用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂的制作方法

用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂的制作方法
【专利摘要】本公开涉及用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂。本公开涉及含有发动蛋白2抑制剂的药物组合物，并涉及所述药物组合物在治疗中央核性肌病中的用途。本公开还涉及对有益于治疗中央核性肌病的分子进行识别或筛选的方法。
【专利说明】
用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂
技术领域
[0001 ] 本公开涉及用于治疗中央核性肌病(centronuclear myopathies)的发动蛋白2抑 制剂。本公开还涉及包含发动蛋白2抑制剂的药物组合物及其在治疗中央核性肌病中的用 途。
【背景技术】
[0002] 中央核性肌病(CNM)是一类先天性肌病，其表征为肌肉力弱，并在组织学上由纤维 萎缩、I型纤维占优势以及核中央化的增加而确认，并非是继发于肌肉再生。已表征了 CNM的 三种主要形式：由于磷酸肌醇磷酸酶肌管素(MTM1)突变造成的X连锁CNM(XLCNM，也称为肌 管肌病，0ΜΙΜ 310400)(LaporteJ.等，Nature Genetics，1996,13(2) :175-82页）；由于膜 重塑蛋白双载蛋白（3!^1^?1^8111)2(8頂1)突变造成的常染色体隐性0丽(厶1^匪，01頂 255200) (Nicot，A.S.等，Nature Genetics，2007,39(9) :1134-9页）；以及由于发动蛋白 2 (DNM2)突变(Bitoun，M.等，Nature Genetics，2005，37( 11 ):1207-9页）或由于其它基因（如 BIN1)突变(Bohm等，Brain，2014年9月25日，pii:awu272,[印刷版之前的电子出版])造成的 常染色体显性CNM(ADCNM，0M頂160150)。已将CNM样肌病与其它基因相关联:编码兰诺定受 体(ryanodine receptor)的RYR1;编码肌联蛋白的TTN;CCDC78(0MIM 614807);以及磷酸肌 醇磷酸酶MTMR14(称为hJUMPY;0MM 160150)。所牵涉的这些基因之间的遗传关系尚不明 确，并且缺乏有效的治疗方法。
[0003] X连锁中央核性肌病也称为肌管肌病，是最常见且最严重的C匪形式，新生儿发病 和死亡通常发生在生命的第一年(Jungbluth，H.等，Orphanet J Rare Dis，2008,3:第26 页）。这种疾病目前既无法治愈，也无有效治疗。目前为止已经报道了约450个家族中的超过 200种不同的MTM1突变，其中大部分导致蛋白大量减少。之前已对Mtml敲除或敲入的小鼠进 行了表征，其重现了CNM表型，具有典型的组织学特征，包括细胞器定位异常、细胞核定位错 误和肌肉萎缩，并伴有肌肉力量相应下降。已在具有不同形式CNM的数种动物模型和患者中 检测到与异常兴奋-收缩偶联相关的三联体(triads)结构缺陷，在全部CNM形式中识别出共 同缺陷（Defects in amphiphysin 2 (BIN1 )and triads in several forms of centronuclear myopathies，Tous saint，A ·等，Acta Neuropathol，2011年2 月；121(2): 253-66)。这与所提出的MTM1在三联体肌质网部分的磷酸肌醇水平调节中的作用相一致。 [000 4]发动蛋白是在膜运输(trafficking )、胞吞作用以及肌动蛋白细胞骨架组装中起 重要作用的大GTPase蛋白。发动蛋白包含用于蛋白-蛋白相互作用的PRD(富含脯氨酸的结 构域）、N-末端GTPase结构域、中间结构域、PH结构域(磷酸肌醇结合)和GED(GTPase效应结 构域）。已经鉴别了三种人发动蛋白：发动蛋白1，仅在神经元中表达;发动蛋白3,主要在脑 和睾丸中表达；以及发动蛋白2(DNM2)，普遍表达。已经在组织特异性疾病中鉴别了不同的 杂合·Μ2突变：影响骨骼肌的常染色体显性中央核性肌病；以及常染色体显性Charcot-Marie-Tooth(CMTDIB，0MIM 606482)周围神经病变。
[0005]最近的生化研究表明，一些导致CM1的DNM2突变使得发动蛋白寡聚物稳定性以及 GTPase活性升高。在小鼠中，借助最常见的CNM-M#2患者突变(p. R465W)的敲入或过表达进 行体内补偿，这在成年小鼠中诱导CNM样特征，表明该疾病不归因于单倍体不足 (1^口1〇;[1181^;1^(^611050。野生型(￥1')0匪2的过表达也对肌肉造成干扰，不过程度较小。
[0006] 专利申请W0 2013/0065558描述了miR-133a对DNM2表达起到调制作用。由于CNM中 DNM2是突变的，指出m i R-13 3家族成员的激动剂可能有利于中央核性肌病的治疗。然而， miR-133具有多个祀标（参见miRNA祀标预测和功能注释的在线数据库，例如http : // mirdb. org/miRDB/，给出了miRDB中的hsa-miR-133a的226个预测靶标，其中没有DNM2，利用 其它在线数据库也得到相同类型的结果）。由于miR-133具有多个靶标而没有选择性，这可 能具有有害影响。此外，至今没有利用miRl 33递送来改善CNM的报道。
[0007] 因此，对于中央核性肌病的合适治疗方法，特别是新的、更有效的治疗剂具有显著 需求。

【发明内容】

[0008] 对具有前景的中央核性肌病疗法的探索使得发明人发现，·Μ2的下调可以预防、 阻止并潜在地逆转(overturn)XLC匪表型的进展。此外，经确认，ΜΤΜ1在肌肉组织化和肌肉 力量中起着DNM2的负调节因子的作用。尽管DNM2是重要细胞过程的关键动力酶 (mechanoenzyme)，其减少对于XLC匪和其它中央核性肌病是非常有利的，并因此代表了新 的潜在治疗手段。本文展示的工作表明，DNM2的下调对中央核性肌病具有强效治疗作用。
[0009] 在第一方面，本发明涉及用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂。在具体的实 施方式中，所述中央核性肌病选自于由如下疾病所组成的组:X连锁C匪(XLCNM)、常染色体 隐性C匪(ARCW)和常染色体显性C匪(ADCW)。在优选的实施方式中，所述中央核性肌病是 XLCNM 或 ARCNM。
[0010] 本发明还涉及用于治疗中央核性肌病的药物组合物，所述药物组合物包含发动蛋 白2抑制剂和药学上可接受的载体/赋形剂。
[0011] 本发明进一步涉及用于治疗中央核性肌病的方法，其中，该方法包括将治疗有效 量的发动蛋白2抑制剂给予需要此类治疗的受试者的步骤。
[0012] 最后，本发明涉及发动蛋白2抑制剂在制备用于治疗中央核性肌病的药物组合物 中的用途。
[0013] 所述发动蛋白2抑制剂优选选自于由如下抑制剂所组成的组:针对发动蛋白2的抗 体;特异性干扰发动蛋白2表达的核酸分子；以及抑制发动蛋白2的活性、表达或功能的小分 子。在优选的实施方式中，所述发动蛋白2抑制剂选自于由特异性干扰发动蛋白2表达的核 酸分子所组成的组。在具体的实施方式中，所述发动蛋白2抑制剂是特异性干扰发动蛋白2 表达的核酶、RNAi或反义核酸。
[0014] 在更具体的实施方式中，所述发动蛋白2抑制剂是siRNA、shRNA或反义snRNA。
[0015] 本发明进一步的目标涉及对有益于治疗中央核性肌病的化合物进行筛选或识别 的方法，所述方法包括如下步骤：
[0016] a)提供或获得候选化合物；以及
[0017] b)确定所述候选化合物是否抑制发动蛋白2的活性/表达；
[0018] c)如果所述候选化合物抑制发动蛋白2的活性/表达，选择所述候选化合物。
[0019] 对适于治疗中央核性肌病的分子进行筛选或识别的方法可任选地进一步包括如 下步骤:在体内或体外将所选择的分子给予中央核性肌病非人动物模型或其部分(组织或 细胞），并分析对肌病发病或进展的作用。
[0020] 在对本发明进行详细描述之后，本发明的这些及其它目的和实施方式将变得更加 显而易见。
【附图说明】
[0021] 图1 JLCNM中的·Μ2水平。（A)XLC匪患者肌肉裂解液中·Μ2、ΜΤΜ1和GAPDH上样对 照的代表性WB，m =月龄。（B)DNM2蛋白表达的相对水平，所述相对水平由密度测定法确定， 并使用GATOH上样对照标准化，总n = 3-5名患者。（C)对来自5周龄WT和小鼠的胫骨 前肌(TA)和膈膜(E)骨骼肌裂解液的·Μ2和GATOH(上样对照)进行免疫印迹。对于TA(D)和 膈膜(F)，借助·Μ2免疫反应性多肽的密度测定法并使用GAPDH上样对照标准化而确定的 M2蛋白的相对水平。以与WT对照裂解液的倍数差异表示·Μ2表达，η = 4只小鼠。（G)对膈 肌切片进行HE染色。比例尺100mm。全部的图描绘平均值土s.e.m. (*ρ〈0.05，**ρ〈0.01，***ρ 〈0.001)。
[0022] 图2。1)匪2表达的减少大幅挽救了小鼠的寿命。（Α)全部小鼠的寿命，以小 鼠的存活百分比（％ )表示。WT、Dnm2+/_和Mtml-/yDnm2+/_组的全部小鼠存活至12月龄。最 老的小鼠活到2岁。（B)描绘了全部小鼠的全身重量。只有Mtml-/y小鼠表现出体重的显著降 低。（C)借助DW2免疫反应性多肽的密度法并使用GAPDH上样标准化而确定的DW2蛋白的相 对水平。以与WT对照裂解液的倍数差异表示·Μ2水平。对8周龄、16周龄和6月龄小鼠的来自 膈膜(DIA) (C)、腓肠肌(GAS) (D)、胫骨前肌(ΤΑ) (Ε)和比目鱼肌(SOL) (F)的肌肉的表达进行 确定，η = 2-8只小鼠。通过qRT-PCR分析对mRNA水平进行定量，相对于GAPDH上样对照来表示 M2水平(G)。图表示3个独立的实验。GAS(H)、TA(I)和SOL(J)肌肉重量(n = 5-13只小鼠）。 全部的图描绘平均值土s · e.m. (*ρ〈0·05，**ρ〈0·01，林*p〈0.001) (w =周龄，m=月龄）。
[0023] 图3。CNM组织学特征在具有降低的·Μ2表达的Mtml _/y小鼠中被大幅挽救。使用苏 木精和伊红(HE)(上侧子图）或琥珀酸脱氢酶(SDH)(下侧子图）对来自于8周龄(A)或16周龄 (C)小鼠的TA横切片进行染色，并借助光学显微镜进行观察。比例尺300mm;高放大倍数比例 尺25mm JB)通过透射电子显微镜观察肌肉横切片。箭头指示细胞核周围的膜积聚。比例尺 0.5mm。对来自于8周龄(D)和16周龄(E)TA肌肉的肌肉横切片的纤维面积进行分析。将纤维 大小以500mm 2的间隔分组，并以各组(n = 5-7只小鼠）的总纤维百分比表示。（F)对具有内部 核或中央核的纤维的频率进行打分(η = 5只小鼠）。内部核定义为非肌膜下也非中央的核。 由于Mtml-/y小鼠通常在16周龄前死亡，未测量16周龄Mtml-/y小鼠的图像以及统计(将不 能获得标记为NA)。全部的图描绘平均值土 s. e.m. (*p〈0.05，#p〈0.01，*#p〈0.001)。
[0024] 图4。具有降低的·Μ2表达的小鼠肌肉力量和耐力得到改善。（A)每周对3 周龄至8周龄的小鼠进行线绳测试(string test)。对于掉落，认为等于20秒。（B)在8周龄和 16周龄小鼠中测量TA肌肉的绝对最大力量。（C)TA肌肉的比最大力量(specific maximal force)表示相对于肌肉重量的绝对最大力量。(D)将ΤΑ肌肉易疲劳性测量为到达(B)中所产 生的最大肌肉力量的50 %所花费的时间。由于极端的肌肉力弱，无法测定8周龄小 鼠的肌肉疲劳。Mtml-/y小鼠通常在16周龄以前死亡，因此未在该年龄进行测定(NA)。全部 的图描绘平均值土s · e.m. (*ρ〈0·05，**ρ〈0·01，***ρ〈0·001) (n =每组至少5只小鼠）。
[0025]图5。具有降低的DW2表达的Mtm 1 _/y小鼠具有改善的肌肉超微结构。利用透射电 子显微镜对来自于8周龄(A)和16周龄(B)小鼠的TA肌肉进行成像。比例尺0· 5mm(A)或1mm
[0026]图6。来自于8周龄小鼠的TA肌肉中的三联体定位。(A)使用RyRl对肌肉横切片和肌 肉纵切片进行染色，或使用RyRl(绿)和α-辅肌动蛋白（红)抗体对肌肉横切片和肌肉纵切片 进行共染，并借助共聚焦显微镜进行成像。比例尺20mm(横切图像)或5mm(纵切图像）。0)使 用透射电子显微镜(TEM)对来自于8周龄小鼠的TA肌肉进行成像。箭头指向正常定位的三联 体，显示在高放大倍数插图中。比例尺200nm，高放大倍数比例尺lOOnmJC)来自（B)中的8周 龄TA肌肉每个肌小节可见的三联体百分比。图描绘了平均值±^!11.(邙<0.05)。（0)用小 窝蛋白3对肌肉横切片进行染色，并使用共聚焦显微镜成像。比例尺50mm。
[0027]图7。具有降低的DNM2表达的小鼠的长期表型。(A) 12月龄的WT小鼠（左)和 Mtml-/y Dnm2+/_小鼠（右）。0)足迹测试表明后足之间分开的角度。原始数据图像位于图 S7中。（C)4爪抓握测试。（D)在加速模式（5分钟内4-40rpm)下进行旋转棒测试。记录小鼠掉 落的时间。对每只小鼠每天的三次测试进行记录。（E)悬吊测试要求将小鼠悬吊于笼盖多达 60秒。每只小鼠进行三次测试。（F)对6月龄的小鼠进行静息呼吸测定的体积描记测试。显示 吸气时间、呼气时间、弛豫(re 1 axation)时间和呼吸频率;全部其它测定在图S8中示出。(G) 在来自6月龄小鼠的膈膜条中进行膈膜最大肌肉力量测试。描绘了在抽搐和强直（100Hz)下 的力一频率关系和比最大力量。(H)利用HE对膈肌纵切片进行染色，并借助光学显微镜进行 成像。比例尺l〇〇mm。全部的图描绘平均值土s.e.m. (*ρ〈0·05，**ρ〈0·01，***ρ〈0·001)。11 = 至少5只小鼠。
[0028]图8。仅在骨骼肌中减少·Μ2改善了 小鼠的寿命和病理。(Α)以存活的百分 比示出全部小鼠的寿命。以Mtm 1 _/y Dnm2skm+/_描绘在肌肉中具有降低的DW2的Mtml_/y 小鼠。（B)小鼠的体重。（C)解剖后立即对腓肠肌(GAS)、胫骨前肌(ΤΑ)和比目鱼肌(SOL)肌肉 进行称重。图表示肌肉重量占全身重量的百分比（ n = 5-12只小鼠）。〇)使用HE(上侧子图） 或SDH(下侧子图）对来自于16周龄小鼠的TA横切片进行染色。比例尺100mm。（E)对来自于16 周龄TA肌肉的横切片的纤维面积进行分析。将纤维大小以500mm 2的间隔分组，并以每组(η = 4-7只小鼠）的总纤维百分比表示。（F)对ΤΑ肌肉中具有内部核或中央核的纤维的频率进 行计数(η = 4-7只小鼠）。(G)借助·Μ2免疫反应性多肽的密度测定法并使用GATOH上样对照 标准化而确定的DW2蛋白的相对水平。以与WT对照裂解液的倍数差异表示DW2水平(η = 4-7 只小鼠）。全部的图描绘平均值土s.e.m.(*p〈0.05，#p〈0.01，*#p〈0.001)。
[0029]图9。症状发作后骨骼肌中·Μ2的降低改善了小鼠的寿命和病理。（A)以存 活的百分比示出全部小鼠的寿命。以Mtml-/y Dnm2(1)skm+A描绘在肌肉中具有降低的·Μ2的 Mtml-/y小鼠。（Β)小鼠的体重。（C)解剖后立即对腓肠肌(GAS)、胫骨前肌(ΤΑ)和比目鱼肌 (S0L)肌肉进行称重。图表示肌肉重量占全身重量的百分比（n = 5-12只小鼠）。〇)使用HE (上侧子图）或SDH(下侧子图）对来自于16周龄小鼠的ΤΑ横切片进行染色。比例尺lOOmmjE) 对来自于16周龄ΤΑ肌肉的横切片的纤维面积进行分析。将纤维大小以500mm 2的间隔分组， 并以每组(n = 4-7只小鼠）的总纤维百分比表示。（F)对具有内部核或中央核的纤维的频率 进行计数(η = 4-7只小鼠）。（G)借助·Μ2免疫反应性多肽的密度测定法并使用GATOH上样标 准化而确定的·Μ2蛋白的相对水平。以与WT对照裂解液的倍数差异表示·Μ2水平(η = 5-7 只小鼠）。全部的图描绘平均值土s.e.m.(*p〈0.05，#p〈0.01，*#p〈0.001)。
[0030] 图10。革E1向破坏小鼠的Dnm2，制造 Dnm2杂合小鼠。所革E1向的小鼠 Dnm2外显子8周围 的基因组区域。预测外显子8缺失导致框外转录。
[0031] 图11』ηπι2杂合小鼠的生化和表型表征。（A)Dnm2杂合（Dnm2+/_)小鼠和野生型 (WT)小鼠中尿素、钙和总胆固醇水平的血液分析。（B)WT和Dnm2+/_小鼠的心电图（ECG)测 定。X轴的值代表如下每个测试下显示的测定值:RR(两个R波之间的间隔，以ms测定）；HR = 心率(ms);PR(P-R 波的间隔，ms);QT(Q-T 波的间隔，bpm);QTcBZ(校正的 QLmsCorOJC)全 身重量。（D)全身体组成的Dexascan。以总身体组成的百分比示出瘦质组织（lean tissue) 和脂肪的量。（E)来自于对WT和Dnm2+/_小鼠实施肌肉肌电图而获得的单神经传导速度 (SNCV)的结果。（F)TA肌肉的总质量。TA肌肉的绝对最大力量(G)和比最大力量(mdDTA肌 肉的疲劳测定，以到达产生50 %的最大力量所需要的时间表示疲劳，以秒(s)为单位。分析 的全部小鼠为10-15周龄雄性小鼠 （n =每组8-12只）。全部的图描绘平均值土s.e.m.，所评 估的参数在WT和Dnm2+/_小鼠之间均无显著差异。
[0032]图12JA肌肉中发动蛋白2、肌管素 (myotubularin)和α-辅肌动蛋白的定位。利用 M2-R2680抗体(绿)和α-辅肌动蛋白抗体(红）（A)对来自于8周龄小鼠的肌肉纵切片进行 共染，或利用MTM1-R2827抗体(B)对来自于8周龄小鼠的肌肉纵切片进行染色，并通过共聚 焦显微镜进行成像。比例尺5μηι。
[0033] 图13。在具有降低的发动蛋白2表达的Mtml_/y小鼠的骨骼肌中肌肉萎缩得到挽 救。EDL(A)、跖肌(8)、645(〇、了4(0)、501^化）、心$)和肝(6)的重量以全身重量的百分比表 示(n = 5-15只小鼠）。全部的图描绘平均值土s.e.m. (*ρ〈0·05，**ρ〈0·01，***p〈0.001)(w = 周龄，m=月龄）。（!〇利用HE(上侧子图）或SDH(下侧子图）对来自于8周龄小鼠的GAS横切片 (H)或S0L横切片（I)进行染色。比例尺100μπι。
[0034] 图14。不同年龄的各种肌肉中的蛋白表达水平。将来自于8周龄(A、D、G、J)、16周龄 (B、E、H)和6月龄(C、F、I、K)的腓肠肌(GAS)(A_C)、胫骨前肌(TA)(D_F)、比目鱼肌(G-I) 和膈肌(J、K)肌肉的裂解液进行·Μ2和GATOH(上样对照）的免疫印迹。在列出的情况下，也 对裂解液进行ΜΤΜ1的印迹。当出现双带时，较低的带代表ΜΤΜ1。将与本研究无关的干扰带用 叉标记(G、I、J)。
[0035] 图15。在来自于具有降低的发动蛋白2表达的8周龄Mtml-/y小鼠的ΤΑ肌肉中，结蛋 白定位和三联体结构组织得到挽救。使用结蛋白抗体(Α)或DHPRa抗体(Β)对来自于8周龄小 鼠的肌肉横切片进行染色，并通过共聚焦显微镜进行成像。在A和B中，比例尺为50μπι(上侧 子图）以及比例尺为20μηι(下侧子图）。注意到Mtml_/y中存在结蛋白的细胞质累积，在大多 数Mtml-/yDnm2+/_纤维中这一现象得到挽救。
[0036] 图16。来自于6月龄和12月龄小鼠的足迹模式。画出最佳拟合线来描绘测得的后足 之间的角度。值得注意的是，与WT和Dnm2+/_小鼠相比，Dnm2+/_小鼠用外翻的足行 走。分析数据在图7B中示出。（B)每月进行前肢抓握测试(前爪）（n =每组至少5只小鼠）。图 描绘了平均值土s.e.m.。组之间未观察到显著差异。
[0037]图17。具有降低的发动蛋白2表达的6月龄Mtml_/y小鼠的体积描记结果。对静息小 鼠进行了体积描记测试以评估静息呼吸模式。全部的图描绘平均值土s.e.m.。组之间未观 察到显著差异。
[0038] 图18。仅骨骼肌中的发动蛋白2的杂合性缺失改善Mtml-/y小鼠的病理。(A)利用HE 或SDH对来自于16周龄小鼠的ΤΑ横切片进行染色。比例尺300μπι。对来自于16周龄GAS肌肉 (B)和S0L肌肉（C)的横切片的纤维面积进行分析。将纤维大小以500μπι 2的间隔分组，并以每 组(η = 3-6只小鼠）的总纤维百分比表示。（D)对具有内部核或中央核的纤维的频率进行计 数(η = 3-6只小鼠）。对来自于16周龄小鼠的腓肠肌(GAS)(E)、胫骨前肌(TA)(F)、比目鱼肌 (S0L)(G)(显示的图像来自于同一蛋白印迹）以及膈肌(H)肌肉的裂解液进行DW2、MTM1和 GAPDH(上样对照）的免疫印迹。全部的图描绘平均值土s.e.nK(*p〈0.05，#p〈0.01，#*p〈 0.001)〇
[0039] 图HMtHil-zV Dnm2skm+~j、鼠中的蛋白表达水平。对来自于16周龄小鼠的腓肠肌 (GAS) (A)、胫骨前肌(TA) (B)和膈膜(C)骨骼肌的裂解液进行D匪2、MTM1和GAPDH(上样对照） 的免疫印迹。
[0040] 图20。扮111-/-小鼠围产期死亡;Binl-/-Dnm2+/-小鼠存活且体重增加。图20-A，以 克示出的体重显示Binl-/-Dnm2+/_小鼠达到34克。图20-B，10周龄野生型小鼠和Binl-/-Dnm2+/_小鼠是无法区分的。
[0041 ] 图21。与野生型小鼠（WT小鼠）相比，在临床分析中Binl-/-Dnm2+/_小鼠没有表现 出性能缺陷。（A-F)分析了年轻(2-6月龄)和年老（12-17月龄)Binl-/-Dnm2+/_小鼠。（G-H) Binl-/-Dnm2+/_小鼠和野生型(WT)小鼠在两种年龄处的比最大力量(相比于肌肉重量的绝 对最大力量)和半弛豫时间都相似，支持正常的肌肉力量并且抗疲劳。
[0042] 图22。B in 1 -/-Dnm2+/_小鼠表现出与对照接近的组织学。B i η 1 -/-Dnm2+/_小鼠显 示出具有正常形状和大小(HE:苏木精-伊红染色）以及正常氧化染色（SDH)的肌纤维。它们 表现出核更中央化的倾向，而没有过度再生的迹象。
[0043] 图23。纤维大小(A)和核位置小鼠表现出类似的纤维大小，并 具有较小纤维的轻微倾向，当比较全部纤维直径的平均值时，该倾向不显著（左）Ainl-/-Dnm2+/_小鼠具有更中央化的核(右）。
[0044]图24。发动蛋白2mRNA外显子和发动蛋白2蛋白结构域:a)选择用于被shRNA靶向的 发动蛋白2mRNA区域(上），导致中央核性肌病的·Μ2中的显性突变(下）A)GTPase结构域、 中间(MID)结构域、普列克底物蛋白同源(PH)结构域、GTPase效应结构域(GED)和富含脯氨 酸的结构域(PRD)。
[0045]图25。在shDnm2转染的HEK细胞中发动蛋白2的蛋白表达。a)利用h_M2(编码人 M2的质粒)和靶向·Μ2πιΚΝΑ的shRNA共转染的HEK(人胚肾）细胞的Wetern印迹。b)密度测 定分析显示shRNA编号(N°)B、C、F、I和J靶向hDNM2,并有效降低hDNM2的表达。
[0046] 图26。在shDnm2转染的C2C12细胞中发动蛋白2的mRNA表达。在shRNA转染的C2C12 (小鼠成肌细胞）中评价Dnm2mRNA的水平。所选择的shRNA有效地将Dnm2mRNA减少至约50 %。 [0047]图27。在注射AAV的WT(野生型）胫骨前肌(TA)肌肉中发动蛋白2的蛋白表达。a)注 射表达shDnm2编号C或干扰（scrambled)序列的AAV的WT TA的Western印迹。b)密度测定分 析显示，shRNA编号C在体内靶向Dnm2，并且，与注射AAV-干扰的WT相比，shRNA编号C将Dnm2 的表达降低至约60%。
[0048] 图28DAAV肌肉内注射5周后K0 TA的重量和Dnm2蛋白表达。a)与注射AAV- 干扰的ΤΑ相比，肌肉内注射编码shDnm2编号C的AAV示出肌肉重量增加。b)注射表达shDnm2 编号C或干扰序列的AAV的K0腓肠肌的Western印迹。
[0049] 图29。在AAV肌肉内注射5周后，利用H&E (苏木精&伊红)对Mtml_/y K0腓肠肌肌肉 横切片进行染色。与注射AAV-干扰序列的K0腓肠肌（左）相比，肌肉内注射编码 shDnm2编号C的AAV(右）显示出在Mtml-/y K0腓肠肌中肌肉组织学的改善和纤维大小的增 加。
[0050] 图30。在注射AAV的K0腓肠肌肌肉横切片中的纤维大小分布、纤维大小平 均值&核位置的定量。a)纤维大小分布显示，与注射AAV-干扰的K0腓肠肌相比，注 射AAV-shDnm2编号C的Mtml-/y K0腓肠肌展示出更大的纤维。b)纤维大小平均值测定表明， 与注射AAV-干扰的K0腓肠肌相比，注射AAV-shDnm2的Mtml-/y K0腓肠肌展现出较 大的纤维（大小几乎加倍）。〇)与注射AAV-干扰的K0腓肠肌相比，注射AAV-shDnm2 编号C的Mtml-/y K0腓肠肌在肌纤维内展现出的位置异常的核较少。对于(a)&(b)，测定了〉 800个纤维。对于(c )，每个样品对1000个纤维计数。
【具体实施方式】
[0051] 除非另有定义，本文所使用的全部技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中 的普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。
[0052] 发动蛋白2由DW2基因 （Gene ID 1785)编码。更确切地说，D匪2基因位于第19号染 色体第10,919,884碱基对至第10,942,586碱基对（61?(：1137/1^19发布），或位于％_ 000019 · 10位置的第10，718,053碱基对至第10，831,910碱基对(GRCh38/hgl9)。发动蛋白2 基因或基因产物也被称作其它名称，包括但不限于CMTDI1、CMTDIB、DI-CMTB、DYN2、DYN2_ HUMAN、发动蛋白 II、DYNII。
[0053] 发动蛋白2抑制剂
[0054] 本文所使用的术语"发动蛋白2抑制剂"指能够特异性地降低发动蛋白2的表达或 者抑制发动蛋白2的活性或功能的任何分子。优选地，此类发动蛋白2抑制剂是直接抑制剂， 这意味着它直接与发动蛋白2蛋白或编码所述发动蛋白2的核酸或它们的一部分相互作用。 根据本发明的发动蛋白2抑制剂能够在体内和/或体外抑制或降低发动蛋白2的功能活性。 抑制剂可以将发动蛋白2的功能活性抑制至少约30%，优选至少约50%，优选至少约70%、 75 %或80 %，更优选85 %、90 %或95 %。特别地，抑制剂可以将发动蛋白2的表达抑制至少约 10%，优选至少约30%，优选至少约50%，优选至少约70%、75%或80%，更优选85%、90% 或 95%。
[0055] 本发明的发动蛋白2抑制剂可以通过阻断和/或抑制发动蛋白2的活性或功能而起 作用。这例如可以通过抑制发动蛋白2的酶活性来实现。本领域技术人员可以根据已知的方 法，例如通过测试网格蛋白介导的内吞作用中发动蛋白2的功能或GTPase活性，来容易地评 价发动蛋白2的功能活性或酶活性(Macia E.等，Dynasore,a cell-permeable inhibitor of dynamin:Developmental cell 10,839_850,2006年6月）。就61?&86活性或脂质结合、亚 细胞定位、网格蛋白介导的内吞作用、突触囊泡内吞作用的抑制剂而言，可以使用如下文献 所描述的方法:McCluskey等，Traffic，2013 ;McGeachie等，ACS Chem Biol，2013。就发动蛋 白2的GTPase活性、寡聚化、脂质结合而言，可以使用如下文献所描述的方法:Wang等，J BiolChem2010;SKennistor^PLemmon，EMB0J，2010〇
[0056] 本发明的发动蛋白2抑制剂还可以通过阻断和/或抑制发动蛋白2的表达(包括转 录、剪接、转录成熟或翻译)起作用。可借助本领域技术人员所知的任何手段对发动蛋白2表 达的降低或抑制进行评估，所述手段包括但不限于:例如使用抗发动蛋白2抗体，借助例如 We s t ern印迹分析(例如如图1所示)或EL ISA来评价发动蛋白2的蛋白水平;和/或例如使用 任何可获得的技术(例如定量PCR)来评价发动蛋白2的mRNA水平(例如如图2所示）。
[0057] 发动蛋白2抑制剂优选选自于由如下抑制剂所组成的组:针对发动蛋白2的抗体； 特异性干扰发动蛋白2表达的核酸分子;和抑制发动蛋白2酶活性（即，抑制GTPase活性）、表 达(如通过抑制启动子、剪接或翻译)或功能(如抑制寡聚化、活化、脂质结合或伴侣结合)的 小分子。
[0058] 根据具体的实施方式，发动蛋白2抑制剂选自于由针对发动蛋白2的抗体或特异性 干扰发动蛋白2表达的核酸分子(或核苷酸)所组成的组。在优选的实施方式中，发动蛋白2 抑制剂选自于由特异性干扰发动蛋白2表达的核酸分子所组成的组。根据本发明，该特异性 干扰发动蛋白2表达的核酸分子通常是非天然存在的核酸。在具体的实施方式中，发动蛋白 2抑制剂是特异性干扰发动蛋白2表达的RNAi、反义核酸或核酶。在具体的实施方式中，发动 蛋白2抑制剂是siRNA或shRNA。
[0059] 在本发明中，所述核酸能够与编码发动蛋白2的基因或转录物特异性杂交。"特异 性杂交"意味着在严格条件下杂交。具体而言，严格条件可由如下条件定义:盐浓度、有机溶 剂(如甲酰胺）的浓度、温度和本领域公知的其它条件。典型的严格杂交条件包括30°C以上、 优选35°C以上、更优选超过42°C的温度，和/或低于约500mM、优选低于200mM的盐度。然而， 应理解的是，根据本发明的核酸不需要具有与靶序列100%的互补性来进行特异性杂交。具 体而言，具有至少相当于约90%的互补性程度的核酸能够特异性杂交。优选地，根据本发明 的核酸和靶序列之间的互补性程度相当于至少95%、96%、97%、98%、99%或100%。
[0060] 术语"互补的"或"互补性"指多核苷酸与另一多核苷酸分子形成碱基对的能力。碱 基对典型地由反平行多核苷酸链中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补的多核苷酸链能够 以Watson-Crick方式进行碱基配对(例如，A与T、A与U、C与G)，或以允许双链形成的任何其 它方式进行碱基配对。如本领域技术人员所知晓的，当使用RNA而不是DNA时，认为尿嘧啶而 不是胸腺嘧啶为与腺苷互补的碱基。然而，除非另有说明，在本发明的上下文中表示为U时， 隐含能够替换为T。完美互补性或100%互补性指一条多核苷酸链的每个核苷酸单元均能够 结合第二多核苷酸链的核苷酸单元的情况。不够完美的互补性指两条链的一些但不是全部 核苷酸单元能够相互结合的情况。例如，对于两个20-mer而言，如果各链仅两个碱基对能够 相互结合，多核苷酸链展现出10 %的互补性。同样地，如果各链的18个碱基对能够相互结 合，多核苷酸链展现出90 %的互补性。
[0061 ]本文所使用的术语"iRNA"、"RNAi"或"干扰RNA"指能够下调靶蛋白表达的任何 RNA。它包括小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、单链RNA(ssRNA)和短发夹RNA(shRNA)分 子。RNA干扰定义为dsRNA在转录后水平特异性地阻遏靶基因表达的现象。在正常情况下， RNA干扰由数千碱基对长度的双链RNA分子(dsRNA)引发。在体内，导入细胞的dsRNA被切割 为称为siRNA的短dsRNA分子的混合物。催化该切割的酶Dicer是包含RNase III结构域的内 切RNase(end〇-RNase) (Bernstein，Caudy等，200INature，2001年 1 月 18 日；409(6818) :363- 6)。在哺乳动物细胞中，由Dicer产生的siRNA长度为21-23bp，其具有19或20个核苷酸的双 链序列、2个核苷酸的3'垂悬和5'-三磷酸末端(Zamore，Tuschl等，Cell，2000年3月31日， 101(1) :25-33;Elbashir，Lendeckel等，Genes Dev，2001年1 月 15 日，15(2): 188-200; Elbashir，Martinez等，EMBO J，2001 年 12月3 日，20(23):6877-88)。根据本发明，丨1?祖不包 括microRNA。
[0062] 大量专利和专利申请(例如W0 99/32619)已一般性地描述了siRNA分子抑制基因 表达的用途。Z，Wang等，Pharm Res(2011)28:2983-2995的综述中还详述了借助siRNA和 shRNA的RNA干扰治疗。
[0063] 通常将siRNA或shRNA设计为针对翻译起始密码子下游19-50个核苷酸的区域，而 通常避开5'UTR(非翻译区）和3'UTR。应该对所选择的siRNA或shRNA靶序列进行针对EST数 据库的BLAST搜索，以确保靶向唯一的期望的基因。有助于siRNA或shRNA的制备和使用的多 种产品为商购可得的。
[0064] 在优选的实施方式中，RNAi分子是长度为至少约10-40个核苷酸、优选约15-30碱 基核苷酸的siRNA。
[0065] siRNA或shRNA可包括天然存在的RNA、合成的RNA或重组产生的RNA，以及通过添 加、删除、置换和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的改造 RNA。此类改造 可包括将非核苷酸物质添加至例如siRNA的分子末端或添加至siRNA的一个或多个内部核 苷酸，包括使s iRNA耐受核酸酶消化的修饰。
[0066] -些发动蛋白2抑制核酸是商购可得的。例如可以列举但不限于如下：Abno va-Novus Biologicals，参考号为H00001785-R05-H00001785-R08的发动蛋白2RNAi;Santa Cruz Biotechnology，参考号为sc-35236的发动蛋白 II siRNA(h)，参考号为sc-35236-PR 的发动蛋白II(h)-PR，参考号为sc-35236-SH的发动蛋白II shRNA质粒(h)，参考号为sc-35236-V的发动蛋白II shRNA(h)慢病毒颗粒。
[0067] 在具体的实施方式中，特异性干扰发动蛋白2的核酸分子是特异性干扰发动蛋白2 的全长肌肉人cDNA序列（如SEQ ID No 1所示，添加有12b的转录变体1(NM_001005360.2) (外显子10a，13ter))的至少一部分的核酸。更具体而言，根据该实施方式，RNAi分子是长度 为至少约10-40个核苷酸的siRNA或shRNA、优选约15-30碱基核苷酸的iRNA。在具体的实施 方式中，s iRNA或shRNA靶向发动蛋白2mRNA的至少一个外显子;更具体而言，发动蛋白2mRNA 的外显子1、4、5、12b、13、15、17和21中的至少一个。
[0068] 在具体的实施方式中，特异性干扰发动蛋白2的核酸分子包含选自于由如下序列 所组成的组中的序列、或者特异性干扰发动蛋白2的核酸分子由选自于由如下序列所组成 的组中的序列组成：

[0085]也可用反义核酸来下调发动蛋白2的表达。反义核酸可与编码发动蛋白2的正义核 酸的全部或部分互补(例如与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补），认为反义核 酸干扰祀mRNA的翻译。本发明使用的反义核酸特异性干扰发动蛋白2的表达。
[0086]根据一个实施方式，反义核酸是与编码发动蛋白2的革EmRNA互补的RNA分子。
[0087]根据另一实施方式，反义核苷酸表不与编码发动蛋白2的pre-mRNA的一部分互补 的单链核酸序列(DNA或RNA)。具体而言，将本发明的反义核苷酸设计为阻断发动蛋白2pre-mRNA中的剪接受体（SA)位点和/或外显子剪接增强子(ESE)和/或分支点和/或能够调制 pre-mRNA剪接的任何序列，即，将其设计为与包含SA、ESE、分支点序列或能够调制pre-mRNA 剪接的任何序列的发动蛋白2pre-mRNA的一部分互补。更具体而言，反义核苷酸用于诱导发 动蛋白2pre-mRNA内的外显子跳跃(exon-skipping)，从而在所得mRNA中引起移码，这产生 含有提前终止密码子的截短cDNA。这种策略因此允许DW2蛋白水平降低。在具体的实施方 式中，反义核苷酸用于诱导发动蛋白2pr e-mRNA内的外显子跳跃。例如，将所使用的反义核 苷酸设计为特异性诱导外显子2或外显子8跳跃。在具体的实施方式中，本发明的反义核苷 酸能够诱导人·Μ2πιΚΝΑ中包含提前终止密码子。显示外显子2或外显子8跳跃导致发动蛋白 2的蛋白缺失（如如下文献所描述："Reducing dynamin 2expression rescues X-linked centronuclear myopathy"，Cowling BS，Chevremont T，Prokic I，Kretz C,Ferry A， Coirault C，Koutsopoulos 0，Laugel V,Romero NB，Laporte J，J Clin Invest，2014年3 月3 日，124(3) :1350-63(1〇1:10.1172/7(：171206，电子出版：2014年2月24日；以及1^116111 E，Pereira JA，Suter U，Hum Mol Genet，2013年11月1日，22(21):4417-29doi:10.1093/ hmg/ddt292，电子出版:2013年6月27日）。
[0088]在具体的实施方式中，将反义核苷酸设计为特异性诱导·Μ2外显子2或外显子8跳 跃，并包含如下序列中的一条，或由如下序列中的一条组成：
[0089] U7-Ex2(具有反义U7snRNA，靶向DNM2外显子2的跳跃），包含如下序列：
[0090] SEQ ID No 26：GTCACCCGGAGGCCTCTCATTCTGCAGCTC
[0091] U7-Ex8(具有反义U7snRNA，靶向DNM2外显子8的跳跃），包含如下序列：
[0092] SEQ ID No 27：ACACACTAGAGTTGTCTGGTGGAGCCCGCATCA
[0093] 反义核酸的长度可为例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。具体而 言，反义RNA分子的长度通常为15-50个核苷酸。可使用本领域所知晓的程序，利用化学合成 和酶连接反应来构建本发明使用的反义核酸。具体而言，反义RNA可以是化学合成的、通过 体外转录由线性模板(例如PCR产物)或环状模板(例如病毒或非病毒载体)产生的、或者通 过体内转录由病毒或非病毒载体产生的。可对反义核酸进行修饰，以具有增强的稳定性、核 酸酶耐受性、靶标特异性和改进的药理学特性。例如，反义核酸可以包含设计用于增加反义 和正义核酸之间形成的双链的物理稳定性的修饰的核苷酸或/和骨架。
[0094] 在本发明的上下文中，"核酶"是能够切割核酶与之具有互补区的单链核酸（如 mRNA)的具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子。因此，核酶可用于催化性地切割mRNA转录 物，从而抑制由该mRNA编码的蛋白的翻译。可利用本领域公知的方法设计、产生和给予对功 能性发动蛋白2具有特异性的核酶分子（参见例如Fanning和Symonds(2006)RNA Towards Medicine(Handbook of Experimental Pharmacology)，Springer编：289-303页）。
[0095] 根据本发明，也可将基因组编辑用作工具。基因组编辑是一类基因工程，其中，使 用人工工程化的核酸酶或"分子剪刀"将DNA插入基因组、从基因组中替换或从基因组中移 除。核酸酶在基因组中的期望位置处制造特定的双链断裂(DSB)，并利用细胞内源机制借助 同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)的天然过程来修复被诱导的断裂。目前使用的是四 个家族的工程化核酸酶：锌指核酸酶（ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶（TALEN)、 CRISPR/Cas系统（更具体而言，如在如下文献中描述的Cas9系统：P.Mali等，Nature Methods，第10卷第10期，2013年10月）或工程化大范围核酸酶(meganuclease)再工程化的 归巢(homing)核酸内切酶。根据本发明，可将所述核酸酶作为DNA或mRNA递送至细胞，将此 类DNA或mRNA工程化以靶向·Μ2基因。根据一个实施方式，所述发动蛋白2抑制剂是经工程 化以靶向·Μ2基因以及递送使用基因组编辑疗法的核酸酶的DNA或mRNA，或者，所述发动蛋 白2抑制剂是经工程化以靶向DMN2的使用基因组编辑疗法的核酸酶。
[0096] 可以将根据本发明所使用的如上定义的核苷酸以DNA前体或编码它们的分子的形 式进行给药。
[0097] 对于体内使用，可借助化学修饰(如磷酸骨架修饰(例如硫代磷酸键））对本发明的 核苷酸进行稳定化。可以如下形式给予本发明的核苷酸:游离(裸的）形式;或使用增强稳定 性和/或靶向性的递送系统(例如脂质体）；或纳入至其它载体(如水凝胶、环糊精、可生物降 解的纳米微囊、生物粘附性微球或蛋白性载体）；或与阳离子肽组合。也可将其偶联至仿生 细胞穿透肽。也可以其前体或编码DNA的形式给药。核苷酸的化学稳定化版本还包括"吗啉 代"（磷酰二胺吗啉代寡聚物-PM0)、2'-0-甲基寡聚物、带AcHN-(RXRRBR)2XB肽标签的ΡΜ0 (R，精氨酸;X，6-氨基己酸;B，（R)_丙氨酸）（PPMO)、三环DNA或小核（sn)RNA。可实现该效果 的后几种形式的核苷酸为小核RNA分子，包括1]1、1]2、1]4、1]4&丨&〇、1]5、1]7、1]11和1]12(或其它 UsnRNP)，优选U7snRNA(如上识别的SEQ ID No 26和SEQ ID No 27)，特别是与基于但不限 于慢病毒、逆转录病毒或腺相关病毒的病毒转移法组合使用的情况。全部这些技术为本领 域所公知。
[0098]本发明的特异性干扰发动蛋白2表达的核酸分子可单独或与载体共同递送至体 内。在最广的意义上，"载体"是能够促进核苷酸转移至细胞(优选为表达·Μ2的细胞）的任 何媒介。优选地，与无载体所获得的降解程度相比，载体将核苷酸运送至细胞使得所述核苷 酸具有降低的降解程度。一般来说，本发明中有用的载体包括但不限于:已通过插入或纳入 本发明的核苷酸进行处理的质粒、噬菌粒、病毒以及衍生自病毒或细菌来源的其它媒介。病 毒载体是优选的载体类型，包括但不限于来自于如下病毒的核酸序列:慢病毒(如HIV-1)、 逆转录病毒（如莫洛尼鼠类白血病病毒、腺病毒、腺相关病毒）；SV40型病毒;疱疹病毒（如 HSV-1病毒和痘苗病毒）。可容易地使用本文未指出然而本领域已知的其它载体。在其临床 应用已被验证并可用于递送核苷酸的载体中，慢病毒、逆转录病毒和腺相关病毒(AAV)显示 出用于外显子跳跃策略的较大潜力。
[0099]本文所使用的术语"抗体"旨在广义上指任何免疫结合剂（如以6、181、184、18〇和 IgE)以及人源化抗体或嵌合抗体。在某些实施方式中，由于IgG和IgM为在生理状态下最常 见的抗体并且最容易制造，优选IgG和/或IgM。术语"抗体"用于指具有抗原结合区的任何抗 体样分子，包括抗体片段如Fab'、Fab、F(ab'）2、单结构域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)等。 制备和使用多种基于抗体的构建体和片段的技术为本领域所公知。制备和表征抗体的手段 也为本领域所公知（参见例如Harlow，E ·和Lane，D. (1988)Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory编）。
[0100] "人源化"抗体是其中的一个或多个人免疫球蛋白的恒定和可变骨架区融合至动 物免疫球蛋白的结合区（例如CDR)的抗体。本发明涉及的"人源化"抗体是来自于小鼠、大鼠 或其它物种并带有人的恒定和/或可变区结构域的嵌合抗体;双特异性抗体;重组抗体和工 程化抗体，以及上述抗体的片段。此类人源化抗体设计为保留非人抗体(所述结合区由其衍 生而来)的结合特异性，但避免针对该非人抗体的免疫反应。
[0101] "嵌合"抗体是具有如下特征的抗体分子：（a)恒定区或其部分被改变、替换或交 换，从而抗原结合位点（可变区)连接至不同或改变的类型、效应因子功能和/或物种的恒定 区，或赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等）；或 (b)可变区或其部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区交换、替换或改变。
[0102] 针对发动蛋白2的抗体为商购可得的，例如Novus Biologicals出售或制造的如下 抗体：目录编号：发动蛋白2抗体NB300-617、发动蛋白2抗体NBP2-16244、发动蛋白2抗体 (6C9)H00001785-M01; Santa Cruz Biotechnology 出售或制造的如下抗体：目录编号：sc_ 81150、3(：-6400、8(3-166525、8(3-166669、8(3-166526;80^〇8(^61^68出售或制造的抗体抗 M2(小鼠抗体，610264);或IGBMC-Illkirch出售或制造的抗体抗·Μ2:Κ2679、Κ2680、 R2865、R2866、R2640或R2641。
[0103] 在另一具体的实施方式中，发动蛋白2抑制剂是抑制发动蛋白2酶活性或功能的小 分子。
[0104] 本文所使用的术语"抑制发动蛋白2的活性、表达或功能的小分子"指具有抑制或 降低发动蛋白2的活性、表达或功能的能力的小分子，可以是有机或无机化合物，通常小于 1000道尔顿。该小分子可以来自于任何已知的生物(包括但不限于动物、植物、细菌、真菌和 病毒)或来自于合成分子库。可借助本文档描述的方法识别抑制发动蛋白2的活性、表达或 功能的小分子。
[0105] 发动蛋白抑制剂在Harper CB等，Trends Cell Biol.，2013年2月，23(2) :90-101， 综述中描述。在具体的实施方式中，此类分子选自于由如下分子所组成的组：
[0106] -Dynasore (发动蛋白1和发动蛋白2的非竞争性、细胞透过性缩氨基脲 (semi carbazone)化合物抑制剂一 CAS编号304448-55-3 )，其化学名称是3-羟基萘-2-甲酸 (3,4-二羟基苯亚甲基)酰肼，
[0107] 一取(11'〇17-〇711&8(^6(发动蛋白2的强效抑制剂（1〇5() = 2.641^))(取(11'〇叉7-Dynasore是发动蛋白抑制剂Dynasore的细胞透过性羟基化类似物一 CAS编号1256493-34-1)，其化学名称是3-羟基-N'-[(2,4,5-三羟基苯基)亚甲基]萘-2-甲酰肼，
[0108] 一十四烷基三甲基溴化铵（CAS编号1119-97-7)，由Abeam以MiTMAB?(abl20466)的 名称销售(细胞透过性发动蛋白1和发动蛋白2抑制剂(对于发动蛋白II的抑制，IC 5Q = 8.4y Μ)。它靶向普列克底物蛋白同源(PH)(脂质结合)结构域。它抑制受体介导的内吞作用和突 触囊泡内吞作用（IC 5〇值2.2μΜ)，
[0109] - Phthaladyn-23(细胞透过性邻苯二甲酰亚胺化合物，据报道抑制发动蛋白 2GTPase活性（1(：5〇 = 63以厘）），？11也&1&(^11-23的化学名称是4-氯-2-((2-(3-硝基苯基)-1， 3_二氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-5-羰基)-氨基)-苯甲酸，
[0110] -Dynole 34_2，其为发动蛋白抑制剂V( sebt. com)，作用于GTPase活性，对GTP无 竞争性，Dynole 34-2的化学名称是2-氰基-N-辛基-3-[l-(3-二甲基氨丙基)-1Η-吲哚-3-基]丙烯酰胺，
[0111] - Μ-divi-l (线粒体分裂抑制剂，IC5〇= 10μΜ ) (sebt · com)，M-divi_l的化学名称 是3-(2,4-二氯-5-甲氧基苯基）-2-硫烷基喹唑啉-4(3!1)-酮（3-(2,4-01(^1(^〇-5-methoxyphenyl)-2-sulfanylquinazolin-4(3H)-〇ne),
[0112] - Iminodyn_22/17(sebt · com) (Iminodyn 22: IC5〇 = 390nM，作用于GTPase变构位 点，相对于GTP显示非竞争性拮抗作用），Iminodyn 22的化学名称是N，N'_(丙烷-1，3-二基） 双(7，8_二羟基-2-亚氨基-2H-苯并吡喃-3-甲酰胺），Iminodyn 17的化学名称是N，N'_(乙 烷-1，2-二基)双(7，8-二羟基-2-亚氨基-2H-苯并吡喃-3-甲酰胺），
[0113] -OcTMAB，即十八烷基三甲基溴化铵(abcam.com)，它靶向F Η结构域，
[0114] 一发动蛋白抑制肽(Tocris Biosciences 1774):具有氨基酸序列QVPSRPNRAP，
[0115] 一 Dyng〇-4a(IC5Q - 2·5μΜ)，它作用于 GTPase 变构位点，Dyngo_4a 的化学名称是 3-羟基-N ' -[ (2，4，5-三羟基苯基)亚甲基]萘-2-甲酰肼，
[0116] 一 RTIL-13(IC5Q - 2.3μΜ)，它是靶向PH结构域的去甲斑蝥素支架，RTIL-13的化学 名称是4-(Ν，Ν-二甲基-Ν-十八烷基-Ν-乙基)-4-氮杂-10-氧杂三环-[5.2.1 ]癸烷-3，5-二 酮溴化物。
[0117]发动蛋白2抑制剂的用途
[0118]本发明涉及通过向有需要的患者给予治疗有效量的如上述定义的发动蛋白2抑制 剂来治疗中央核性肌病的方法，还涉及此类发动蛋白2抑制剂在治疗中央核性肌病中的用 途。本发明还涉及发动蛋白2抑制剂在制造用于治疗中央核性肌病的药物组合物中的用途。 本发明还涉及用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂。
[0119] 此外，本发明涉及包含发动蛋白2抑制剂和任选的药学上可接受的载体的药物组 合物，具体而言用于中央核性肌病的治疗。
[0120] 在本发明具体的实施方式中，待治疗的疾病选自于由如下疾病所组成的组:X连锁 CNM(XLCNM)、常染色体隐性CNM(ARCM〇和常染色体显性CNM(ADCNM)。在更具体的优选实施 方式中，中央核性肌病是XLCNM(又称肌管肌病)或ARCNM。在另一个具体的实施方式中，中央 核性肌病是BIN1突变造成的中央核性肌病，该病理可以是隐性或显性的中央核性肌病。
[0121] 本文所使用的术语"治疗有效量"指的是给予患者的足以构成中央核性肌病的治 疗的治疗剂的量。在具体的实施方式中，待给予的治疗有效量是足以将发动蛋白2的表达、 活性或功能降低至正常水平的同等水平或优选地低于正常水平的量。正常水平为不表现出 中央核性肌病的受试者的发动蛋白2的表达、活性或功能(例如，如图1所示）。可通过本领域 普通技术人员公知的标准程序来确定待给予的发动蛋白2抑制剂的量。需要对患者的生理 数据(例如年龄、大小和重量）、给药途径和待治疗的疾病加以考虑来确定合适的剂量，任选 地与不表现出中央核性肌病的受试者进行比较。本领域技术人员将认识到的是，待给予的 发动蛋白2抑制剂或者载体(所述载体包含或表达特异性干扰发动蛋白2表达的核酸）的量 为足以诱发不期望的中央核性肌病症状得到改善的量。该量可以改变，尤其是依赖于如下 因素而改变:选定的发动蛋白2抑制剂，患者的性别、年龄、体重、整体身体状况等，并可基于 个案确定。该量也可根据治疗方案的其它组成因素（例如给予其它药物等)而改变。一般来 说，当发动蛋白2抑制剂是核酸时，合适的剂量范围为约1 mg/kg至约10 Omg/kg、更通常为约 2mg/kg/天至约10mg/kg/天。如果选择基于病毒的核酸递送，合适的剂量将依赖于不同因 素，如使用的病毒、递送途径(肌肉内、静脉内、动脉内或其它），但通常可为1〇_ 9病毒颗粒/kg 至1〇_15病毒颗粒/kg。如果抑制剂是抑制发动蛋白2的活性、表达或功能的小分子，每单位剂 量可以包含例如2mg/kg体重至300mg/kg体重、特别是5mg/kg体重至100mg/kg体重。如果抑 制剂是抗体，每单位剂量可以包含例如〇. lmg/kg体重至20mg/kg体重、特别是4mg/kg体重至 10mg/kg体重。本领域技术人员将认识到的是，此类参数通常是在临床试验过程中确定。此 外，本领域技术人员将认识到的是，通过本文所述的治疗，疾病症状可能完全缓解，然而并 非必须如此。即便部分的或间歇性的症状缓解对于接受者也可大有裨益。此外，对患者的治 疗可为单个事件，或在多个时机给予患者发动蛋白2抑制剂，依赖于获得的结果，所述多个 时机可相隔几天、相隔几个星期、或者相隔几个月、或者甚至相隔几年。
[0122] 按照本领域技术人员知晓的标准制药实践（参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第20版），A.R.Gennaro，Lippincott Williams&Wilkins编， 2000;以及Encyclopedia of Pharmaceutical Technology，J.Swarbrick和J.C.Boylan编， 1988_1999，Marcel Dekker，New York)来配制本发明的药物组合物。
[0123] 可能的药物组合物包括那些适于经口、直肠、阴道内、粘膜、局部(包括经皮、口腔 和舌下）、或胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、动脉内和皮内）给药的药物组合物。对于这 些制剂，可根据本领域技术人员公知的技术使用常规赋形剂。
[0124] 更具体而言，为了提供局部治疗效果，优选特定的肌肉给药途径。特别是优选肌肉 内给药。
[0125]可将根据本发明的药物组合物配制为在给药后实质上立即释放活性药物，或在给 药后的任意预定时间或时间段释放活性药物。
[0126] 在本发明的上下文中，术语治疗指治愈性的（curative)、对症的（symptomatic)和 预防性的处理。本文使用的术语疾病的"治疗"指的是任何旨在延长受试者(或患者)寿命的 行为，如疾病进展的延迟和治疗。可将治疗设计为根除疾病、阻止疾病进展和/或促进疾病 康复(regression)。术语疾病的"治疗"也指任何旨在减少与疾病相关的症状(如张力减退 和肌肉力弱）的行为。更具体而言，根据本发明的治疗旨在推迟中央核性肌病表型或症状的 出现，改善运动(motor)和/或肌肉行为和/或寿命，特别是通过挽救肌纤维细胞内组织化 (包括肌原纤维组织化、三联体结构和/或核定位)来实现。
[0127] 待治疗的受试者（或患者）是任何哺乳动物，优选是人。优选地，受试者是人患者 (无论其年龄或性别）。新生儿、婴儿、儿童也包括在内。
[0128] 发动蛋白2抑制剂的筛选
[0129] 本发明还涉及对有益于治疗中央核性肌病(优选为XLCW)的分子进行识别或筛选 的方法，所述识别或筛选基于此类分子抑制发动蛋白2的表达、活性和/或功能的能力。
[0130] 具体而言，本发明给出包含如下步骤的筛选方法：
[0131] a)提供或获得候选化合物；以及
[0132] b)确定所述候选化合物是否抑制发动蛋白2的活性、功能和/或表达；
[0133] c)其中，所述候选化合物抑制所述发动蛋白2的活性、功能或表达的能力指示所述 候选化合物表明了对于中央核性肌病治疗的有效性。
[0134] 在本方法的框架内，待测试的候选化合物可以是任何分子性质，例如，它可对应于 化学分子(优选小分子）、抗体、肽、多肽、适体、siRNA、shRNA、snRNA、正义寡核苷酸或反义寡 核苷酸、或核酶。
[0135] 可以使用本领域技术人员知晓的任何方法(例如上文指出或在实施例中描述的方 法)测试所述候选化合物抑制发动蛋白2的表达、活性或功能的能力。
[0136] 对适于治疗中央核性肌病的分子进行筛选或识别的方法可任选地进一步包括如 下步骤:在体内或体外将所选择的分子给予中央核性肌病非人动物模型或其部分(组织或 细胞，如肌肉组织或肌细胞），并分析对肌病发病或进展的作用。
[0137] 作为中央核性肌病非人动物模型，可以举出Mtml外显子4K0小鼠、MtmlR69C敲入小 鼠、MtmlTaconic基因陷阱（Mtml gt/y)、Dnm2敲入R465W小鼠、Mtml突变的拉布拉多寻回犬、 Binl突变的大丹犬、或在如下实施例中使用的小鼠。
[0138] 出于说明而并非限制的目的给出如下实施例。
[0139] 实施例
[0140] 实施例1
[0141] 材料。使用的一抗是：小鼠抗 DHPRadCavl · 1)亚基（MA3_920;Affinity Bioreagents)、α-辅肌动蛋白（EA-53, Si gma-Aldrich)、小窝蛋白 3(克隆 26, BD Biosciences)、结蛋白（Y-20 ; Santa Cruz Biotechnology)和甘油酸_3_磷酸脱氢酶 (GAPDH，MAB374 ; Chemicon)单克隆抗体；及兔抗RYR1 (由 Isabelle Marty，Grenoble Institut des Neurosciences，法国慷慨赠与）。兔抗DNM2抗体(R2680和R2865，在如下文献 中表征：Cowling，B.S.等，2011，Increased express ion of wild-type or a centronuclear myopathy mutant of dynamin 2in skeletal muscle of adult mice leads to structural defects and muscle weakness，Am J Pathol 178:2224_2235〇 Increased expression of wild-type or a centronuclear myopathy mutant of dynamin 2in skeletal muscle of adult mice leads to structural defects and muscle weakness，Am J Pathol 178:2224-2235)以及抗MTMl(R2827)(Hnia，K.等，J.2011， Myotubularin controls desmin intermediate filament architecture and mitochondrial dynamics in human and mouse skeletal muscle，J Clin Invest 121： 70-85)在IGBMC(法国）生产。Alexa缀合二抗购自Invitrogen。针对小鼠和兔IgG并缀合有辣 根过氧化物酶(HRP)的二抗购自Jackson ImmunoResearch Laboratories购买了如下产 品：Hoechst核染色（B2883，Sigma-Aldrich)、ECL化学发光反应试剂盒（Pierce )、 Lipofectamine?(Life Technologies) 、Tri试剂（Molecular Research Center, Ohio , USA)、SYBR Green IMaster试剂盒（Roche Diagnostics)、miScript逆转录试剂盒 (Qiagen)、特异性miScript 引物检测（Qiagen)和miScript Sybr green PCR试剂盒 (Qiagen)。患者对照活检AHJ38(1.5个月）和39(3.4个月）、使用的具有奶￥1突变的乂1^0#活 检是 AHJ35(15 天）（MTM1-内含子 ll-10A>GS420_R421insFIG)和 AHJ36(lm)(MTMl-c.445-49_ 445-4del)、l(MTMl-p.Leu213Pro)和 15(MTMl-p.Ileu466dup)和患者（patient) 12129/89 (MTMl-p · Val49Phef sX6，未发表）。
[0142] Dnm2杂合小鼠的生成。制造 Dnm2外显子8侧翼具有LoxP位点的靶向载体（图10)，然 后线性化，并电穿孔导入胚胎干(ES)细胞。将重组ES细胞注射入C57BL/6囊胚(该囊胚被植 入假孕雌性），并确定生殖系传递。交配并分析的小鼠为129pas系(CMV启动子）。
[0143] Mtml-/y/Dnm2杂合小鼠的生成。Mtml-/y小鼠的创建和表征先前已有描述(Buj-Bello，A.等，2002，The lipid phosphatase myotubularin is essential for skeletal muscle maintenance but not for myogenesis in mice，Proc Natl Acad Sci USA 99:15060-15065;Al-Qusairi，L等，2009，T_tubule disorganization and defective excitation-contraction coupling in muscle fibers lacking myotubularin lipid phosphatase，Proc Natl Acad Sci U S A 106:18763-18768)。使雌性杂合Mtml小鼠 129pas系与雄性Dnm2杂合小鼠交配，以在雄性后代中产生四种可能的基因型:Mtml+/yDnm2 +/+(WT);Mtml+/yDnm2+/-(Dnm2+/_);Mtml_/yDnm2+/+(称为Mtml_/y);和Mtml-/yDnm2+/-。 分析的全部小鼠为雄性。
[0144] Mtml-/yDnm2skm+/-和Mtml-/yDnm2⑴skm+/-小鼠的生成。人骨骼肌α肌动蛋白（HSA-Cre)C57BL/6和HSA Cre-ERTM、鼠来自 IGBMC(法国）（Schuler，Μ·等，2005，Temporally controlled targeted somatic mutagenesis in skeletal muscles of the mouse， Genesis 41:165-170;Miniou，P·等，1999，Gene targeting restricted to mouse striated muscle lineage，Nucleic Acids Res27: e27) 〇使Floxed Dnm2+/_小鼠与HSA-Cre小鼠和HSA Cre_ERT2交配，分别生成Cre-阳性Dnm2skm+/_和Dnm2skm(i)+/-小鼠D使雄性 Drnn2skm+A或Drnn2(i)skm+A小鼠与雌性小鼠交配。对具有如下基因型的雄性后代进行 了分析：品系 1，Mtml+/yDnm2+/+(WT)、Mtml-/yDnm2+/+(Mtml_/y)、Mtml-/yDnm2skm+/-;和品 系2，]\^1111+/：7〇111112+/+(?1')、]\^1111-/：7〇111112+/+(]\^1111-/：7)、]\^1111-/：7〇111112+/-!13六-〇^-81^ 2他莫 昔芬诱导(Mtml-/yDnm2(1)skm+A)小鼠。为了在出生后诱导切除Dnm2,每天对3周龄的小鼠注 射lmg他莫昔芬(浓度lmg/100μΙ)，注射3天。全部小鼠在16周龄时处死。分析的全部小鼠为 雄性、50 % 129pas 系(Mtml _/y) 50 % C57BL/6 系（HSA启动子）小鼠。
[0145] 动物实验。将动物安置在具有12:12小时光/暗周期的温控室（19_22°C)中。每周对 小鼠称重至一岁。根据动物实验的国家和欧洲法规，通过C0 2吸入后实施颈椎脱位，在需要 时将小鼠人道地处死。将肌肉与其它组织解剖出（当需要用于TEM时，使TA肌肉处于麻醉 下），并分别在液氮冷却的异戊烷和液氮中冷冻以用于组织学测定法和免疫印迹测定法。
[0146] Dnm2+/_小鼠的表型分析。利用EUM0DIC表型分析程序(http: //www. eumodic · eu/) 对10-15周龄的Dnm2杂合雄性和雌性小鼠进行表型分析，其结果为公众可得（http :// www. europhenome . org/)。这里展示的雄性小鼠 （n =每组10只）的血液化学、ECG测定、 Dexascan和肌电图测试作为EUMODIC表型分析程序（Institut Clinique de la Souris (ICS，Illkirch，法国，http: //www. ics-mci · fr/))的流程 1和流程2的一部分实施。
[0147] 线绳、抓握(2爪和4爪）、悬吊、旋转棒和足迹测试。线绳测试：以小鼠的前肢将其悬 在线材上，给予20秒使其后肢爬上线材。每只小鼠进行三次测试，测试间休息5分钟。掉落被 认为等于20秒（n =每组至少5只小鼠）。握力测试：把2个前爪或全部4爪放在测力计 (Bioseb，Chavi 1 le，法国）的网格上，并向相反的方向通过鼠尾拉小鼠。记录抓握失败之前 小鼠所产生的最大力量。每只小鼠进行三次测试，测试间休息30秒(2爪测试，n =每组至少5 只小鼠；4爪测试，n =每组5-7只小鼠）。悬吊测试:将小鼠悬吊于笼盖最长60秒。记录每次测 试小鼠掉下笼子的时间。每只小鼠进行三次测试。旋转棒测试：使用加速旋转棒测试 (Panlab，Bar Cel〇na，西班牙)对协调性和全身肌肉力量以及易疲劳性进行测试。小鼠被放 置在5分钟内从4rpm加速至40rpm的棒上。每天三次测试，测试间休息5分钟，第1天为训练 日，然后记录4天。对动物的延迟掉落(latency to fall)(以秒计)进行打分。对于上面列出 的各实验，计算三次测试的平均值(n =每组5-7只小鼠）。足迹测试:将小鼠的后足涂上无毒 墨水，并允许小鼠走过地面衬有纸的隧道(长50cm，宽9cm，高6cm)。随后使用ImageJ分析程 序从产生的足迹模式测量后肢之间的角度。对每只小鼠分析至少6个足迹(n =每组5-8只小 鼠）。
[0148] 体积描记测定。该测试用于测定未受约束未受刺激小鼠的自主呼吸模式，使用全 身气压体积描记器(EMKA Technologies)(在ICS，Illkirch，法国）（n =每组3-5只小鼠）进 行。
[0149] 了六肌肉收缩性能。如前所述((：〇￥1丨邱，8.3.等，2011，舳了？3让〇1178:2224-2235 ; Vignaud，A.等，2005，Exp Physiol 90:487_495;Vignaud，A·等，J Biomed Biotechnol 20 10 : 724914)，通过原位测定响应于神经和肌肉刺激的肌肉等长收缩（isometric contraction)来评估肌肉力量测定。显示了来自于神经刺激的结果(n =每组5-11只小鼠）。 以到达所产生的最大力量的50%所花费的时间来测定疲劳。收缩测定后，通过颈椎脱位处 死动物。然后解剖出TA肌肉并称重，以确定比最大力量。
[0150] 膈肌收缩性能。如前所述(50)，在来自于肋骨膈膜腹侧部分的肌肉条上评估膈膜 等长收缩。简而言之，每只小鼠原位解剖出两个肌肉条。各肌肉被安置在含有Krebs-Henseleit溶液的组织室中。使用95%〇2-5%C〇2的气体混合物对溶液进行吹气，并保持在27 °C、pH 7.4。用弹簧夹夹住肌肉末端，并连接至电磁力传感器。借助平行于肌肉放置并传递 时长为lms的电刺激的2个铂电极对膈膜条进行电刺激。确定力-频率曲线。在1 OOHz的刺激 频率、400ms的训练时长下获得绝对最大力量。在实验结束时，由肌肉重量与最佳肌肉长度 (Lo)的比率来计算每一个肌肉横截面积（以mm 2计），假定肌肉密度为1.06。将总等长峰值力 量相对于每个横截面积进行归一化，以获得总张力，以mN.mnf 2计(n =每组3-5只小鼠）。
[0151] Western印迹。在冰上将小鼠肌肉切碎并在10倍重量/体积的l%NP-40Tris-Cl缓 冲液(pH 8)中均质化3 X30s(Ultra Turrax均质机），然后在4°C提取30min。采用DC蛋白测 定试剂盒(Bio-Rad Laboratories)确定蛋白浓度，并借助SDS-PAGE和硝酸纤维素膜上的 Western印迹对裂解液进行分析。使用的一抗是·Μ2-Κ2680( 1:500)、DNM2-R2865(1:500)、 1?￥1-1?2827(1:500)和64?0!1(1:10,000) ;二抗是抗兔!11^或抗小鼠!11^(1:10,000)。对 Western印迹膜进行扫描，并使用ImageJ软件(Rasband，W. S.，ImageJ，美国国立卫生研究 院，Be thesda，Mary land，USA，http: //rsb · info · n ih · gov/ij/，1997-2009)确定带强度。按 照对应的总GATOH值对密度测定值进行标准化，并以相对于所列出的对照的倍数差异表示 (n =每组5-7只小鼠）。
[0152] qRT-PCR分析。使用Tri试剂（Molecular Research Center，0hio，USA)从8周龄腔 骨前肌骨骼肌裂解液提取总RNA，并使用Oligo dT引物进行反转录和扩增。然后使用 LightCycler 480(Roche Diagnostics，Meylan，法国）与 DNM2 引物（正向引物 CCAACAAAGGCATCTCCCCT(SEQ ID No 28);反向引物TGGTGAGTAGACCCGAAGGT(SEQ ID No 29)，以GAFOH mRNA为标准，使用SYBR Green IMaster试剂盒（Roche Diagnostics)进行实 时定量RT-PCR。将结果相对于对应的总GAPDH值进行标准化，以相对于WT同窝对照的倍数差 异表示(n =每组2-3只小鼠，进行三次重复）。
[0153] 骨骼肌的组织学与免疫荧光分析。制备小鼠骨骼肌的冷冻纵切片和冷冻横切片(8 μπι)，固定并使用针对DHPRcn (1: 1〇〇)、RYR1 (1: 200)、α-辅肌动蛋白（1:1，〇〇〇)、小窝蛋白3 (1:1，000)、DNM2-R2680( 1:200)、MTM1-R2827( 1:200)和结蛋白（1:100)的抗体染色。通过用 H〇echSt(Sigma-Aldrich)共染10分钟检测核。借助激光扫描共聚焦显微镜(TCS SP5;Leica Microsystems，Mannheim，Germany)对样品进行观察。将空气干燥的横切片固定，并使用苏 木精和伊红（HE)或琥珀酸脱氢酶（SDH)进行染色，通过配备有荧光模块L11600-21 (Hamamatsu Photonics，日本）的玻片扫描仪NanoZoomer 2HT或DMRXA2显微镜（Leica Microsystems Gmbh)进行图像采集。使用FIJI图像分析软件在来自于ΤΑ小鼠骨骼肌的HE切 片中对横截面积(CSA)进行分析。由每组4-7只小鼠计算CSA(ym 2)(每只小鼠>500个纤维）。 使用ImageJ图像分析软件中的细胞计数器插件，在来自于4-6只小鼠的>500个纤维中，对具 有中央化的核或内部化的核的TA肌纤维的百分比进行计数。
[0?54] 透射电子显微镜。通过腹腔内注射每克体重10μ1氯胺酮（20mg/ml，Virbac， Carros，France)和甲苯噻嗪（0 · 4%，Rompun，Bayer，Wuppertal，德国）将小鼠麻醉。用0 · 1M 二甲胂酸盐缓冲液(pH 7.2)中的2.5%戊二醛固定ΤΑ肌肉活检样本，并如先前描述进行加 工（Buj-Bello，A.等，2002，Proc Natl Acad Sci U S A 99:15060-15065;Cowling，B.S. 等，2011，Am J Pathol，178: 2224-2235)。在肌肉纵切片上识别三联体结构，并对每肌小节 的三联体数目进行定量。如前所述(Amoasii，L.等，2012，PL〇S Genet，8:e100 2965)，通过将 清楚识别的三联体数目除以存在于图像中的肌小节总数来计算三联体/肌小节的比例。每 只小鼠对40-80个三联体进行计数。
[0?55]显微术与统计分析。全部显微术在IGBMC成像中心实施。将显微术的全部样品封装 于Fluorsave试剂(reagent) (Merck)中并在室温观察。利用配备有彩色CCD相机(Coolsnap cf colour，Photometries)的焚光显微镜（DM4000;Leica microsystems)实施光学显微术。 使用共聚焦激光扫描显微镜(TCS SP2或SP5;Leica Microsystems，Mannheim，德国）实施共 聚焦显微术。使用ImageJ和FIJI分析软件进行图像分析。除非另有说明，采用非配对学生t 检验进行统计分析。认为P值〈0.05为显著。
[0156] 研究批准。动物实验经由机构伦理委员会Com'Eth IGBMC-ICS(2012-128)批准。全 部的人活检样本都是在获得知情同意后使用的。
[0157] 结果
[0158] Dnm2杂合(Dnm2+/_)小鼠的创建和表征。之前显示，在胚胎发生过程中Dnm2的组成 型敲除是早期致死的（Ferguson，S.M.等，2009，Coordinated actions of actin and BAR proteins upstream of dynamin at endocytic clathrin-coated pits,Dev Cell 17: 811-822)。通过靶向Dnm2的外显子8创建Dnm2敲除(Dnm2-/_)小鼠（图10)(详见方法部分）。 在100个幼崽中，我们没有识别出任何Dnm2-/_小鼠，证实Dnm2-/_是胚胎致死的。识别了如 孟德尔遗传比率所预期的杂合(Dnm2+/_)幼崽，并借助EUM0DIC表型分析程序对这些幼崽进 行了进一步的分析(详情见方法部分和http: //www. eumodic. eu/)。基本的血液化学测试表 明，野生型(WT)和杂合(Dnm2+/_)小鼠在尿素(表明正常肾功能）、钙(渗透稳态)和总胆固醇 (表明没有心血管疾病)水平上没有差异（图11A)。正常ECG测量说明心脏的电活动没有改变 (图11B)。整体上体重未表现出明显差异（图11C)，WT和Dnm2+/_小鼠在瘦质组织或脂肪的量 上也没有差异（图11D)。然后进行基本肌肉功能测试。肌电图测试显示单神经传导速度 (SNCV)没有差异（图11EKWT和Dnm2+/_小鼠胫骨前肌(TA)肌肉质量相似（图11F)，并且未检 测到TA肌肉在绝对最大力量或比最大力量或易疲劳性上的差异（图11G-I)，总体上表明 Dnm2+/_小鼠在临床上和生理上类似于WT小鼠，在肌肉功能上没有可检测的差异。
[0159] X连锁中央核性肌病中的·Μ2水平。在研究·Μ2下调在XLC匪中的治疗潜力之前， 通过western印迹分析检查来自于XLCNM患者的肌肉裂解液的DW2蛋白水平（图1Α)。与年龄 匹配的对照活检相比，来自于所测试的五个新生儿XLC匪肌肉活检中识别出·Μ2蛋白表达 的1.5倍增加（图1Β)。然后确认在XLC匪动物模型中是否也观察到DNM2表达增加。本研究采 用了之前表征过和准确再现XLCNM的小鼠（Buj_Bello，A.等，2002，Proc Natl Acad Sci U S A 99:15060-15065;Al-Qusairi，L.等，2009，Proc Natl Acad Sci U S A 106: 18763-18768;Amoasii，L.等，2012，PLoS Genet 8:e100 2965)。与WT同窝对照相比，来自于5 周龄Mtml-/y小鼠的ΤΑ肌肉裂解液表现出DNM2水平显著增加（图1C、图ID)，表明增加的DNM2 与XLC匪表型相关。在膈肌中也观察到DW2表达的增加（图1E、图1F)，且该肌肉表现出在组 织学上受到影响，具有更多的包含错误定位的核的萎缩的纤维（图1G)。这一发现表明，呼吸 功能不全是造成Mtml _/y小鼠死亡的原因。
[0160] 降低·Μ2的表达大幅延长小鼠的寿命。在Dnm2+/_小鼠中，在基因水平上 将DNM2降低至50%没有可检测的临床或生理影响。为了测试发动蛋白2表达的降低是否可 以挽救由MTM1突变造成的X连锁C匪，使Mtml+/_小鼠与Dnm2+/_小鼠杂交，以产生Mtml-/ yDnm2+/_雄性后代。如以往所报道的，大多数Mtml-/y小鼠在1-3月龄间死亡(Buj-Bello，A. 等，2002，Proc Natl Acad Sci U S A 99:15060-15065)，而100%的Mtml-/yDnm2+/_小鼠 存活至少一年（图2A)，与WT小鼠相比体重无显著差异（图2B)，表明降低·Μ2的表达可以挽 救在小鼠中观察到的早期致死。未处死的Mtml-/yDnm2+/_小鼠现在已超过2岁。在 8w时（约60 %的小鼠仍存活），通过常规检查无法将Mtml-/yDnm2+/_小鼠与WT小鼠 区分开，而Mtml _/y小鼠显示出运动和活动的显著减少。
[0161 ] 对来自于不同年龄的几种肌肉的裂解液进行western印迹分析，以确定D匪2蛋白 表达的水平。正如预期的那样，与WT小鼠相比，8周龄(8w)和6月龄(6m)的Dnm2+/_和Mtm 1 -/ yDnm2+/_小鼠膈肌中的·Μ2蛋白水平均减少约50% (图2C)。8w时，与WT小鼠相比， 小鼠表现出膈膜中DNM2的增加，这与5周龄小鼠的结果相一致（图IF)。在腓肠肌（图2D)、胫 骨前肌（图2E)和比目鱼肌（图2F)肌肉中，在8w、16w和6m观察到同样的趋势（图14)。因此与 WT小鼠相比，不同年龄Mtml_/y小鼠的不同肌肉中·Μ2水平一致增加，不同年龄Dnm2+/_和 Mtml -/yDnm2+/_小鼠的不同肌肉中·Μ2水平一致减少。
[0162] 为了确定不同的·Μ2蛋白表达是否归因于蛋白合成的改变，对8w的ΤΑ肌肉裂解液 进行 qRT-PCR 分析。与 WT和 小鼠相比，Dnm2+/_和 Mtml-/yDnm2+/_小鼠中Dnm2的mRNA 水平都明显减少（图2G)，这与·Μ2蛋白表达相关联（图2E)。有趣的是，与WT小鼠相比，在 Mtml _/y肌肉裂解液中Dnm2mRNA表达未见显著增加，表明在Mtml _/y肌肉中DNM2蛋白表达的 增加可能是由于DNM2稳定性的增加或降解的减少，而不是转录的升高。
[0163] 由于TA肌肉是Mtml-/y小鼠中最受影响的肌肉之一，通过免疫荧光分析研究了 8w 小鼠 ΤΑ肌肉中的MTM1和·Μ2定位。由α-辅肌动蛋白染色所识别出的Z线表现为相对未受干 扰（图12Α)。在Mtml-/y和Mtml-/yDnm2+/_小鼠中，DNM2与α-辅肌动蛋白共定位于Ζ线，并显 示相对未受干扰（图12Α)。正如所预期的，在Mtml-/y和Mtml-/yDnm2+/_小鼠中几乎检测不 到肌管素（图12B)。总之，DNM2的表达降低将Mtml-/y小鼠的寿命和体重挽救至野生型水平。 [0 164] 通过降低DNM2表达挽救Mtml-/y小鼠的肌肉萎缩。为了进一步分析Mtml-/y小鼠中 DW2表达降低的影响，测定了不同肌肉的质量。在Mtm卜/y小鼠中快速抽搐的腓肠肌萎缩， 然而对Mtml-/yDnm2+/_小鼠分析至1岁仍未观察到萎缩（图2H)。同样，与WT小鼠相比，在直 至1岁的Mtml-/yDnm2+/_小鼠中，其它快速抽搐的肌肉（EDL和跖肌)未表现出萎缩（图13A、 图13B)。8w时，与Mtml-/yDnm2+/_、WT和Dnm2+/_小鼠相比，在Mtml_/y小鼠中表征最多的TA 肌肉在Mtml_/y小鼠中表现出强烈的萎缩（图21)。在这个年龄，Mtml-/yDnm2+/_的TA重量与 WT小鼠无法区分。在16w，与Mtml_/y小鼠不同，Mtml-/yDnm2+/_小鼠仍然存活（图2A)，并且， 与WT和Dnm2+/_小鼠相比，表现出一些TA萎缩，这表明在Mtml-/yDnm2+/_小鼠中TA萎缩推 迟。有趣的是，在8周时，在Mtml-/y小鼠中缓慢抽搐的比目鱼肌表现出萎缩，而与WT小鼠相 比，在Mtml-/yDnm2+/-小鼠中直至1岁都没有萎缩出现（图2J)。当测定相对于体重的总肌肉 质量时，观察到类似的结果（图13C-图13E)。未观察到Mtml-/yDnm2+/_和WT小鼠之间肝脏或 心脏重量的差异（图13F、图13G)。因此，在Mtml-/y小鼠中随着DNM2表达的降低，腓肠肌和比 目鱼肌的肌肉萎缩被完全挽救，且TA肌肉中肌肉萎缩强烈推迟。
[0165] 通过降低DNM2表达，Mtml-/y小鼠的CM1组织学特性被大幅挽救。CNM在组织学上表 现为内部核错误定位和肌纤维发育不良。对两个主要的时间点进行了分析：早期（8周龄 (8w))，此时大部分Mtml-/y小鼠还活着;和晚期（16周龄（16w))，此时95%的小鼠已 经死亡。在8w，Mtm 1 _/y TA肌肉表现出特征性的核错误定位（图3A、图3F)、减少的纤维大小 (图3A、图3D)和具有肌膜下及中央聚集的异常SDH染色（图3A)。如就腓肠肌和比目鱼肌所观 察到的，Mtml-/yDnm2+/-TA肌肉在组织学上类似于WT和Dnm2+/_小鼠（图13H、图131)，SDH染 色中只有少数异常纤维（图3A)。纤维发育不良得到挽救，并且与小鼠相比，内部核 和中央核显著减少（图3A、图3D、图3F)。此外，围绕核的膜堆积减少（图3B)。至16周，来自于 Mtml-/yDnm2+/-小鼠的TA肌肉表型是混合的，一些区域表现为健康，而其它区域类似于8w 的Mtml-/y小鼠，具有肌纤维发育不良、核错误定位和异常SDH染色（图3C、图3E、图3F)。随后 分析了在Mtm 1 _/y小鼠中显示被破坏的结蛋白（MTM1结合伴侣）定位(Hn ia，K.等，2011，J Clin Invest 121:70-85) Itml-zV小鼠显示出结蛋白定位中的强烈扰动，这在Mtml-/ yDnm2+/_小鼠中几乎没有观察到（图15A)，表明正常的结蛋白定位在8w的Mtml-/yDnm2+/-小鼠中得以恢复。总之，这些结果表明，通过发动蛋白2蛋白表达的降低，Mtml-/y小鼠中不 同肌肉的CNM表型的呈现被挽救或强烈推迟。
[0166] 减少·Μ2表达改善小鼠的肌肉力量和表现。为了确定降低·Μ2表达除挽 救Mtml-/y小鼠的组织学表型以外是否还挽救功能表型，进行了各种测试。线绳测试要求借 助前爪悬吊的小鼠举起后肢并用后肢抓住棒。直到8w时，Mtml-/y小鼠在数次测试中从线绳 上掉落而无法进行测试，而Mtml-/yDnm2+/-小鼠以类似于WT和Dnm2+/_小鼠的情况进行了 测试(图4A)，表明在该年龄全身力量得到挽救。在8w和16w在TA肌肉中测量绝对最大力量和 比最大力量(相对于肌肉质量）。在8w时，Mtml-/y小鼠表现出极弱的绝对最大肌肉力量和比 最大肌肉力量，而Mtml-/yDnm2+/_小鼠以类似于WT和Dnm2+/_小鼠的情况进行了测试（图 4B、图4C)。在16w，Mtml-/yDnm2+/_小鼠的TA肌肉的最大力量减小，这与组织学数据相一致。 此外，在8w未观察到易疲劳性的变化，然而在16w，TA肌肉疲劳快于对照（图4D)。值得注意的 是，在组织学和生理学上，16w的Mtml-/yDnm2+/_小鼠的表现优于8w的Mtml-/y小鼠，这表明 疾病的进展减慢;或者，正如在16w的TA肌肉的组织学上观察到的混合表型所表明的，在一 些而不是全部肌纤维中得到挽救。与Mtml-/y小鼠相比，Mtml-/yDnm2+/-小鼠中TA肌肉的整 体萎缩和降低的最大肌肉力量得到减弱和强烈推迟。
[0?67] Mtml-/yDnm2+/_小鼠改善的肌肉超微结构。下面确认Mtml-/yDnm2+/_肌肉的超微 结构是否得到挽救。对来自于8w和16w的Mtml-/yDnm2+/_小鼠的TA肌肉实施透射电子显微 术(TEM) Jw的Mtml-/yDnm2+/-TA在形态学上类似于WT和Dnm2+/_小鼠，具有对齐的Z线和肌 小节，且无明显线粒体结构异常;而Mtml-/y肌肉显示异常线粒体形状、异常膜堆积和Z线对 齐错误以及改变的肌原纤维宽度（图5A)。值得注意的是，来自于16w的Mtml-/yDnm2+/_小鼠 的肌肉是非均质的，一些区域表现为健康（图5B，左下），而其它区域表现出被干扰(右下）。 此外，在16周龄Mtml-/yDnm2+/-小鼠的一些区域中可检测出线粒体异常，这在8周不明显。 这支持了我们先前的组织学和生理学结果，表明在不同的时间点，Mtml-/yDnm2+/-TA肌肉 中的CNM表型被部分但实质性地挽救。
[0168] 在Mtm 1 -/yDnm2+/_小鼠中三联体结构正常化。CNM患者和CNM动物模型之间享有的 共同特征为骨豁肌内三联体的结构和位置的破坏（Toussaint，A.等，2011，Defects in amphiphysin 2(BIN1)and triads in several forms of centronuclear myopathies, 八(^&如111'〇卩&1:11〇1 121:253-266;0〇￥1;[叫，]\]\，等，2009，1^〇88〇;1^1117〇1：1113111&1'；[11 function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy，PLoS Genet 5:e100 0372;Al-Qusairi，L.等，2009，T_tubule disorganization and defective excitation-contraction coupling in muscle fibers lacking myotubularin lipid phosphatase,Proc Natl Acad Sci USA 106： 18763_18768;Beggs等，2010，MTMlmutation associated with X-linked myotubular myopathy in Labrador Retrievers，Proc Natl Acad Sci U S A 107:14697-14702)。为 了确定在Mtml-/yDnm2+/_小鼠中三联体结构是否受到影响，通过免疫标记检查三联体标志 物的定位。发现于成熟肌肉横小管（T-tubules)上的电压依赖性|丐通道DHPRa定位于WT和 Dnm2+/_小鼠的TA肌纤维内的punctuate结构中，与横小管定位相一致（图15B)。然而，在 Mtml-/y肌肉中这一特异性染色消失，表明横小管的严重破坏。在Mtml-/yDnm2+/_肌肉中， DHPRa的定位与WT和Dnm2+/_肌肉相似，表明在这些小鼠中横小管结构得到挽救。通过对肌 肉切片进行兰诺定受体(RyRl)(所述RyRl为特异性定位于三联体的肌质网的钙通道)染色 证实了这一点。横切图像显示了来自于Mtml-/yDnm2+/_小鼠的大多数纤维中RyRl定位得到 挽救，只有少数纤维显示出如在Mtml-/y小鼠中普遍观察到的RyRl堆积（图6A)。在纵切图像 上观察到在WT和Dnm2+/_肌肉中的Z线（以a-辅肌动蛋白标记)周围的双重RyRl染色，这与三 联体定位相一致。Mtml-/y肌肉中该染色被严重扰乱，而在Mtml-/yDnm2+/_肌肉中得到部分 挽救。为了进一步分析三联体，获取来自于8w小鼠的高放大倍数TEM照片。观察到与WT和 Dnm2+/_小鼠相比，小鼠中横小管/三联体结构被严重破坏，而在Mtml-/yDnm2+/_小 鼠中正确定位的三联体清晰可见（图6B)。三联体分析证实，在WT、Dnm2+/_或Mtml-/yDnm2 +/_小鼠中，每肌小节的三联体数量没有差异，而Mtml-/y小鼠表现出每肌小节的三联体数 量减少（图6C)。因此，在8w的Mtml-/yDnm2+/_小鼠中，三联体的定位和结构得到挽救。
[0169]在肌肉发育和再生过程中小窝蛋白3位于横小管，而在成熟的肌肉中，小窝蛋白3 主要定位于肌膜（在Miniou，P.等，1999，Gene targeting restricted to mouse striated muscle lineage，Nucleic Acids Res 27:e27中进行综述）。为了确定在Mtml_/y和Mtml-/ yDnm2+/_小鼠中小窝蛋白3定位是否被扰乱，使用小窝蛋白3抗体对肌肉横切片进行染色。 WT和Dnm2+/_肌肉示出小窝蛋白3如预期的那样定位于肌膜，而来自于Mtml-/y小鼠的许多 纤维表现出小窝蛋白3强烈的内部染色模式（图6D)。这种表型在Mtm卜/yDnm2+/_肌肉中得 到大幅挽救，只是偶尔有纤维显示出小窝蛋白3的内部定位。
[0170] Mtm 1 -/yDnm2+/_小鼠的长期生理表型。XLC匪在患者中的存在伴有非常严重的肌 肉力弱，并且在Mtml-/y小鼠中为1-3月内致死;然而，在这些小鼠中降低发动蛋白2表达挽 救了寿命，并在8w和16w大幅改善了肌肉力量。对更晚时间点的Mtml-/yDnm2+/_小鼠的表型 进行确定，以评价与正常寿命匹配的肌肉功能程度。6月龄和12月龄的Mtml-/yDnm2+/-小鼠 能够移动并完成基本任务。老年Mtml-/yDnm2+/_小鼠看起来类似于WT小鼠（图7A)，但出现 了行走时后足外翻。通过将后足放在墨水中并测量行走时后足之间的角度对此进行定量 (图16A;图7B)。该特征在6-12m后不再发展，因为两种月龄的测定结果相似。为了确定这些 小鼠的整体最大腿部力量，使用测力计进行握力测试。当仅测定两只前爪时，在最初的12个 月，WT或Mtm卜/yDnm2+/_小鼠之间未观察到区别（图S7B)。当测定四只爪子时，在6m和12m， 观察到与WT小鼠相比，Mtml-/yDnm2+/_小鼠力量均小幅减少（图7C)，表明与WT小鼠相比 Mtm 1 _/y Dnm2+/-小鼠的后肢表现出最大肌肉力量降低，该降低不是进展性的。对总体运动 协调性、力量和耐力进行的旋转棒测试在6m或12m未观察到差别（图7D)，证实Mtm 1 _/yDnm2 +/_的总体协调性和整体力量未被严重扰乱。悬吊测试是需要将小鼠悬吊于笼盖60秒的大 运动量测试。受到严重影响的Mtml-/y小鼠在1月龄之后不能完成该测试（图7E)。作为比较， 直至12个月的最后测试年龄，老年Mtml-/yDnm2+/_能够完成该测试，尽管比WT和Dnm2+/_小 鼠完成程度低（图7E)。鉴于Mtml-/yDnm2+/_小鼠直至12个月都能够成功地完成基本运动强 度测试，我们的结论是疾病表型并未随时间发展，寿命和基本运动功能得到挽救。
[0171] Mtml-/yDnm2+/_小鼠中长期膈膜功能正常。显示在XLCNM模型中，单个肌 肉似乎受到不同影响，并由于DW2的减少而被不同程度地挽救（图2C-J;图13)。因为XLCNM 患者患有危及生命的呼吸衰竭，XLCNM患者寿命的主要关注点在于膈膜的持续(ongoing)功 會泛（Jungbluth，H.，Wallgren-Pettersson，C.^PLaporte，J.，2008，Centronuclear (myotubular)myopathy，Orphanet J Rare Dis 3:26)。此外，在5界的]\11：1111-/：7小鼠中膈膜组 织学被强烈改变（图1G)。因此测试了6m Mtml-/yDnm2+/_小鼠的膈肌功能。利用体积描记测 试测量静息状态下小鼠的自主呼吸模式。Mtml-/yDnm2+/_小鼠与WT和Dnm2+/_小鼠表现相 似，未检测到显著差异（图17和图7F)。测定了分离的膈肌条的比最大力量。未检测到力量-频率关系的显著差异，然而观察到比最大力量的减少（图7G)。组织学上Mtml-/yDnm2+/_膈 肌与WT和Dnm2+/_肌肉相似，未观察到核位置或纤维化的重大改变（图7H)。与在5w(图1E、图 1F)和8w(图2C)DNM2蛋白水平升高的小鼠相比，在6m时Mtml-/yDnm2+/_小鼠的膈肌 中维持降低的·Μ2蛋白水平（图2C)。总体上Mtml-/yDnm2+/_小鼠的膈肌与对照小鼠没有区 另IJ，支持了通过·Μ2减少XLCNM表型得到大范围表型改善这一结果。
[0172] 在Mtml_/y小鼠中·Μ2的肌肉特异性减少足以挽救表型并改善寿命。在本研究中， 通过在子宫内在全部组织中降低·Μ2表达，我们能够充分挽救小鼠的寿命以及疾 病的大多数临床特征和组织学特征。为了测试肌肉表型的挽救是否是细胞自发的，获得了 人骨骼肌α-肌动蛋白（HSA)-Cre和HSA Cre-ERT2小鼠（Schuler，M·等，2005，Temporal ly controlled targeted somatic mutagenesis in skeletal muscles of the mouse， Genesis 41:165-170)，使它们与floxed Dnm2小鼠杂交以产生Dnm2skm+/-(Cre阳性)和Dnm2 (i)skm+A(Cre-ERT2)杂合小鼠。使这些小鼠再与Mtml-/y小鼠杂交以产生该背景下的DNM2组织 特异性切除。当降低肌肉中的·Μ2表达(Mtml-/yDnm2skm+/-，由9d. p. c .活化的HSA启动子） (Miniou，P.等，1999，Gene targeting restricted to mouse striated muscle lineage， Nucleic Acids Res 27:e27)，Mtml-/yDnm2skm+/-小鼠的寿命增加，75%的小鼠存活直到至 少16周，而没有小鼠存活到这个年龄（图8A)，这与Mtml-/yDnm2+/_小鼠的结果相一 致（图2A)。使得4只WT和4只Mtml-/y Dnm2skm+/1、鼠的同期群继续存活，用于未来的长期分 析，全部小鼠现在为9-12月龄。与小鼠相比，在Mtml-/yDnm2 skm+A小鼠中观察到体重 相应增加（图8B)。在Mtml-/yDnm2skm+/-小鼠和WT小鼠之间，未观察到腓肠肌或比目鱼肌的质 量差异（图8C)。在16周，当全部同窝小鼠死亡时，与WT同窝小鼠相比，Mtml-/ yDnm2skm+A小鼠的ΤΑ肌肉表现出一些肌肉萎缩，伴有肌肉质量以及纤维大小的减少(与增加 的中央核和内部核有关）；并表现出一些异常SDH染色（图8D-F)，与来自于16周龄Mtml-/ yDnm2+/_小鼠的ΤΑ肌肉相似（图2)。这些改变不如在8w的小鼠中看到的明显。重要 的是，与WT小鼠相比，腓肠肌和比目鱼肌的纤维大小或核位置并没有表现出显著的差异（图 18A-D)，表明在不同肌肉中表型的挽救不同。检测了在16w不同肌肉中的·Μ2蛋白水平，与 WT相比，在膈膜中·Μ2表达显著减少，但是在其它所测量的肌肉中未减少（图8G、图S9E-图 S9H)。不能获得这个年龄的小鼠从而比较DW2水平，在这些肌肉中DW2水平在更年 轻的时间点增加（图2)。由于膈膜是呼吸所需的至关重要的肌肉，在这里DNM2表达的降低对 于增加 Mtml-/yDnm2skm+/-小鼠的存活而言可能是重要的。在小鼠的膈肌中DNM2表达 的降低对于XLCNM的挽救似乎是决定性的。
[0173] 出生后·Μ2的肌肉特异性减少足以挽救小鼠。在HSA-Cre ERT2体系下使 Mtml-/y小鼠与Dnm2+/_小鼠杂交，允许出生后通过他莫昔芬注射诱导肌肉内·Μ2的切除 (Schuler，Μ·等，2005，Temporally controlled targeted somatic mutagenesis in skeletal muscles of the mouse，Genesis 41:165-170)。重要地，在小鼠3周龄时，在诸如 肌肉萎缩(图2)和核中央化的症状发作后实施他莫昔芬注射(Al-Qusairi，L.等，2009，Proc Natl Acad Sci U S A 106:18763-18768)。70%经注射的Mtml-/yDnm2⑴skm+/-小鼠存活至 少至16周（图9A)。与Mtml_/y小鼠相比，观察到更大的体重，然而与WT小鼠相比，16周时体重 仍然显著降低（图9B)。与较早时间点的Mtml-/y小鼠（图2)不同，在16周，与WT小鼠相比，未 观察到腓肠肌、比目鱼肌或TA肌肉的归一化质量的差别（图9C)。对Mtml-/yDnm2 (1)skm+A小鼠 TA肌肉的进一步分析显示，肌肉表现出一些纤维发育不良（图9D、图9E)，并伴有增加的中央 核和内部核以及异常SDH染色（图9D、图9F)，这与来自于16周Mtml-/yDnm2+/_的TA肌肉（图 3)类似。注意到与WT小鼠相比，来自于16周Mtml-/yDnm2(i)skmV-小鼠的腓肠肌中DNM2蛋白表 达减少，然而在TA肌肉和膈肌中观察到·Μ2蛋白表达的增加（图9G、图S10)。这些差异可能 是由于他莫昔芬介导的Cre重组酶活化时DW2切除效率的不同。在16w膈膜中DW2表达的增 加可能与8-16周龄Mtml-/yDnm2 (1)skm+A小鼠存活率的降低相关联。因此，可以得出这样的结 论:在出生后，在Mtml-/y受影响的年龄，肌肉中DW2水平的降低足以改善小鼠中观 察到的寿命和CNM表型。
[0174] 实施例2
[0175] 材料和方法与实施例1中使用的材料和方法相同或等同。
[0176] Binl-/-小鼠是用于ARCNM的小鼠模型，出生后存活不超过24小时。
[0177] 如下表1显示了从具有不同基因型的小鼠所获得的结果。
[0178] 表1
[0180] Binl-/-小鼠在围产期死亡。在由Binl+/_雄性与Binl+/_雌性杂交获得的数窝幼 崽出生后的几天进行基因型计数，显示没有Binl-/-基因型。
[0181] 作为·Μ2的下调可以明显改善用于ARC匪的小鼠模型（Binl-/-小鼠）的表型的说 明，B i η 1 -/-小鼠中发动蛋白2降低50 %可以有效挽救早期致死，使B in 1 -/-Dnm2+/_小鼠存 活至少12个月（图20)，该小鼠具有亚正常体重（图20)和正常的比肌肉力量、抗疲劳性、力量 和协调性行为（图21)。组织学检查和定量显示，直至至少12月龄，Binl-/-Dnm2+/_肌肉具有 正常的纤维形状和大小、正常的氧化染色和略有增加的中央核，没有过度再生的迹象（图 22-23) 〇
[0182] 因此，·Μ2减少可显著改善小鼠中数种形式的CW(在Mtm 1 _/y小鼠中为XLC匪，在 Binl-/-小鼠中为ARCNM)。
[0183] 实施例3:
[0184] 材料和方法
[0185] 生产和纯化AAV:
[0186] 利用pAAV2插入物、pXRl和pHelper对AAV-293细胞系进行三重转染，生成AAV2/9载 体;所述PAAV2插入物包含在CMV启动子控制下、侧翼具有血清型2反向末端重复的插入物； 所述pXRl包含AAV血清型9的rep和cap基因；所述pHelper编码腺病毒辅助功能。对细胞裂解 液进行3次冻融循环，然后用50U/mL Benzonase(Sigma)在37°C处理30分钟，并通过离心澄 清。使用离心过滤器（Amicon Ultra_15Centrifugal Filter Devices 30K，Millipore， Bedford)进行碘克沙醇梯度超速离心、随后相对于Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水进行透析并 浓缩，纯化病毒载体。借助实时PCR，使用质粒标准pAAV-eGFP，对物理粒子进行定量，以每毫 升病毒基因组(vg/ml)示出效价。在这些实验中使用的rAAV效价为5 X 10n-7 X 10nvg/ml。
[0187] 小鼠的野生型胫骨前肌(T.A)和腓肠肌的AAV转导：
[0188] 通过 i ·ρ·注射5yl/g氣胺酬（20mg/ml; Virbac，Carros，France)和甲苯噻嘆 (0 · 4 %，Rompun; Bayer，Wuppertal，德国）将3周龄的雄性野生型129PAS小鼠麻醉。向左腿肌 肉注射25μ1 AAV2/9shDnm2编号C，并向右腿肌肉注射等量的干扰型AAV2/9。动物被安置在 具有12:12小时光/暗周期的温控室（19-22Γ)中。根据动物实验的国家和欧洲法规，通过 C02吸入后实施颈椎脱位处死小鼠。注射后5周将TA和Gast.肌肉解剖出、称重，并在液氮冷 却的异戊烷和液氮中冷冻，用于组织学研究。
[0189] 组织学评估：
[0190]制备8μπι横切片，固定并用H&E (苏木精&伊红)染色。使用Fi j i软件从H&E切片分析 纤维大小。使用Fiji图像分析软件的细胞计数插件对具有中央化核或内部化核的TA肌肉纤 维的百分比进行计数。使用Fiji软件测量纤维面积。对于各样品，对超过800个纤维进行计 数和测量。
[0191] 细胞转染：
[0192] 利用购自Thermo Fisher Scientific的lipofectamine2000,用编码shDnm2的质 粒和编码肌肉特异性亚型hDW2 (人DW2)的质粒对HEK (人胚肾)细胞进行共转染。利用购自 Lonza的Amaxa kit V Cell Line Nucleofector?，使用编码shDnm2的质粒对C2C12小鼠成 肌细胞进行电穿孔。
[0193] 表2:用于针对DNM2基因的shRNA的序列和潜在的脱靶对象。
[0194] 发动蛋白2mRNA的外显子12b具有如下序列：
[0195] SEQ ID No 30:5'ctgttactat actgagcagc tggtgacctg 3'，
[0196] 或对应于编码的蛋白序列SEQ ID No 31: (Cys Tyr Tyr Thr Glu Gin Leu Val Thr Cys)〇
[0197] 靶·Μ2序列与鼠 Dnm2和人DW2为100%同源。没有同源性大于80%的脱靶基因，排 除了有效下调脱靶对象的情况。
[0198] 表2
[0200]结果（图 24-图 30)
[0201] -shRNA特异性地靶向·Μ2序列（图24)以及可在转染的HEK细胞（图25)、转染的 C2C12鼠成肌细胞（图26)、注射有表达靶向·Μ2的shRNA的AAV的野生型小鼠的胫骨前肌（图 27;AAGGACATGATCCTGCAGTTCAT:SEQ C或SEQ ID No 2)中有效地降低发动蛋白2水平的实 例。
[0202] -向胫骨前肌（T A )和腓肠肌中注射表达靶向D N Μ 2的s h R N A (AAGGACATGATCCTGCAGTTCAT-SEQ C或SEQ ID No 2)的AAV 5周后的K0小鼠模型 (用于XLCNM)中表型改善的实例:相对于注射对照干扰shRNA的情况，靶向DW2的shRNA改善 了经注射的肌肉的重量（图28)、一般的组织学（图29)，在定性和定量评估方面增加了纤维 大小（图29和图30)以及使得核定位恰当（图30)。
【主权项】
1. 一种用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂，其中，所述发动蛋白2抑制剂选自 于由如下抑制剂所组成的组： 针对发动蛋白2的抗体;特异性干扰发动蛋白2表达的核酸分子；以及抑制发动蛋白2的 活性、表达或功能的小分子。2. 根据权利要求1所述的用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂，其中，所述小分 子选自于由如下小分子所组成的组： 3-羟基萘-2-甲酸(3，4-二羟基苯亚甲基)酰肼;3-羟基-N '-[(2，4，5-三羟基苯基)亚甲 基]萘-2-甲酰肼;十四烷基三甲基溴化铵;4-氯-2- ((2- (3-硝基苯基)-1，3-二氧代-2，3-二 氢-1H-异吲哚-5-羰基)-氨基)-苯甲酸；2-氰基-N-辛基-3-[l-(3-二甲基氨丙基)-1Η-Β引 哚-3-基]丙烯酰胺；3-(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)-2-硫烷基喹唑啉-4(3H)-酮;N，N'-(丙 烷-1，3-二基)双(7，8-二羟基-2-亚氨基-2H-苯并吡喃-3-甲酰胺）;N，N ' -(乙烷-1，2-二基） 双(7,8-二羟基-2-亚氨基-2H-苯并吡喃-3-甲酰胺）；十八烷基三甲基溴化铵;具有氨基酸 序列QVPSRPNRAP的发动蛋白抑制肽;3-羟基4'-[(2,4,5-三羟基苯基)亚甲基]萘-2-甲酰 肼;和4-(N，N-二甲基-N-十八烷基-N-乙基)-4-氮杂-10-氧杂三环-[5.2.1 ]癸烷-3，5-二酮 溴化物。3. 根据权利要求1或2所述的用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂，其中，所述中 央核性肌病选自于由如下疾病所组成的组： X连锁CNM、常染色体隐性CNM和常染色体显性CNM。4. 根据权利要求1或2所述的用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂，其中，所述中 央核性肌病是X连锁CNM或常染色体隐性CNM。5. 根据权利要求1或2所述的用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂，其中，所述中 央核性肌病是由BIN1突变造成的中央核性肌病。6. 根据权利要求1、3、4和5中任一项所述的用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制 剂，其中，所述发动蛋白2抑制剂选自于由如下抑制剂所组成的组： 针对发动蛋白2的抗体;或特异性干扰发动蛋白2表达的核酸分子。7. 根据权利要求1、3、4、5和6中任一项所述的用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制 剂，其中，所述发动蛋白2抑制剂是特异性干扰发动蛋白2表达的核酶、RNAi或反义核酸，优 选地，所述发动蛋白2抑制剂是siRNA或shRNA。8. 根据权利要求1和3-7中任一项所述的用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂， 其中，所述发动蛋白2抑制剂为诱导发动蛋白2pr e-mRNA内的外显子跳跃的反义核苷酸。9. 根据权利要求8所述的用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂，其中，所述发动 蛋白2抑制剂是设计为特异性诱导DW2外显子2或外显子8跳跃的反义核苷酸;优选地，所述 反义核苷酸包含如下序列中的一条，或由如下序列中的一条组成： 靶向·Μ2外显子2跳跃的U7-Ex2,包含如下序列： SEQ ID No 26：GTCACCCGGAGGCCTCTCATTCTGCAGCTC； 靶向·Μ2外显子8跳跃的U7-Ex8,包含如下序列： SEQ ID No 27:ACACACTAGAGTTGTCTGGTGGAGCCCGCATCA。10. 根据权利要求1和3-7中任一项所述的用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂， 其中，所述发动蛋白2抑制剂是特异性干扰发动蛋白2的核酸分子，所述核酸分子包含选自 于由SEQ ID No 2-SEQ ID No 25所组成的组中的序列，或者所述核酸分子由选自于由SEQ ID No 2-SEQ ID No 25所组成的组中的序列组成。11. 根据权利要求1和3-6中任一项所述的用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂， 其中，所述发动蛋白2抑制剂是经工程化以靶向D匪2基因以及递送使用基因组编辑疗法的 核酸酶的DNA、mRNA或核酸酶。12. 根据权利要求1-11中任一项所述的用于治疗中央核性肌病的发动蛋白2抑制剂，其 中，以足以将所述发动蛋白2的表达或所述发动蛋白2的活性、表达或功能降低至正常水平 的同等水平或优选地低于正常水平的量给予所述抑制剂。13. -种对有益于治疗中央核性肌病的分子进行筛选或识别的方法，所述中央核性肌 病优选为XLCNM，所述方法包括以下步骤： a. 提供或获得候选化合物；以及 b. 确定所述候选化合物是否抑制发动蛋白2的活性、功能和/或表达； c. 如果所述候选化合物抑制发动蛋白2的活性、表达、功能，选择所述候选化合物。14. 根据权利要求13所述的方法，其中，所述方法进一步包括如下步骤:在体外将所选 择的分子给予中央核性肌病非人动物模型或其部分，并分析对肌病发病或进展的作用。15. -种用于治疗中央核性肌病的药物组合物，所述药物组合物包含发动蛋白2抑制剂 和药学上可接受的载体/赋形剂。16. 根据权利要求15所述的药物组合物，其中，所述发动蛋白2抑制剂为如权利要求1-11中任一项所定义的发动蛋白2抑制剂。
【文档编号】C12N15/113GK105940108SQ201480069303
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2014年10月20日
【发明人】乔斯林·拉波特, 贝林达·考林, 伊莎姆·塔斯法欧特
【申请人】斯特拉斯堡大学, 法国国家科学研究中心, 国家健康医学研究所