本微生物为好氧固定C02的微生物，其为能够在氧气存在下用 H2或经由光合成固定C02的细菌。亲本微生物可以是好氧固定C02的微生物，其选自包含贪铜 菌属、森丘氏菌属和绿屈挠菌属的群组。在一个实施例中，亲本微生物为钩虫贪铜菌 (Cupravidus necator)、森丘氏菌属或澄色绿屈烧菌（Chloroflexus auranticus)。
[0146] 在一个实施例中，亲本微生物为甲基营养生物，其为能够使用减少的一碳底物(如 甲烷或甲醇)作为用于生长的碳源的微生物。亲本微生物可以是甲基营养生物，所述甲基营 养生物选自包含以下各者的群组：甲基单胞菌、甲基杆菌、甲基球菌属、甲基微菌属、甲基球 形菌属、甲基暖菌属、甲基孢囊菌属和甲基弯曲菌属。在一个实施例中，亲本微生物为荚膜 甲基球菌(Methylococcus capsulatus)或甲烧氧化菌(Methylosinus trichosporium) 〇
[0147] 在一个实施例中，亲本微生物为产甲烷菌，其为能够减少C02甲进入烷中的 Archeae。亲本微生物可以是产甲烷菌，所述产甲烷菌选自包含以下各者的群组：甲烷杆菌 属、甲烷球菌属、产甲烷菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷球形菌属、甲烷热菌属、甲烷丝菌属。在 一个实施例中，亲本微生物为Methanothermobacter marburgensis或巴氏甲烧八叠球菌属 (Methanosarcina bakeri)〇
[0148] 在一个实施例中，亲本微生物为一氧化碳营养菌，其为能够耐受高浓度一氧化碳 (C0)的微生物。在一个实施例中，亲本微生物能够使用C0作为唯一的碳和能量来源。亲本微 生物可以是选自包含以下种的一氧化碳营养型梭菌属:产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌 (Clostridium ragsdalei )和相关分离株，包括（但不限于）菌株产乙醇梭菌JAI-1T (DSM10061) (Abrini，微生物学文献集(Arch Microbiol )，161:345-351，1994)、产乙醇梭菌 LBS1560(DSM19630)(W0 2009/064200)、产乙醇梭菌LZ1561(DSM23693)、扬氏梭菌PETCT (DSM13528 = ATCC 55383)(Tanner，国际系统细菌学杂志（Int J Syst Bacteriol)，43: 232-236，1993)、扬氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)(美国专利5，593,886)、扬氏梭菌C-01 (ATCC 55988)(美国专利6,368,819)、扬氏梭菌0-52(ATCC 55989)(美国专利6,368,819)、拉氏梭 菌P11T(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055);相关分离株，如"科斯卡塔梭菌（Clostridium coskatii)"（美国公开案2011/0229947);或突变菌株，如扬氏梭菌OTA-1 (Tirado-Acevedo， 使用扬氏梭菌由合成气制备生物乙醇（Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii)，博士论文(PhD thesis)，北卡罗莱纳州立大学(North Carolina State University)，2010)〇
[0149] 这些菌株在梭菌rRNA簇I内形成子簇，并且其16S rRNA基因超过99%-致，具有约 30%的类似低GC含量。然而，DNA-DNA重关联和DNA指纹识别实验显示，这些菌株属于不同物 种(W0 2008/028055)。此簇的菌株由共同特征定义，具有类似的基因型和表型，并且它们全 部共享相同的能量守恒和发酵代谢模式。此外，此簇的菌株缺乏细胞色素并且经由Rnf复合 物保存能量。此簇中的所有种都具有类似的形态和大小(对数生长细胞介于〇. 5-0.7 X 3-5μ m之间），嗜中温(最佳生长温度介于30°C至37°C之间），并且绝对厌氧(Abrini，微生物学文 献集(Arch Microbiol)，161:345-351，1994;Tanner，国际系统细菌学杂志（Int J Syst Bacteriol)，43:232-236，1993;以及W0 2008/028055)。此外，它们全部共享相同的主要系 统发育特性，如相同pH范围(pH 4-7.5，最佳初始pH为5.5-6)，基于含C0气体的自养生长强， 生长速率类似，并且代谢型态类似，以乙醇和乙酸作为主要发酵最终产物，并且在某些条件 下形成少量2,3_丁二醇和乳酸(Abrini，微生物学文献集(Arch Microbiol)，161:345-351， 1994; ΚδρΙκ,生物技术新见（Curr Opin Biotechnol)，22:320-325，2011;Tanner，国际系 统细菌学杂志（Int J Syst Bacteriol),43:232-236，1993;以及W0 2008/028055)。在所有 三个种下也观察到吲哚产生。
[0150] 然而，种间区别在于各种糖(例如，鼠李糖、阿拉伯糖）、酸(例如，葡糖酸盐、柠檬酸 盐）、氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如，甜菜碱、丁醇）的底物利用。此外，发 现一些种对某些维生素(例如硫胺、生物素)是营养缺陷型的，而其它的不是。已发现，负责 气体摄入的伍德-永达尔(Wood-Ljungdahl)途径基因的组织和数量在所有物种中都相同， 尽管核和氨基酸序列存在差异（KSplce,:生物技术新见(〇1^0?丨118丨〇丨6(*11〇1)，22 :320-325，2011)。另外，在一系列这些微生物中已显示羧酸还原为其对应的醇(Perez，生物技术 与生物工程(Biotechnol Bioeng)，110:1066-1077,2012)。因此，这些特点并不是一种微生 物（如产乙醇梭菌或扬氏梭菌)所特有的，而是一氧化碳营养型合成乙醇的梭菌的通用特 点，并且可以预见，尽管它们在性能方面可存在差异但是在这些菌株中的作用机制类似。
[0151] 在一个实施例中，亲本微生物选自梭菌属、醋酸杆菌属、穆尔氏菌属、丁酸杆菌属、 布劳特氏菌、产醋酸杆菌属、嗜热厌氧杆菌属、埃希氏杆菌属、克雷伯氏菌属、发酵单胞菌 属、梓檬酸杆菌属、肠杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、乳酸杆菌、乳球菌属、肠球菌属、小 球菌属、链球菌属、酵母菌属、毕赤酵母属、假丝酵母属汉逊酵母属、耶氏酵母属、红酵母属、 根霉菌属、毛芽胞酵母属、油脂酵母属、曲霉属、木霉属、外瓶霉属、毛霉属、芽枝霉属、毛平 革菌属、克拉迪氏菌属、拟青霉菌属、足放线病菌属、欧菲斯特氏菌属、芽孢杆菌属、寡养菌 属、假单胞菌属、嗜碳菌属、噬氢菌属、分枝杆菌属、扎瓦尔金氏菌属、贪铜菌属、森丘氏菌 属、绿屈挠菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基微菌属、甲基球形菌属、甲基 暖菌属、甲基孢囊菌属、甲基弯曲菌属、甲烷杆菌属、甲烷球菌属、产甲烷菌属、甲烷八叠球 菌属、甲烷球形菌属、甲烷热菌属、甲烷丝菌属、棒状杆菌属、不动杆菌属、放线菌属、拟杆菌 属、伯克氏菌属、短杆菌属、火球菌属、地杆菌属、土芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、分枝杆菌 属、红假单胞菌属、栖热孢菌属、嗜热厌氧杆菌属、链霉菌属、红细菌属、红球菌属、消化球菌 属、双叉杆菌属、丙酸杆菌属、梭杆菌属、弯曲杆菌属、韦荣氏球菌属、水居菌属、节杆菌属、 莫拉菌属或嗜冷杆菌属。
[0152] 在一个实施例中，亲本微生物为一氧化碳营养型产乙酸细菌。产乙酸菌为产生或 能够产生乙酸盐作为厌氧呼吸的产物的微生物。通常，产乙酸菌为使用伍德-永达尔途径作 为其能量守恒和合成乙酰CoA与乙酰CoA衍生产物（如乙酸盐）的主要机制的绝对厌氧细菌 (Ragsdale，生物化学与生物物理学学报（Biochim Biophys Acta)，1784:1873-1898， 2008)。亲本微生物可以是选自包含以下种的一氧化碳营养型产乙酸细菌:产乙醇梭菌、扬 氏梭菌、拉氏梭菌、嗜一氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌 (Clostridium drakei )、奠味梭菌、科斯卡塔梭菌、乙酸梭菌（Clostridium aceticum)、大 梭菌（Clostridium magnum)、梭菌（Clostridium sp.)、齡泥丁酸杆菌属（Butyribacterium limosum)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏乙酸杆菌、巴氏 嗜喊菌(Alkalibaculum bacchii)、产生布劳特氏菌（Blautia producta)、齡泥真杆菌 (Eubacterium limosum)、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌 (Moorella thermautotrophica)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧菌 (Thermoanaerobacter kiuvi)。在一个优选实施例中，亲本微生物为以DSMZ寄存号 DSM10061保藏的产乙醇梭菌，以DSMZ寄存号DSM13528保藏的产乙醇梭菌(ATTC 55383)或以 DSMZ寄存号DSM23693保藏的产乙醇梭菌(称为产乙醇梭菌LZ1561)。
[0153] 本发明的微生物可以经培养以产生一种或多种产物，如乙醇(W0 2007/117157)、 乙酸酯（TO 2007/117157)、丁醇（TO 2008/115080和W0 2012/053905)、丁酸酯（W0 2008/ 115080)、2,3_丁二醇（W0 2009/151342)、乳酸酯（W0 2011/112103)、丁烯（W0 2012/ 024522)、丁二烯（W0 2012/024522)、甲基乙基酮（2-丁酮）（W0 2012/024522和W0 2013/ 185123)、乙烯（TO 2012/026833)、丙酮（W0 2012/115527)、异丙醇（TO2012/115527)、脂质 (TO 2013/036147)、3_羟基丙酸酯（3-HP)(W0 2013/180581)、异戊二烯(W0 2013/180584)、 脂肪酸(W0 2013/191567)、2_丁醇(W0 2013/185123)、1，2_丙二醇(W0 2014/0369152)和 1-丙醇（W0 2014/0369152)。
[0154] 通常，在生物反应器中进行培养。术语"生物反应器"包括由一个或多个容器、塔或 管道布置组成的培养/发酵装置，如连续搅拌槽反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴 流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器或适合气-液接触的其它容器或其它 装置。在一些实施例中，生物反应器可以包含第一生长反应器和第二培养/发酵反应器。可 以向这些反应器中的一个或两个提供底物。如本文所用，术语"培养"和"发酵"可互换地使 用。这些术语涵盖培养/发酵工艺的生长阶段和产物生物合成阶段。
[0155] 通常在含有足以允许细菌生长的营养物、维生素和/或矿物质的水性培养基中维 持培养。优选地，水性培养基是基本厌氧微生物生长培养基。培养基还可以是梭菌属基本培 养基，基本确定成分培养基（MDM)、补充确定成分培养基（SDM)或完全确定成分培养基 (CDM)。培养基可以是PETC培养基。适合的培养基是本领域中已知的并且描述于(例如)美国 专利5，173，429、美国专利5，593，886和W0 2002/008438中。
[0156] 培养/发酵应该理想地在用于产生靶产物的适当条件下进行。考虑的反应条件包 括压力、温度、气体流动速率、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率(若使用 连续搅拌槽反应器）、接种物含量、最大底物浓度和最大产物浓度。
[0157] 术语"底物"是指本发明微生物的碳源和/或能源。所需要底物的类型将取决于微 生物的性质。底物可包含气体，如C0、c〇2、H 2、02和/或N2。底物可包含碳水化合物，如葡萄糖、 果糖、木质纤维素、纤维素或淀粉。
[0158] 实例
[0159] 以下实例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
[0160] 实例 1
[0161] 此实例描述一般材料和方法。
[0162] 产乙醇梭菌DSM10061和DSM23693(DSM10061的衍生物）和扬氏梭菌DSM13528来源 于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心(The German Collection of Microorganisms and CellCultures)，德国布伦瑞克InhoffenstraPe 7 B，38124(Inhoffenstra0e 7 B， 38124 Braunschweig，Germany))。拉氏梭菌ATCC BAA-622来源于ATCC(美国典型培养物保 藏中心（American Type Culture Collection)，美国弗吉尼亚州马纳萨斯20108 (Manassas，VA 20108，USA))。大肠杆菌DH5a来源于英杰公司（Invitrogen)(美国加利福尼 亚州卡尔斯巴德92008(Carlsbad，CA 92008，USA))。
[0163] 大肠杆菌在37°C下在LB(卢里亚-贝尔塔尼（Luria-Bertani))培养基中好氧性生 长。固体培养基含有1.5 %琼脂。
[0165] 使用标准厌氧技术使梭菌菌株在37°C下在pH 5.6的PETC培养基中生长(Hungate， 《微生物学方法(Methods Microbiol)》，3B: 117-132，1969;Wolfe，微生物生理学进展(Adv Microbiol Physiol),6:107-146，1971)。果糖（异养生长)或在顶部空间中30psi含C0的钢 铁厂气体(从新西格兰布鲁克(Glenbrook，NZ)的新西兰钢铁(New Zealand Steel)现场收 集；组成：44%⑶、32%N2、22%C02、2%H 2)(自养生长）用作底物。对于固体培养基，添加 1.2%细菌琼脂粉(BD，美国新泽西州富兰克林湖07417(Frankton Lakes，NJ 07417，USA))。
[0166]

[0172] 本实例表明框内基因缺失或基因插入到产乙醇梭菌的基因组中。
[0173] 使用本发明的实施例实现框内基因缺失或基因插入到产乙醇梭菌的基因组中，所 述实施例包含使用两个反向选择标记、两个选择步骤和三个同源介导的交叉事件。
[0174] 图 12示出 了包含CSl(tet3n〇-mazF)、LHAl、catP、pheS*、RHA2和RHA1 的DNA构建体 (TXp3质粒）。图13示出了在产乙醇梭菌的基因组中遗传元件的组织。同源臂LHA1和RHA1经 设计以分别与Τ1和Τ2重组，从而将LHA1和RHA1之间的DNA整合到Τ1和Τ2之间的产乙醇梭菌 的基因组中。通过选择所述正向选择标记（catP)和不选择所述反向选择标记l(tet3n〇-mazF)，所期望的双重交叉重组事件被非常高效的选择(图14和图17)。
[0175] 一旦双重交叉突变体被纯化并被富集，T3就被允许与RHA2重组以使靶基因 T1缺 失。通过不选择CS2(通过添加氯苯丙胺酸不选择pheSl执行T3和RHA2之间的对于重组事件 的选择(图15)。
[0176] 此系统可以经修饰以根据RHA2同源臂的位置等位置换(A)DNA或将DNA插入(B)到 产乙醇梭菌的基因组中（图16)。
[0177] 实例3
[0178] 此实例表明产乙醇梭菌LZ1561的2,3_丁二醇脱氢酶(2,3-BDH)基因 （SEQ ID N0: 9)的缺失。
[0179] pheS*(SEQ ID NO: 1)用作DNA构建体主链上的反向选择标记并且tet3n〇-mazF (SEQ ID N0:6)用作LHA1(SEQ ID N0:7)和RHA2(SEQ ID N0:8)同源臂之间的反向选择标 记。合成DNA构建体，且然后经由结合将其转化到产乙醇梭菌LZ1561中。为此，使用标准热激 转化首先将表达载体引入到结合供体菌株大肠杆菌CA434( "供体"）中。在将供体细胞涂布 于含有lOOwg/mL大观霉素和25yg/mL氯胺苯醇的LB板上之前，使其在37°C下在S0C培养基中 恢复lh。在37°C下将LB板培养过夜。次日，含有100yg/mL大观霉素和25yg/mL氯胺苯醇的5mL LB等分试样接种若干供体菌落并且在37 °C下培养，振摇约4h，或者直至培养物明显稠密但 仍未进入固定相。在室温下，通过在4000rpm下离心2min将1.5mL的供体培养物收集在微型 离心机试管中，并且弃去上清液。将供体细胞轻轻地重新悬浮于500μ1无菌PBS中并且在 4000rpm下离心2min并且弃去roS上清液。在产乙醇梭菌培养物（"受体"）的后指数期期间， 将菌块引入到厌氧腔室中并且轻轻地重新悬浮于200μ1中。将结合混合物(供体细胞和受体 细胞的混合物）点样到PETC-MES+果糖琼脂板上并且使其干燥。当斑点不再明显潮湿时，将 所述板引入到压力罐中，用合成气加压至25psi至30psi并且在37°C下培养~24h。在培育 24h之后，通过使用10μ1接种环轻轻地将结合混合物刮去，使所述结合混合物从所述板中去 除。将所去除的混合物悬浮于200μ1至300μ1 PETC-MES中。将100μ1结合混合物的等分试样 涂布到PETC-MES琼脂板上，所述PETC-MES琼脂板补充有用以选择catP的15yg/mL甲砜霉素 和10yg/mL甲氧节氨啼啶，并且通过添加31ng/ml无水四环素以诱导mazF表达并且选择双重 交叉。将板重新引入到压力罐中，加压至合成气的25psi至30psi，并且在37°C下培养3至4 天。在此单步tet3n〇-mazF的反向选择和catP的阳性选择之后，在所分析的16个整合体中鉴 别双重交叉整合体。
[0180] 使用一组引物以在2，3-BDH位点中扩增，已经表明在足够高的频率下发生双重交 叉重组和三重交叉重组，以用正确反向选择分离。阳性对照为菌落，其之前示出为通过筛选 多数目的菌落经由传统的双重交叉同源重组鉴别的纯A 2,3-BDH菌株。
[0181] 在某些情况下，对于部分群体在此第一步已经观察到三重交叉(和随后2,3_BDH的 缺失）（图17)。通过进一步传代培养，将发生三重交叉步骤(而不需要第二选择步骤）。
[0182] 为了选择三重交叉重组和随后2,3_BDH的缺失，将菌株涂布到氯苯丙胺酸上，所述 氯苯丙胺酸选择与具有随后2,3-BDH的缺失的第二阴性标记pheS*的三重交叉重组。为了筛 选质粒的不存在，使用抗革兰氏阴性起点ColEl的引物。为了筛选阳性三重交叉基因缺失， 执行用同源臂中的引物筛选以确认缺失基因的正确大小。
[0183] 为了在第二步中选择三重交叉重组和随后2,3_BDH的缺失，将菌株涂布到2g/L氯 苯丙胺酸上，所述氯苯丙胺酸选择与第二阴性标记pheS$的三重交叉重组。为了筛选质粒的 不存在，使用抗革兰氏阴性起点ColEl的引物。为了筛选阳性三重交叉基因缺失，执行用同 源臂中的引物筛选以确认缺失基因的正确大小。
[0184] 测序确认2,3_ 丁二醇基因的成功无痕缺失。提供了在产乙醇梭菌LZ1561中相应的 基因组区的核苷酸序列（SEQ ID N0:10)，双重交叉（SEQ ID N0:11)和三重交叉（SEQ ID N0:12)。
[0185] 相同过程也已经成功地应用于敲除产乙醇梭菌的二级醇脱氢酶基因 （SEQ ID NO: 13)〇
[0186] 本文所引用的所有参考文献，包括公开案、专利申请案和专利特此以引用的方式 并入，其引用程度就如同每一个参考文献单独地并且特定地指示为以引用的方式并入并且 全文阐述于本文中一般。在本说明书中对任何现有技术的引用不是并且不应该认为是现有 技术形成任何国家所致力领域中的公共常识的一部分的承认。
[0187] 除非本文另外指示或明显与内容相矛盾，否则在描述本发明的内容中（尤其在以 下权利要求书的内容中）使用术语"一 (a/an)"和"所述"和类似指示物应理解为涵盖单数与 复数。除非另外指出，否则术语"包含"、"具有"、"包括"和"含有"应理解为开放式术语（即， 意指"包括(但不限于)"）。除非在本文中另有说明，否则在本文中数值的范围的引证仅旨在 用作单独地提及每个单独的数值落入所述范围内的速记的方法，并且每个单独的数值被结 合到本说明书中就像它被单独地在本文中引证一样。除非本文另外指出或另外明显与内容 相矛盾，否则本文中所描述的所有方法可以任何适合顺序进行。除非另外要求保护，否则本 文所提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，"如"）的使用仅旨在更好地阐明本发明并 且并不提出对本发明的范围的限制。本说明书中的语言不应被解释为表示任何未要求保护 的元素对于本发明的实施是必不可少的。
[0188] 本发明的优选具体实例描述于本文中，包括本发明已知的执行本发明的最佳模 式。在阅读前文描述之后，那些优选实施例的变型对于本领域普通技术人员可变得显而易 见。本发明人期望熟练的技术人员适当时采用这些变型，并且本发明人打算以不同于本文 中特定描述的其它方式来实施本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的随附权利要求 书中所引述的主题的所有修改和等效方案。此外，除非本文中另有说明或另外明显与内容 相矛盾，否则本发明涵盖上述要素以其所有可能的变型的任何组合。
【主权项】
1. 一种产生重组微生物的方法，其包含： (a) 提供包含遗传元件的微生物，所述遗传元件包含靶核酸T1、靶核酸T2和靶核酸T3， (b) 提供DNA构建体，其包含与T1同源的左同源臂LHA1、与T2同源的右同源臂RHA1和与 T3同源的右同源臂RHA2，其中RHA2位于LHA1和RHA1之间， (c) 使(a)的所述遗传元件经历与（b)的所述DNA构建体的同源重组，从而T1与LHA1对准 并且T2与RHA1对准以将LHA1和RHA1之间的所述DNA构建体的部分(包括RHA2)插入到T1和T2 之间的所述遗传元件中，以及 (d) 使(c)的所述遗传元件经历自身同源重组，从而T3与RHA2对准以去除T3和RHA2之间 的所述遗传元件的部分。2. 根据权利要求1所述的方法，其中（a)的所述遗传元件包含5 '-T3-T1-T2-3 ' ；（b)的所 述DNA构建体包含5 '-LHA1-RHA2-RHA1-3 ' ；包含有包含5 '-T3-T1-RHA2-T2-3 '的遗传元件的 微生物形成于(c)中；并且包含有包含5'-T3-T2-3 '的遗传元件的微生物形成于(d)中，使得 T1从所述遗传元件中缺失。3. 根据权利要求1所述的方法，其中（a)的所述遗传元件包含5 '-T3-T1-T2-3 ' ；（b)的所 述DNA构建体包含5'-LHAl-RHA2-IS 1-RHA1-3'，其中IS1为插入核酸；包含有包含5'-T3-T1-RHA2-IS1-T2-3 '的遗传元件的微生物形成于(c)中；并且包含有包含5 '-T3-IS1-T2-3 ' 的遗传元件的微生物形成于(d)中，使得在所述遗传元件中Τ1被IS1替换。4. 根据权利要求1所述的方法，其中（a)的所述遗传元件包含5 '-T1T3-T4-T2-3 '，其中T1 包括T3并且T4为靶核酸；（b)的所述DNA构建体包含5'-LHA1rha2-RHA2-RHA1-3'，其中LHA1包 括RHA2;包含有包含5 '-T1T3-RHA2-T2-3 '的遗传元件的微生物形成于(c)中；并且包含有包 含5'-Τ1τ3-Τ2-3'的遗传元件的微生物形成于(d)中，使得T4从所述遗传元件中缺失。5. 根据权利要求1所述的方法，其中（a)的所述遗传元件包含5'-Τ1τ3-Τ2-3'，其中T1包 括丁3;(13)的所述0嫩构建体包含5'-1^^1鍾2-1?骱2-131-1?似1-3'，其中^^1包括1?骱2并且 IS1为插入核酸;包含有包含5'-T1t3-RHA2-IS1-T2-3'的遗传元件的微生物形成于(c)中；并 且包含有包含5'-T1t3-IS1-T2-3'的遗传元件的微生物形成于(d)中，使得IS1插入于所述遗 传元件中。6. 根据权利要求1所述的方法，其中（a)的所述遗传元件包含5 '-T1T3-T4-T2-3 '，其中T1 包括T3并且T4为靶核酸；（b)的所述DNA构建体包含5 '-LHA1rha2-RHA2-IS1-RHA1-3 '，其中 LHA1包括RHA2并且IS1为插入核酸;包含有包含5'-T1t3-RHA2-IS1-T2-3'的遗传元件的微生 物形成于(c)中；并且包含有包含5'-T1T3-IS1-T2-3 '的遗传元件的微生物形成于(d)中，使 得在所述遗传元件中T4被IS1替换。7. 根据权利要求1所述的方法，其中（b)的所述DNA构建体进一步包含在LHA1上游的反 向选择标记CS1和在LHA1和RHA2之间的正向选择标记PS1以及反向选择标记CS2。8. 根据权利要求7所述的方法，其中（c)之后进行选择表达PS1和选择不表达CS1的步骤 并且(d)之后进行选择不表达CS2的步骤。9. 根据权利要求7所述的方法，其中CS1和CS2独立地选自由以下各者组成的群组： pheS*、upp、sacB、tetAR、thyA、ccdB、lacY、rpsL、codA、pyrE、HSTK(thiK)、gatA_l和mazF;并 且PS1选自由以下各者组成的群组:catP、tetA(C)、七6七]\1、&&(19、&&(^、&&(^2和61'11113。10. 根据权利要求1所述的方法，其中（b)的所述DNA构建体进一步包含在LHA1上游的反 向选择标记CS1和在LHA1和RHA2之间的正向选择标记PS1。11. 根据权利要求10所述的方法，其中（c)之后进行选择表达PS1和选择不表达CS1的步 骤。12. 根据权利要求10所述的方法，其中CS1选自由以下各者组成的群组：pheS*、upp、 sacB、tetAR、thyA、ccdB、lacY、rpsL、codA、pyrE、HSTK(thiK)、gatA_l和mazF;并且PS1选自 由以下各者组成的群组:catP、tetA(C)、tetM、aad9、aadA、aadA2*ermB。13. 根据权利要求1所述的方法，其中LHA1比RHA2长。14. 根据权利要求13所述的方法，其中LHA1的长度等于或大于约1000个碱基对并且 RHA2的长度等于或小于约300个碱基对。15. 根据权利要求1所述的方法，其中LHA1和RHA1每个均比RHA2长。16. 根据权利要求15所述的方法，其中LHA1和RHA1每个的长度均等于或大于约1000个 碱基对并且RHA2的长度等于或小于约300个碱基对。17. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物为细菌、古细菌、病毒或真菌。18. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物属于梭菌属(Clostridium)、醋酸杆菌 属(Acetobacterium)、穆尔氏菌属(Moore 11a)、丁酸杆菌属（Butyribacterium)、布劳特氏 菌(81&1^1&)、产醋酸杆菌属((^〇63(^61')、嗜热厌氧杆菌属(1'1161'11103紐61'(^3(^61')、埃希氏 杆菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、梓檬酸杆 菌属（Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属（Salmonella)、沙雷氏菌属 (Serratia)、乳杆菌属（Lactobacillus)、乳球菌属（Lactococcus)、肠球菌属 (Enterococcus)、小球菌属（Pediococcus)、链球菌属（Streptococcus)、酵母菌属 (Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属汉逊酵母属(Candida Hansenula)、耶 氏酵母属（￥&1'1'0￥13)、红酵母属（1?110(1〇丨01'1113)、根霉菌属（1?1112(^118)、毛芽胞酵母属 (Trichosporon)、油脂酵母属（Lipomyces)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属（trichoderma)、 外瓶霉属（Exophila)、毛霉属（111<3〇!')、芽枝霉属（(^1&(1〇8卩〇1'；!_11111)、毛平革菌属 (?11&1161'0(31^6七6)、克拉迪氏菌属（(^13(1；!_(^11；!_131(^110以）、拟青霉菌属（？36(3；!_1〇1117〇68)、足 放线病菌属（Scedosporium)、欧菲斯特氏菌属(Ophistoma)、芽孢杆菌属(Bacillus)、寡养 菌属（01 igotropha)、假单胞菌属（Pseudomonas)、嗜碳菌属（Carbophilus)、氢菌属 (Hydrogenophaga)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、扎瓦尔金氏菌属（Zavarzinia)、贪铜菌 属(Cupravidus)、森丘氏菌属（Senechocystis)、绿屈烧菌属(Chlorof lexus)、甲基单胞菌 属(]^七1171〇111011&8)、甲基杆菌属(]^七1171〇匕&(^61')、甲基球菌属属(]^七1171〇(30(3(3118)、甲基微 菌属(]^七1171〇111；!_。1'〇13；!_11111)、甲基球形菌属(]^七1171〇8卩116『&)、甲基暖菌属(]^七1171〇。&1(11皿）、 甲基孢囊菌属（Methylocystis)、甲基弯曲菌属（Methylosinus)、甲焼杆菌属 (Methanobacterium)、甲焼球菌属(Methanococcus)、产甲焼菌属(Methanogenium)、甲焼八 叠球菌属（Methanosarcina)、甲焼球形菌属（Methanoshera)、甲焼热菌属 (Methanothermobacter)、甲焼丝菌属(Methanotrix)、棒状杆菌属（Corynebacterium)、不 动杆菌属(八0；!_116丨(^3(^61')、放线菌属(八(^；!_1101117〇68)、拟杆菌属(83(^61'；!_0(168)、伯克氏菌 属（811^11〇1(161'13)、短杆菌属（8^￥；^3(^61'；!_11111)、火球菌属（？71'0(30(3(3118)、地杆菌属 (Geobacter)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、分枝杆菌属 (Mycobacterium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、栖热抱菌属(Thermatoga)、嗜热厌 氧杆菌属（Thermoanaerobacter)、链霉菌属（Streptomyces)、红细菌属（Rhodobacter)、红 球菌属(Rhodococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、双叉杆菌属(Bifidobacterium)、丙酸 杆菌属(Propionibacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、 韦荣氏球菌属(^^;111〇11611&)、水居菌属(八911；!_11(3〇1&)、节杆菌属(八1^111'(^&(^61')、莫拉菌属 (]\1〇從1611&)或嗜冷杆菌属(？87(3111'(^3(^61')〇
【文档编号】C12N1/21GK105940099SQ201580006331
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2015年1月28日
【发明人】D·J·F·沃克, M·科普克
【申请人】朗泽科技新西兰有限公司