用于在受试者的视网膜色素上皮中表达目的多核苷酸的方法和药物组合物的制作方法【专利摘要】本发明涉及用于在受试者的视网膜色素上皮中表达目的多核苷酸的方法和药物组合物。具体地说，本发明涉及用于在有此需要的受试者的眼中的视网膜色素上皮中选择性表达目的多核苷酸的方法，其包括用一定量的含有所述目的多核苷酸的rAAV2/5载体转导所述视网膜色素上皮的步骤。【专利说明】用于在受试者的视网膜色素上皮中表达目的多核苷酸的方法和药物组合物
技术领域：
[0001]本发明涉及用于在受试者的视网膜色素上皮中表达目的多核苷酸的方法和药物组合物。【
背景技术：
】[0002]遗传性视网膜营养不良（inheritedretinaldystrophy，IRD)是一大群遗传和临床异质性疾病。它们以进行性视力丧失为特征，但是达到法定盲的年龄是可变的。虽然个体稀少，但是在总体上IRD影响全世界大约1/2000的个体(Berger等，2010)。IRD的最普遍形式是以视网膜感光细胞的变性和眼底上存在可见的色素沉积为特征的色素性视网膜病变群。一个良好的示例是无脉络膜症(CMHhCHM是占IRD2%的X连锁色素性视网膜病变(Bocquet等，2013)。其特征为儿童期的夜盲症，接着是导致到40至50岁年龄失明的进行性视野损失。CHM具有特征性表型，包括紧接视网膜之后的脉络膜的色素沉积和脉络膜毛细血管层的萎缩。存在单致病基因CHM，它编码REP1，即Rab陪伴蛋白（escortprotein)1(Seabra等，1992)，一种普遍存在的伴侣蛋白（chaperonprotein)，其允许RabGTP酶的正确异戊二稀化和随后递送到它们的膜靶中。[0003]视网膜通常高度适于基因疗法，因为i)它通过非侵入性途径可及；ii)它小而封闭，从而允许使用低的载体剂量，以及iii)由视网膜色素上皮(RPE)和视网膜循环的无孔毛细血管的紧密连接构成的血视网膜屏障的存在防止渗漏到所述循环中并且使其被免疫豁免（：[1]11]11111〇11'；^;[]^6(1)(&316113等，2009)。这些积极属性引发2008年对视网膜基因疗法的首次临床试验（Bainbridge等，2008;Maguire等，2008)，之后很快进行了其它试验(Bennett等，2012;Hauswirth等，2008;Jacobson等，2012;Maguire等，2009)。目标IRD，BP利伯氏先天性黑内障(Lebercongenitalamaurosis，LCA)由于编码视觉周期的关键酶的RPE特异性基因RPE65的突变而引起(Marlhens等，1997)。使用重组腺相关病毒血清型2载体(AAV2/2)将RPE65成功运载到了RPE中。积极的结果提供了以下概念验证（proof-in-principle):基因转移可以改善视觉受损受试者的视力，并且促使研究人员鉴定最有效的载体，尤其是用于在PRE中表达目的多核苷酸的载体。【
发明内容】[0004]本发明涉及用于在受试者的视网膜色素上皮中表达目的多核苷酸的方法和药物组合物。具体地说，本发明由权利要求限定。【具体实施方式】[0005]本发明人将来自cmr/y患者的REP1缺陷型成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPSc)，使它们分化成视网膜色素上皮(RPE)。他们证明，这种iPSc衍生的RPE是具有典型形态的极化单层，表达特征标志物，具有流体运输和吞噬作用的功能，并且模拟患者的生物化学表型。然后，本发明人测定了一组AAV载体血清型，并且首次证明AAV2/5对于人RPE细胞最有效(>60%转导），并且CHM基因转移可以使生物化学表型正常化。无可比拟的体外高转导效率可能受助于吞噬作用，并且模拟了AAV载体在体内视网膜下间隙中所遇到的情形。本发明人由此证明了AAV2/5在人对照和CHMRPE中的优越性。[0006]因此，本发明的第一个方面涉及用于在有此需要的受试者的眼中的视网膜色素上皮中选择性表达目的多核苷酸的方法，其包括用一定量的含有目的多核苷酸的rAAV2/5载体转导视网膜色素上皮的步骤。[0007]本文使用的术语"受试者"或"有此需要的受试者"是指人。通常，受试者患有或可能患有影响视网膜色素上皮的视网膜疾病。因此，众多种视网膜疾病可以由此通过考虑本文提供的教导而得以治疗，并且通常包括遗传性或非遗传性视网膜变性、视网膜营养不良、色素性视网膜炎、黄斑变性、利伯氏先天性黑内障（LCA)、视锥-视杆营养不良（cone-roddystrophies)、眼的新生血管疾病、脉络膜变性、脉络膜硬化、糖尿病视网膜病变、增生性玻璃体视网膜病变、无脉络膜症、青光眼和代谢障碍如斯莱综合征(Slysyndrome)(MPSVII，归因于葡萄糖醛酸苷酶基因中的缺陷）和环状萎缩(gyrateatrophy)(归因于鸟氨酸-δ-转氨酶基因中的缺陷，OAT)、视网膜脱离或损伤和视网膜病变(无论是遗传性的，由手术、创伤、毒性化合物或毒性试剂诱导的，还是光诱导的）。[0008]因此，本发明的另一个目的是提供用于治疗有此需要的受试者中的视网膜疾病的方法，其通过向所述受试者的眼中递送包含目的多核苷酸的载体而实现，当所述多核苷酸在RPE细胞中表达时，对所述视网膜疾病具有有益效果。[0009]因此，本发明的另一个目的是提供用于治疗有此需要的受试者中的视网膜疾病的方法，其通过向所述受试者的眼中递送包含目的多核苷酸的载体而实现，当所述多核苷酸在RPE细胞中表达时，对所述视网膜疾病具有有益效果。[0010]本文使用的表达"目的多核苷酸"在本文中是指编码任何多肽、结构蛋白、酶等的任何核苷酸序列，出任何种类的原因，所述核苷酸序列的表达是靶细胞中所需要的。它还可以是指非编码序列，例如旨在降低基因表达的反义序列或者干扰RNA序列。本领域技术人员通过其领域中的科学文献中的知识知道，哪些可能更适合于治疗特定视网膜疾病的多核苷酸。[0011]利用本发明的rAAV2/5载体对眼的基因疗法可以通过在RPE细胞中引入其中缺乏的目的多核苷酸(例如，基因）的功能性拷贝（基因替代疗法），或者通过向RPE细胞中递送将对待治疗的眼病具有有益效果的目的多核苷酸(对症疗法)来进行。[0012]具体地说，多核苷酸产物是将提高视网膜色素上皮细胞的功能的多肽。可用于基因替代疗法的目的多核苷酸的示例是特异性地或优先地在RPE细胞中表达的基因，如RGR(色素性视网膜炎，RP，染色体(chr.)10)、RDH5(白点状眼底病，chr.l2)、RPE65(利伯氏先天性黑内障，LCA，chr.l)、RLBPl(RP，chr.l5)、MERTK(RP，chr.2)、LRAT(RP，chr.4)、REPl(无脉络膜症，Xp21)、RBP4(RPE变性，chr.10)，或者还在其它细胞类型中表达的基因，如MY07A(乌谢尔综合征(Ushersyndrome)1型，chr·11)、EL0VL4(黄斑变性，chr.6)、EFEMP1(莫拉蒂致拉分提那斯病（MalattiaLeventinesedisease)，chr.15)、BEST1(贝斯特病（BestDisease)，chr.11)、TIMP3(索斯比眼底营养不良（Sorsby'sfundusdystrophy)，chr·22)、AIPL1(LCA，chr·7)和CRB1(RP，chr·1)。[0013]在一些实施方案中，多核苷酸是编码REP1，即Rab陪伴蛋白-1的多核苷酸（即，CHM基因）。[0014]在一个特定实施方案中，目的多核苷酸可以编码神经营养因子。本文使用的"神经营养因子"是具有诸如使神经细胞存活和维持、促进神经元分化的生理作用的蛋白质的通用术语。神经营养因子的示例包括但不限于bFGF、aFGF、BDNF、CNTF、IL-10、NT-3、IGF-II、⑶NF、NGF和RdCVF。[0015]在某些情况下，目的多核苷酸产物是提供基因功能的位点特异性敲低（knockdown)的位点特异性内切酶，例如，其中内切酶敲除与视网膜疾病有关的等位基因。例如，当显性等位基因编码在为野生型时是结构蛋白和/或提供正常视网膜功能的基因的缺陷拷贝时，位点特异性内切酶(如TAL核酸酶、大范围核酸酶或锌指核酸酶)可以靶向缺陷等位基因并且敲除缺陷等位基因。除了敲除缺陷等位基因以外，位点特异性核酸酶还可用于刺激与供体DNA的同源重组，所述供体DNA编码缺陷等位基因所编码的蛋白质的功能性拷贝。因此，例如，本发明方法可用于递送敲除缺陷等位基因的位点特异性内切酶，并且可用于递送缺陷基因的功能性拷贝，使缺陷等位基因修复，从而提供功能性视网膜蛋白的产生。在一些实施方案中，载体包含编码位点特异性内切酶的多核苷酸；以及编码缺陷等位基因的功能性拷贝的多核苷酸，其中所述功能性拷贝编码功能性视网膜蛋白。适合使用的位点特异性内切酶包括例如锌指核酸酶（ZFN)和转录激活子样效应子核酸酶（transcriptiοηactivator-likeeffectornuclease，TALEN)，其中此类位点特异性内切酶是非天然存在的并且被修饰以靶向特定基因。可以改造此类位点特异性内切酶以切割基因组内的特定位置，然后非同源端连接可以插入或缺失几个核苷酸的同时修复破裂。此类位点特异性内切酶(也称为"INDEL"）然后将所述蛋白质扔出框架(outofframe)并且有效敲除所述基因。参见例如美国专利公开号2011/0301073。[0016]在一些实施方案中，多核苷酸产物是干扰RNA(RNAi)。[0017]本文使用的术语"AAV"具有其在本领域中的一般含义，且是腺相关病毒的缩写，并且可用于指病毒本身或其衍生物。该术语涵盖天然存在的和改造形式的所有血清型和变体。根据本发明，术语"AAV"是指AAV1型(AAV-1)、AAV2型(AAV-2)、AAV3型(AAV-3)、AAV4型(AAV-4)、AAV5型(AAV-5)、AAV6型(AAV6)、AAV7型(AAV-7)、AAV8型(AAV-8)和AAV9型(AAV-9)。各种AAV血清型的基因组序列以及天然末端重复(TR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域中已知的。此类序列可以在文献和公众数据库如GenBank中找到。参见例如GenBank登录号NC_001401(AAV-2)、AF043303(AAV-2)和NC_006152(AAV-5)。[0018]本文使用的"rAAV载体"是指包含用于RPE细胞的遗传转化的目的多核苷酸（即，异源多核苷酸）的AAV载体。rAAV载体含有5'和3'腺相关病毒反向末端重复（ITR)和目的多核苷酸，所述目的多核苷酸与调节其在靶细胞中的表达的序列可操作地连接。[0019]术语"AAV杂交载体"在本文中是指包含天然AAV衣壳的载体颗粒，其包含rAAV载体基因组和AAVRep蛋白，其中Cap、Rep和载体基因组的ITR来自至少2种不同的AAV血清型。本发明的杂交载体是rAAV2/5载体，其包含AAV-5衣壳和具有AAV-21TR的rAAV基因组。例如，可以通过用来自AAV-5的cap基因的序列替代AAV-2的cap基因而由AAV-2的cap基因得到cap基因，以这种方式使得所表达的蛋白质能够形成AAV-5衣壳。[0020]本发明的rAAV2/5载体是使用本领域中已知的方法产生的。总之，所述方法一般涉及：（a)将rAAV载体引入到宿主细胞中，（b)将AAV辅助构建体引入到所述宿主细胞中，其中所述辅助构建体包含rAAV载体中缺失的病毒功能，以及(c)将辅助病毒引入到所述宿主细胞中。用于rAAV病毒粒子复制和包装的所有功能都需要存在，以实现rAAV载体的复制和向rAAV病毒粒子的包装。可以使用标准病毒学技术同时或依序实施向宿主细胞中的引入。首先，培养宿主细胞以产生rAAV病毒粒子，并且使用标准技术如CsCl梯度加以纯化。可以使用已知方法如例如热灭活使残余辅助病毒活性灭活，然后将纯化的rAAV病毒粒子准备用于所述方法。[0021]载体还可以包含允许表达和分泌编码的蛋白质的调控序列，如例如启动子、增强子、多腺苷酸信号、内部核糖体进入位点（IRES)、编码蛋白质转导结构域(PTD)的序列等。就此而言，载体包含与目的多核苷酸可操作地连接以引起或改善所述蛋白质在受感染细胞中的表达的启动子区。此类启动子可以是普遍存在的、组织特异性的、强的、弱的、受调节的、嵌合的、诱导型的等，以允许在受感染组织中有效和合适地产生所述蛋白质。启动子可以与所编码的蛋白质是同源的，或者异源的，包括细胞启动子、病毒启动子、真菌启动子、植物启动子或合成启动子。用于本发明中的优选启动子应当在RPE细胞中是功能性的。此类受调节启动子的示例包括但不限于含Tet开/关元件的启动子、雷帕霉素(rapamycin)诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。普遍存在的启动子的示例包括病毒启动子，特别是CMV启动子、CAG启动子(具有CMV增强子的鸡β肌动蛋白启动子）、RSV启动子、SV40启动子等，以及细胞启动子，如PGK(磷酸甘油酸激酶)启动子。启动子还可以是神经特异性启动子，如突触蛋白或NSE(NeuronSpecificEnolase，神经元特异性稀醇化酶）启动子(或位于普遍存在的PGK启动子上游的NRSE(Neuronrestrictivesilencerelement，神经元限制性沉默元件）序列），或者对RPE细胞类型具有特异性的启动子，如RPE65启动子、BEST1启动子、视紫红质启动子或视锥抑制蛋白启动子。载体还可以包含miRNA的靶序列，以实现不期望细胞中转基因表达的抑制。在特定实施方案中，载体包含前导序列，以允许分泌编码的蛋白质。目的多核苷酸与编码分泌信号肽(通常位于分泌的多肽的N末端）的序列的融合将允许产生可以从转导细胞中分泌的形式的治疗性蛋白质。此类信号肽的示例包括白蛋白、β-葡糖醛酸糖苷酶、碱性蛋白酶或纤连蛋白分泌信号肽。在最优选的实施方案中，启动子在视网膜细胞中，特别是在视网膜的光感受器或神经节细胞中或在RPE中是特异性或功能性的，即，允许转基因在所述细胞中（优先)表达。例如，合适的光感受器特异性调控元件包括例如视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子(Young等(2003)Ophthalmol.Vis.Sci.44:4076);β磷酸二酯酶基因启动子(Nicoud等（2007)J.GeneMecL9:1015);色素性视网膜炎基因启动子(Nicoud等(2007)，同上）；光感受器间类维生素A结合蛋白（interphotoreceptorretinoid-bindingprotein，IRBP)基因增强子(Nicoud等（2007)，同上）；IRBP基因启动子(Yokoyama等（1992)ExpEyeRes·55:225)〇[0022]载体的剂量可以根据疾病状况、受试者（例如，根据其体重、代谢等）、治疗方案等来调节。本发明上下文内的优选有效剂量是允许最佳转导RPE细胞的剂量。通常，向小鼠中每剂量施用1〇8至1〇1()病毒基因组（vg)。通常，向人施用的AAV载体的剂量可以在101()至l〇12vg范围。[0023]向受试者施用本发明载体可以通过直接视网膜、视网膜下或玻璃体内注射来进行。根据该方法，载体颗粒的施用优选地通过视网膜下递送进行。[0024]在一些方面，本发明涉及含有编码REP1的多核苷酸的rAAV2/5载体。在一些实施方案中，所述多核苷酸在CAG启动子的控制下。所述载体特别适合于治疗有此需要的受试者中的无脉络膜症。[0025]REP1的示例性氨基酸序列是SEQIDN0:6，并且REP1的示例性核酸序列是SEQIDN0:7〇[0026]SEQIDN0:6:NCBI参考序列：ΝΡ_001138886·1[0028]SEQIDN0:7:NCBI参考序列：ΝΜ_000390·2[0033]本发明的载体可以被配制成药物组合物。除了载体外，这些组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、运载体(carrier)、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它材料。此类材料应当是无毒的并且不应干扰活性成分(即，本发明载体)的效力。运载体或其它材料的精确性质可以由本领域技术人员根据施用途径（即这里为直接视网膜、视网膜下或玻璃体内注射)来确定。药物组合物通常是液体形式。液体药物组合物通常包含液体运载体，如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可以包含生理盐水溶液、氯化镁、右旋糖或其它糖溶液，或者二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。对于注射，活性成分可以是水溶液的形式，其为无热源的并且具有合适的PH、等张性和稳定性。本领域相关技术人员完全能够使用例如等张媒介物如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer'sInjection)、乳酸林格氏注射液(LactatedRinger'sInjection)制备合适的溶液。根据需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。对于延时释放，载体可以包含在根据本领域已知的方法被配制成缓释的药物组合物中，例如在由生物相容性聚合物形成的微胶囊中或者脂质体运载体系统中。[0034]将通过以下附图和实施例进一步说明本发明。然而，这些实施例和附图无论如何不应被解释为限制本发明的范围。【附图说明】[0035]图1:AAV载体在iPSc衍生的RPE中的转导效率。a)在CMV启动子的控制下表达EGFP的AAV载体组(2/2、2/4、2/5、2/8、2/9)的转导效率的比较。还将该转导效率与在CAV启动子的控制下表达EGFP的AAV2/5载体进行比较。利用25OOOvg/细胞进行转导，并且通过FACS分析EGFP阳性细胞的数目。b)使用更高病毒颗粒数（100OOOvg/细胞）的在CAV启动子的控制下表达EGFP的AAV载体2/2、2/5、2/8、2/9实现的转导效率的比较。通过FACS分析EGFP阳性细胞的数目。c)来自相同AAV载体组的EGFP表达的时程。d)AA2/5-CAG-EGFP以相等效率转导野生型和CHM1RPE。[0036]图2:载体AAV2/5-CAG-CHM在CHM1成纤维细胞中的REP1表达。a)野生型成纤维细胞中REP1表达的IF研究。b)CHMl成纤维细胞中不存在REP1表达。c)用100OOOvg/细胞转导CHM1成纤维细胞后48小时，来自AAV2/5-CAG-CHM的REP1表达。d)用100OOOvg/细胞的AAV2/5-CAG-CHM转导后48小时对成纤维细胞的蛋白质印迹(Westernblot)分析显示，REP1以野生型(WT)的大约17%的水平被表达。e)用100OOOvg/细胞的AAV2/5-CAG-CHM转导后4周对RPE的蛋白质印迹分析显示，REP1以野生型的大约53%的水平被表达。注意到在d)和e)中在未转导(NT)的CHM1细胞中不存在REP1表达。[0037]图3:用AAV2/5-CAG-CHM转导后CHMRPE中正常细胞表型的恢复。A)野生型、未转导的CHM1RPE和用AAV2/5-CAG-CHM转导的CHM1RPE中的体外异戊二烯化，接着是并入的生物素化异戊二烯基供体的蛋白质印迹分析。B)野生型、未转导的CHM1RPE和用AAV2/5-CAG-CHM或AAV2/5-CAG-EGFP转导的CHM1RPE中细胞溶质级分和膜级分的差速离心和蛋白质印迹分析。C)归一化至β肌动蛋白负载水平后的定量表明，在用AAV2/5-CAG-CHM转导CHM1RPE后细胞溶质Rab库降低至野生型水平。D)定量分析表明，在用AAV2/5-CAG-CHM转导CHM1RTO之后Rab27A的亚细胞分布谱恢复到野生型水平。相比之下，在用AAV2/5-CAG-EGFP转导后水平无变化。[0038]图4:小鼠视网膜中的体内基因转移。a)施用4.68X109vg的AAV5-CAG-CHM或AAV5-CAG-EGFP后两周，可以通过q-PCR研究来检测转基因表达。b)蛋白质印迹分析确认了分别施用AAV5-CAG-CHM或AAV5-CAG-EGFP后REP1和EGFP的特异性表达。c)眼底镜检查研究显示，施用AAV5-CAG-CHM后超出注射部位的健康视网膜，以及在AAV5-CAG-EGFP注射后在注射部位更强的广泛的转基因表达。d)沿着视神经一侧的整个视网膜检测EGFP表达，所述视神经覆盖注射部位(比例尺）；插图，显示RPE和光感受器中的EGFP表达的放大图。[0039]实施例[0040]材料和方法[0041]皮肤成纤维细胞的分离和扩增[0042]在CentreofReferenceforGeneticSensoryDisorders(遗传性感觉障碍参考中心）（CHRUMontpellier)，在无菌条件下于16岁男孩(称为CHM1)的上臂内侧进行皮肤活检，所述男孩具有经确认的无脉络膜症的分子诊断(通过RT-PCR鉴定CHM的外显子8的缺失，KlinkumderUniversiliil^Regensburg，Germany)。将皮肤活检物在PBS中冲洗，切成小块，并且在5%C02下于37°C培养在35mm培养皿（每个皿2块）中具有L-谷氨酰胺(Invitrogen,LifeTechnologies,SaintAubin,France)的AmnioMAXC100基础培养基中，所述培养基含有10%的去补体FCS(Lonza，Verviers，Belgium)、1%青霉素-链霉素-两性霉素B(Lonza)和2%AmnioMax-C100补充剂（Invitrogen，LifeTechnologies)。一旦出现的成纤维细胞达到80%汇合，即将活检物移到新培养皿中。活检物总共转移4次，并且将来自每个单独培养物的P1至P5范围的细胞在含有10%DMS0(SigmaAldrich,SaintQuentinFallavier，France)的FCS中冷冻。[0043]突变表征[0044]使用DNeasyBlood&TissueKit(Qiagen，LesUlis,France)根据制造商说明书从原代成纤维细胞中分离基因组DNA。为了限定CHM患者携带的CHM中外显子8缺失的边界，使用标准条件针对对照和患者DNA的PCR扩增来测试分布在基因组DNA的5'至外显子8的1.6kb上的3个引物对，以及分布在3'至外显子8的38kb上的8个引物对。一旦建立了减小的间隔，即使用位于外显子8上游78bp的内含子7F引物（5'-TTC-ATCTCC-TTT-TTG-TGG-GG-3'）（SEQIDNO:1)和位于外显子8下游362bp的内含子8R引物（5'-(^6-6厶厶-厶〇厶-1'(：(：-丁61'-61'1'-〇八1'-C-3'）（SEQIDN0:2)来扩增666bp的基因组片段，所述基因组片段使用ExoSAP-ITPCRClean-upKit(GEHealthcare，VelizyVillacoublay,France)纯化，之后使用BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionkitV3.1在AppliedBiosystems3130xLGeneticAnalyser(AppliedBiosystems，FosterCity,CA，USA)上测序。[0045]突变检测[0046]将3个引物用于外显子7、8和9的PCR扩增，以测试来自不同细胞类型的基因组DNA中CHM缺失的存在。外显子7的引物对扩增493bp片段，外显子8扩增177bp片段，并且外显子9扩增975bp片段。使用QiaShredder和RNeasy小型试剂盒(Qiagen)根据制造商说明书从自不同的细胞类型中分离RNA。将分离的RNA用不含RNA酶的DNA酶(RNase-FreeDNase)(Qiagen)处理，并且使用SuperscriptIII逆转录酶试剂盒(LifeTechnologies)进行逆转录。通过外显子7至11的PCR扩增进行CHM缺失的存在或不存在研究，所述外显子代表了来自对照cDNA的559bp片段和来自患者cDNA的333bp片段。[0047]蛋白质印迹分析[0048]将细胞刮到含有完全蛋白酶抑制剂混合物片（Completeproteaseinhibitorcocktailtablets)(Roche，Meylan，France)的冷PBS中并且在4°C以200g离心5分钟。使沉淀物重悬在含Benzonase(SigmaAldrich)的2XLaemmli样品缓冲液（Biorad，MarneLaCoquette，France)中。使用PierceBCA蛋白质测定试剂盒（ThermoFisherScientific，Graffenstaden，France)测量裂解物的蛋白质浓度并且加载到AnyKD预饶注MiniProteanTGXStainFree凝胶（Biorad)上。分离的蛋白质使用Tr姐S-B.l〇.t?TurboTMMiniPVDFTransferPackandSystem(Biorad)进行电转移。在5%脱脂乳中的0.5%Tween_PBS(封闭溶液）中封闭1小时后，将膜与单克隆小鼠抗REP1抗体(克隆2Fl;Millip〇re，SaintQuentinenYvelines，France)于封闭溶液中的1/1000稀释物于室温孵育1小时。在0·5%Tween_PBS中洗涤3次后，将过滤器与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的绵羊抗小鼠完整免疫球蛋白抗体(LifeTechnologies)的1/10000稀释物孵育。使用AmershamECL主要蛋白质印迹检测试剂(GEHealthcare)进行检测步骤。[0049]慢病毒载体产生[0050]含有多西环素（doxycycline)诱导型转录因子c-MYC(FUW_tet〇-hMYC;质粒ID20723)、S0X2(FUW-tet0-S0X2;20724)、KLF4(FUW-tet〇-KLF4;20725)、0CT4(FUW-tet0-0CT4;20726)、反向多西环素反式激活子M2rtTA(FUW-M2rtTA;20342)和GFP(FUGW;14883)的基于慢病毒的质粒购自Addgene(Cambridge，MA,USA)。通过慢病毒产生平台(Montpellier，France)产生慢病毒载体。FUGW的感染滴度计算为1010TU/ml。其余病毒的感染滴度通过实现其？24浓度与？1^1的比例来估计4冊吋6切-11]^〇2\1091'1]/1111;?冊46切-5(^2-7\109TU/ml;FUW-tet〇-KLF4-8X109TU/ml;FUW-tet〇-〇CT4-3X109TU/ml以及FUW-M2rtTA-9.8X109TU/ml〇[0051]饲养细胞[0052]新生人包皮成纤维细胞购自ATCC(hFF-l;LTCstandards,France)。将细胞培养在补充有10%FCS的含Glutamax的DMEM(Gibco，Lifetechnologies)中并且使用CegelecBloodXrad福照器（EtablissementFl.anijaisduSang,Montpellier，France)以35戈瑞的剂量辐照。将饲养细胞以2.5X105个细胞/35mm板的密度接种。[0053]重编程和iPSc培养[0054]在开始重编程之前，使用编码GFP的FUGW载体计算用于转导实验的适当的Μ0Ι。然后在第0天，将CHM患者成纤维细胞以6孔板的每个孔105个细胞的密度接种到6孔板中在补充有10%FCS和1%青霉素-链霉素-两性霉素B的含Glutamax的DMEM中。在第1天，在8μg/ml聚凝胺的存在下用5种病毒（对照载体FUGW未用于重编程实验）以每种载体10M0I(总计50M0I)转导细胞。在第2天，将细胞用PBS冲洗并且加入新鲜培养基。在第5天，更新培养基并且补充2μ8/πι1多西环素。在第6天，将经转导细胞用0,25%胰蛋白酶(Gibco)离解，并且将来自1个孔的细胞分到含有饲养细胞层的4个孔中（1/4稀释）。将细胞培养在含有2μg/ml多西环素(SigmaAldrich)的ES培养基(K0DMEM(Gibco)中，所述培养基补充有20%K0血清替代物（Gibco)、200mML-谷氨酰胺（Gibco)、l%非必需氨基酸（Gibco)、0.1%B-巯基乙醇(Gibco)、l%青霉素-链霉素（Gibco)和10ng/mlb[Al]FGF(Peprotech，Neui1lySurSeine,France))，并且每天更换培养基。使用手术刀在Lynx立体显微镜（VisionEngineeringSA，LePlessisPat6,France)下将所得iPSc机械传代到含有ES培养基中的饲养细胞的35mm板上。[0055]畸胎瘤形成和分析[0056]将iPSc用10μΜR0CK(Rho相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶)抑制剂(Y-27632;SigmaAldrich)在37°C预处理1小时，然后利用lXTrypLESelect(Gibco)在37°C酶促离解10分钟。将离解的细胞以5000个细胞/cm2的密度接种到含有饲养细胞层的10cm板中，并且于传代后在含有ROCK抑制剂的ES培养基中培养24小时。在注射之前将细胞酶促传代5次。将离解的细胞以注射每200μ12X106个细胞的浓度重悬在含有30%BDMatrigel基底膜基质(BDBiosciences，LePontdeClaix，France)的ES培养基中。动物育种和实验根据欧洲和国家实验动物护理和使用指南(EuropeanandNationalguidelinesforthecareanduseoflaboratoryanimals)(CouncilDirective2010/63/EU)进行，并且经机构和地区伦理委员会（institutionalandregionalethicscommittees)批准（许可号CEAA-LR-12157)。将NOD.Cg-Prkdcscid112rgtmlWjl/SzJ小鼠（CharlesRiver，L'Arbresle，France)用35mg/kg氯胺酮（Merial，Lyon,France)和14mg/kg赛拉嗪（xylazine)(BayerHealthcare,Loos,France)麻醉，在左后胁和右后胁剃毛，并且使用连接到27号针的lml注射器皮下注射200μ1细胞混合物。作为对照，向小鼠注射不含细胞或者含有来自之前表征的野生型iPSc(M4C7;(Ramirez等，2013))的细胞的30%Matrigel/ES培养基。将小鼠单独圈养在通风笼中，并且当肿瘤达到lcm2的最大尺寸(注射后约2个月）时使其安乐死。将肿瘤切下，在PBS中冲洗并在3.7%甲醛中固定，并且在石蜡中包埋。将4μπι切片用苏木精-伊红染色并且分析三个胚层的存在。[0057]RPE产生[0058]为了使iPSc分化成RPE，我们使用之前描述的自发分化方案(Liao等，2010)并且进行了小的修改。简单地说，使iPSc集落生长至在饲养细胞上汇合，然后从ERS培养基中除去bFGF。在分化过程中持续每天更换培养基。在bFGF耗尽后的一月过程中出现色素灶(foci)，将其手动切下。将来自一个板的灶合并，用〇.25%胰蛋白酶离解，接种到用Matrigel(1:30稀释)涂覆的24孔或6孔培养皿中，并且培养在耗尽FGF的ES培养基中。一旦达到汇合单层，细胞即呈现色素多边形形态并且可以保持长期培养。将细胞通过胰蛋白酶离解传代并且根据需要扩增。对处于第三次传代(P3)的RPE进行所有分析。通过SteREODiscoveryV2.0显微镜(CarlZeissS.A.S，LePecq,France)观察充满流体的圆顶(dome)。[0059]电子显微术[0060]将EPE传代到具有高密度0.4μΜ孔的半透明BDFalcon细胞培养插件（BDBiosciences)上。当达到特征形态时，将过滤器从室上拆下，在3.3%戊二醛中固定，在2%四氧化锇中后固定并且在环氧树脂中包埋。将半薄（700nm)切片用甲苯胺蓝染色并且在光学显微术下观察。用乙酸铀酰和柠檬酸铅对70nm切片染色并且使用HitachiH7100透射电子显微镜（CentreRegionald'lmagerieCellulaire(CRIC),Montpellier,France)使之显现。[0061]免疫荧光显微术[0062]对于免疫荧光研究，将iPSc和RPE接种到96孔塑料皿中，而将成纤维细胞接种到盖玻片上。将所有细胞类型用3.7%甲醛固定并且在5%驴血清/1%BSA中封闭。将细胞用0.2%Tritonx-100或0.05%皂素透化。一级抗体在4°C于切片上孵育过夜，二级抗体在室温下与〇·2μg/ml双苯甲亚胺Hoechst(Sigma-Aldrich)和lng/ml鬼笔环肽-TRITC(Sigma_Aldrich)孵育45分钟，然后适当时在Dako荧光封固剂(DakoFranceS.A.S.，LesUlis,France)中固定。对于iPSc，使用的一级抗体为1:5稀释的大鼠IgM抗人SSEA3(DevelopmentalStudiesHybridomaBank,UniversityofIowa,IowaCity,IA,U.S.A.)和1:10的山羊抗人NAN0G(R&DSystemsEurope,Lilie,France)。对于RPE，使用的一级抗体为1:100稀释的兔抗人Z01(Invitrogen,Lifetechnologies)、1:250的兔抗人MERTK(AbCam,Cambridge,GreatBritain)、1/150稀释的小鼠抗人RPE65(AbCam)和1:1000的小鼠抗人CRALB(针对重组蛋白质;Agrobio,LaFert6StAubin,France)。对于成纤维细胞，使用的一级抗体是1/500稀释的小鼠抗人REPl(Millipore)。对于所有，二级抗体是1:800稀释的驴抗小鼠IgM-Alexa594或IgM-Alexa488或者1:1000稀释的驴抗小鼠、抗兔或抗山羊IgG-AlexaFluor594或IgG-Alexa488(Molecularprobes，Invitrogen)。对于吞·作用研究，将细胞与160个珠/细胞的量的直径Ιμπι的黄绿色（505/515nm)羧酸酯改性微球体(FluoSpheres;MolecularProbes，Lifetechnologies)孵育。使用Zeiss5活的双重高速/光谱共聚焦显微镜观察细胞并且使用相应采集软件(CarlZeissS.A.S.;M〇ntpellierRIO成像平台）进行图像采集。[0063]逆转录和定量PCR研究[0064]使用定量RT-PCR(qPCR)分析转导的成纤维细胞中外源转基因的表达以及iPSc中外源转基因的沉默和内源多能性基因的激活。在RNA分离和cDNA合成后，使用基因特异性引物（补充材料，表）和LigMCycler?48〇SYBRGreenIMaster混合物在LightCycler?48011热循环仪（Roche)上进行qPCR扩增。将基因表达归一化至GAPDH表达。使用LightCycler?480软件和MicrosoftExcel分析结果。使用经典RT-PCR扩增利用基因特异性引物分析RPE特异性标志物的表达，并且在2%琼脂糖凝胶上分析扩增产物。[0065]体外异戊二稀化测定[0066]将培养在24孔板的孔中的RPE在冷roS中洗涤，刮到含有抗蛋白酶的roS中，沉淀并且重悬在如之前所述(Wu等，2007)新鲜准备的冷的脱气异戊二烯化/裂解缓冲液中。将细胞在冰上孵育15分钟，然后在40赫兹下超声处理45秒，持续3次。然后在OptimaMAX-TL超速离心机(1^〇1〇]^11，￥;[116。;[1^61?0丨887，？瓜1106)上，在4°0下将细胞以150(^离心5分钟，收集上清液并且在4°C以450000g进一步离心30分钟。使用异戊二烯化/裂解缓冲液中的作为异戊二烯基供体的5μΜ经生物素标记的焦磷酸香叶酯(B-GPP)(Euromedex，Souffelweyersheim,France)、0·5μΜ重组REP1(Euromedex)、0·5μΜRab香叶基香叶基转移酶（RGGT;Euromedex)和20μΜGDP在37°C下持续1小时来对新鲜制备的裂解物进行体外异戊二烯化测定(Nguyen等，2010;Wu等，2007)。利用6XSDS淬灭异戊二烯化反应，在90°C煮沸5分钟，并且通过蛋白质印迹进行分析。将膜与1:5000HRP缀合的链霉亲和素（streptavidin)(JacksonImmunoResearch，Cambridge，GreatBritain)或1:50000的小鼠抗β-肌动蛋白（SigmaAldrich)孵育。使用ChemiDocMP成像系统（Biorad)进行检测，并且使用适当的软件包(ImageLab,Biorad)通过扫描密度测定法对生物素-香叶基并入程度进行定量，并且将其表示为β-肌动蛋白信号的函数。为了能够相对比较，将CHMRPE中的生物素并入量设定为100%0[0067]差速离心[0068]将来自24孔板的孔的沉淀RPE细胞在3体积的亚细胞级分裂解缓冲液（SFLB)中充分均质化，所述缓冲液含有50mMTris-HCl(pH7.5)、150mMNaCl、2mMMgCl2，、0.5mMEGTA、0.5mMEDTA、5mMDTT、0.1mMGDP和蛋白质抑制剂，如所述（Seabra等，1995)。将均质物在4°C以800Xg离心，丢弃沉淀物，并且将上清液在4°C以450000Xg超速离心1小时，以获得细胞溶质级分和膜级分。在超速离心后，将沉淀物重悬在调节至l%NonidetP-40(SigmaAldrich)的1体积SFLB中。通过蛋白质印迹分析来分析细胞溶质上清液和1%NonidetP-40溶解的膜级分的蛋白质含量。将膜与1:250小鼠抗Rab27A(AbCam)或1:50000小鼠抗β-肌动蛋白孵育。相对于β-肌动蛋白负载对照对Rab27A的细胞溶质水平和膜水平进行定量，并且将其表示为每个孔的总Rab27A含量的百分比。[0069]AAV载体产生[0070]病毒载体产生平台（ViralVectorProductionPlatform,Nantes,France)产生用于该工作的所有AAV载体。简单地说，通过瞬时转染293细胞来产生病毒载体，并且使用PEG使病毒颗粒从上清液中沉淀出来，或者在AAV2/4和AAV2/5载体的情况下，使用硫酸铵使病毒颗粒从细胞沉淀物中沉淀出来。通过CsCl双重离心将载体纯化，进行透析并且通过斑点印迹测定加以滴定。对于转导效率实验，在CMV启动子的控制下表达EGFP的AAV载体的滴度如下：AAV2/2-CMV-EGFP-3·5X1012载体基因组（vg)/ml;AAV2/4-CMV-EGFP(由Dr.F.Rolling，InsermUMR1089，Nantes的中间人提供）-3\101\8/1111;厶厶￥2/5-〇1^46卩？-3·3X1012vg/ml;AAV2/8-CMV-EGFP-9X1012vg/ml，以及AAV2/9-CMV-EGFP-2·55X1012vg/ml。对于概念验证试验，使用携带在CAG(具有CMV增强子的鸡β肌动蛋白启动子)启动子的控制下的CHM基因（由Pr.J.Bennett,UniversityofPennsylvania,PA,USA提供）或EGFP基因(由NantesViralVectorProductionPlatform提供）的AAV质粒产生以下载体：AAV2/5-CAG-CHM-4·4X1012vg/ml和AAV2/5-CAG-EGFP-2·34X1012vg/ml。[0071]体外AAV转导[0072]对于转导效率实验，将iPSc衍生的RPE接种到96孔板中，并且在汇合时估计每孔2Χ?ο5个细胞。用最小体积(50μ1)的耗尽bFGF的ES培养基中的25OOOvg(由具有最低滴度的血清型决定)将细胞转导6小时以促进载体-细胞相互作用。然后向孔中补充额外的培养基并且每3至4天更换培养基。在期望的时间点，将细胞用0.25%胰蛋白酶离解，在3.7%甲醛中固定并且在转导后48小时、1周、2周、4周或6周使用BDFACSCalibur流式细胞仪（BDBiosciences)分析表达EGFP的细胞的数目。实验以一式二份进行。对于转基因表达实验，将2X104个成纤维细胞接种到含有盖玻片的24孔板中。接种后24小时，利用100OOOvgAAV2/5-CAG-CHM将细胞转导48小时。平行地，用AAV2/5-CHM-EGFP以等同Μ0Ι转导不具有盖玻片的孔用于流式细胞术分析。对于概念验证实验，将iPSc衍生的RPE接种到24孔板中，并且在汇合时估计1.2X106个细胞。以100000Μ0Ι转导细胞，并且在转导后4周时进行异戊二烯化测定。实验以一式三份进行。[0073]视网膜下注射[0074]用70mg/kg氯胺酮和28mg/kg赛拉嗪将8周龄C57BL/6J雄性小鼠（HarlanFranceSARL，Gannat，France)麻醉，并且在各眼中用一滴0.5%托吡卡胺（tropicamide)(Mydriaticum，Th6a，France)使隱孑乙扩大。用1滴Lacryvisc(Alcon，Ruei1-Malmaison，France)和盖玻片覆盖角膜。在手术显微镜下，首先在角膜-虹膜结合部刺穿眼。随后，使用5μLHamilton注射器和34G斜面针进行视网膜下注射。向眼中注射2μ1PBS或2μ1含4.68X109vgAAV2/5-CAG-CHM或AAV2/5-CAG-EGFP。在注射后2周、4周、6周和8周以规则间隔通过眼底镜检查对眼进行观测）。在每个时间点，将小鼠麻醉，使瞳孔放大，并且使用MicronIII视网膜成像显微镜（PhoenixResearchLaboratories，Peasanton，CA,USA)拍摄眼底照片。如之前所描述的（Chekroud等，2011)，在处死小鼠之前进行视网膜电图研究。使用KruskallWallisAN0VA进行统计学比较，并且使用Siegel-Castellan2X2比较进行事后（post-hoc)比较（Siegel和Castellan,1998)。[0075]转基因表达的分析[0076]在注射后2周处死小鼠，将眼摘出，并且去除眼球的前段。对于蛋白质印迹分析，分别将视神经视网膜切下并且置于裂解缓冲液(50mMTrispH6.8、10%甘油和2%SDS)中。随后，使用镊子将RPE和脉络膜刮到裂解缓冲液中并且与视神经视网膜合并。如上所述使一定百分比（7.5%)的总蛋白质样品迀移、转移并且与抗REP1或1/2000稀释的兔抗EGFP血清(Molecularprobes，Invitrogen)杂交。对于q-PCR分析，在RNA分离和cDNA合成之前将视神经视网膜和RPE/脉络膜样品骤冻（snapfrozen)。使用归一化至L27基因表达的基因特异性引物进行Q-PCR分析。[0077]组织学分析[0078]为了测定EGFP表达，将眼摘出并且在4°C在3.7%甲醛中固定6小时，在10%、20%、30%和40%蔗糖的连续浴中孵育，之后在00'基质中包埋并且以14以1切片（路86&11(1'HistologieExpgrimentaledeMontpellier(RHEM))。为了测定组织结构，将眼摘出并且在4°C在3.7%甲醛中固定24小时，在连续乙醇浴中脱水，在石蜡中包埋并且以4μπι切片(RHEM)。对于光感受器计数，将切片用苏木精和伊红染色。在幻灯片扫描器（HamamatsuPhotonicsK.K.，Japan;MontpellierRI0成像平台）上获得显微图像。对每个视网膜的至少4个矢状切面计数(掩蔽注射状态），并且计算光感受器核的数目的平均值。[0079]题[0080]患者突变的表征[0081]来自患者CHM1的成纤维细胞的基因组DNA的表征揭示了位于外显子8的起点上游40bp处的内含子7内7bp(TAGTTCT)(SEQIDN0:3)序列的重复。在重复序列之间是4bp插入序列（GATT)。该第一重复之后是位于起点后68bp处的外显子8内的15bp序列的第二重复(GTCATGCATTCAATT)。位于两个重复之间的包含内含子7的末端和外显子8的起点的97bpDNA序列缺失。内含子7受体剪接位点的丧失和随后显外子8的缺失导致氨基酸位置314处的预期移码和位置332(野生型REP1为653aa)处的提前终止密码子，从而截短了REP1的第二GDP离解抑制剂(GDI)结构域。利用针对存在于野生型REP1和截短的REP1(73.49kDa)以及REP2(74.08kDa)中N末端表位的抗体进行的蛋白质印迹分析对于对照细胞检测到了2个带，并且对于CHM细胞检测到了1个带(对应于REP2)，表明截短的蛋白质是不稳定的。与对照细胞相反，使用第二REP1特异性抗体进行的蛋白质印迹分析没有在CHM1细胞中检测到蛋白质。[0082]因此，患者CHM1所携带的突变破坏了REP1蛋白质的产生。另外，在DNA、RNA和蛋白质水平下进行的检测测试将用于验证患者之后产生的任何细胞类型中突变的存在。[0083]患者特异性iPS细胞的产生和确认[0084]我们使用带有Yamanaka转录因子混合物(〇-]\^(：、10^4、0(^4、3(^2)的多西环素诱导型慢病毒载体进行CHM1成纤维细胞的重编程。我们通过qPCR研究验证了在多西霉素诱导后24小时每个转基因的表达。多西环素诱导后1周，成纤维细胞开始改变形态，部分重编程的集落(前iPSc集落)随时间而出现和消失。相比之下，多西环素诱导后5周，检测到形态特征性集落，将存活的那些机械传代到不具有多西环素的ES培养基中。CHMliPScDNA的PCR扩增表明存在原始CHM缺失，并且它导致mRNA中完全缺失外显子8，如通过野生型和CHM1iPScRNA产生的cDNA片段之间226bp的差异所证明。此外，CHMliPSc没有呈现出可能在重编程期间发生的任何大的染色体异常，如通过核型分析所显示。[0085]通过多种技术并且使用野生型克隆M4C7(Ramirez等，2013)作为阳性对照验证了CHM1iPSc的多能性。首先，在mRNA水平下，qPCR研究证明CHM1iPSc中外源c-MYC、KLF4、0CT4和S0X2的沉默以及内源0CT4、S0X2、LIN28和NAN0G表达的激活。其次，碱性磷酸酶染色是阳性的，并且免疫荧光（IF)研究确认了NAN0G的表达并且指示了SSEA3的表达。最后，当在免疫缺陷小鼠中皮下注射时，CHMliPSc诱导形成畸形瘤，并且通过组织学分析确认了三个胚层的标志物的表达:外胚、中胚层和内胚层。[0086]总之，我们产生了CHM患者的真正iPSc。[0087]患者特异性RPE的产生和确认[0088]我们使用自发分化方案由野生型M4C7和CHMliPSc产生了视网膜色素上皮(RPE)。在将iPSc培养至汇合并且从培养基中除去bFGF后大约30天，板中出现色素灶。将这些灶机械传代，并且在汇合时产生RPE特征性的多边形色素细胞单层。将细胞接种到半透明的多孔过滤器上允许进行切片和组织学分析。对半薄切片的观察结果证明细胞层是规则单层。透射电子显微术显示所述单层是极化上皮，其具有顶侧上的微绒毛、基侧上的细胞核、细胞溶质黑色素体和指示紧密连接的桥粒。上皮似乎分泌在RPE和matrigel涂层之间可检测到的基膜。RT-PCR研究证明，所述iPSc衍生的上皮表达用于视觉周期（如RLBP1、RPE65、LRAT、RDH5)、视网膜发育(PAX6)、吞噬作用(MERTK)、色素沉着(TYR)、离子转运(BEST1)和细胞粘附（Z0-1)的典型基因。另外，IF研究显示，根据各自的作用，MERTK局限于顶部微绒毛中（图4卩），〇^1^和1^65局限于细胞质中，20-1局限于顶部结合处。此外，桥粒的存在与阳性20-1标记一致。除了这种典型RPE形态之外，iPSc衍生的RPE中还保存了两种体内功能。首先，板中随时间而出现了不同大小的充满流体的圆顶。这些可能是由于顶部-基部流体运输将RPE从培养板中提起而形成的。其次，RPE能够吞IffiFluoSpheres，这可以通过表面焚光显微术检测。FACS分析显示，内化的球体数量随时间而增加。最后，存在DNA和RNA水平的原始CHM突变，并且在CHM1RPE中不存在REP1。[0089]总之，这些结果确认，来自野生型和CHMliPSc的该iPSc衍生的上皮是真正的和功能性的RPE。[0090]检测生化缺陷[0091]为了确定来自个体CHM1的iPSc衍生的RPE是否重现患者的生物化学缺陷，我们建立了两种不同的技术来测定反映REP1活性的细胞内Rab的异戊二烯化状态。首先，我们使用体外异戊二烯化测定来测定细胞中未异戊二烯化Rab库的大小。为此，我们向野生型和CHM1细胞的裂解物中加入重组的RGGT、REP1和生物素化异戊二烯基供体。因此，如果未异戊二烯化Rab库可用于异戊二烯，则可以使用HRP缀合的链霉亲和素通过蛋白质印迹分析来检测整合的生物素。根据β肌动蛋白负载对照将对应于生物素化Rab的检测带归一化，并且将CHM1RPE中检测到的异戊二烯化Rab库设定为100%，以允许相对比较。平均来看，在野生型RPE中检测到为约1/4的水平的生物素化Rab，这与以下事实一致:在REP1和REP2的存在下，大部分Rab是异戊二烯化的和膜结合的。其次，我们特别测定了Rab27A的亚细胞分布，Rab27A是在视网膜中高表达的Rab蛋白质（Seabra等，1995)。通过差速离心，我们分离了野生型和CHM1细胞裂解物的细胞溶质级分和膜级分，并且通过蛋白质印迹分析利用特异性抗体分析了各自的Rab27A含量。对于异戊二烯化测定，根据β-肌动蛋白负载对照将各级分中Rab27A的量归一化。随后，将各细胞裂解物中Rab27A的总量（细胞溶质+细胞膜）设定为100%，并且将各级分中的量表示为总Rab27A含量的百分比。在野生型细胞中，细胞溶质Rab27A的量平均为膜结合量的约1/4.7。相比之下，在(》11^中，细胞溶质1^274的量平均为野生型细胞中观察到的约2倍，并且为膜结合量的1/1.8。[0092]因此，总之，CHM1RPE细胞模拟了CHM患者中见到的生物化学差异，即，由于REP1不存在而导致的Rab蛋白质的异戊二稀化不足(underprenylation)。[0093]转导RPE[0094]为了确定我们是否可以用AAV载体转导iPSc衍生的RPE并且确定最有效的血清型，我们测试了在CMV启动子的控制下表达EGFP的一组载体:AAV2/2、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9。首先，通过EGFP表达确定了所有血清型均能够转导iPSc衍生的RPE并且转导效率是剂量依赖性的。其次，对于等量的病毒基因组，每种血清型的效率为2/5>2/2>2/4>2/8/>2/9(图la)。值得注意地，平均来看，AAV2/5载体表达为AAV2/2的1.5倍（1.45±0.26，η=5)，并且它为AAV2/8和AAV2/9二者的大约6倍。为了探究这四种血清型的剂量依赖效应，我们将每个细胞中病毒基因组的数目增加到100〇〇〇。虽然AAV2/5的转导效率从EGFP阳性细胞的55%增加到了80%，但44￥2/2和44￥2/8或44￥2/9的转导效率保持分别为大约1/1.5和1/6(图Id)。另外，我们使用了最有效的血清型(AAV2/5)来比较两种不同启动子的效力:CMV相对于CAG(具有CMV增强子的鸡β-肌动蛋白）。平均来看，CAG指导为CMV2倍的表达水平(2·04±0.21，η=5;图la)。第三，时程实验表明表达在转导后4周达到峰值（图lc)。最后，iPSc衍生的RPE(即，野生型相对于CHM)的基因型并不影响转导效率(图Id)。[0095]总之，这些结果证明，与其它血清型、尤其是AAV2/2和AAV2/8相比，AAV2/5载体更好地转导人iPSc衍生的RPE。[0096]AAV2/5-CAG-CHM指导的REP1表达[0097]因此我们产生了在CAG启动子的控制下表达CHM的AAV2/5载体。对利用AAV2/5-CAG-CHM转导的CHM1成纤维细胞的IF研究确认，所编码的REP1被表达并且正确定位，如细胞质中大部分为囊泡的染色（图2a-c)所示。对转导的成纤维细胞的蛋白质印迹分析（图2d)，接着对归一化至肌动蛋白水平的REP1表达的半定量表明，REP1表达等于野生型的约17%。平行地并且根据蛋白质印迹数据，我们利用AAV2/5-CAG-EGFP转导了成纤维细胞，并且通过流式细胞术检测到14%的EGFP阳性细胞。一致地，利用AAV2/5-CAG-CHM对RPE进行的初始转导实验，接着的蛋白质印迹（图2e)和半定量分析表明，对于40%的EGFP阳性细胞(如通过AAV2/5-CAG-EGFP转导的RTO细胞的流式细胞计数确定的），REP1表达等于野生型的53%〇[0098]因此，总之，这些数据显示，利用AAV2/5-CAG-CHM转导的CHM1细胞中的REP1表达至少等于野生型的REP1表达。[0099]CHM基因转移[0100]然后利用AAV2/5-CAG-CHM载体转导CHM1RPE，并且基于时程实验的结果，在转导后4周分析REP1活性。图3a中显示了代表性实验。如上所述，在异戊二烯化实验中，将检测到的生物素化的Rabs库设定为100%。在用44￥2/5446-〇11载体转导(：圓11?^后，生物素化的1^*蛋白质的数量减少到1/4.5，这等于野生型RPE中的水平（图3c)。类似地，对AAV2/5-CAGCHM转导后的Rab27A的亚细胞分布的分析（图3B)显示，与非转导RPE相比，Rab27A的细胞溶质级分降低到1/2.4,并且膜结合级分增加到1.3倍，所述非转导RPE中的水平等于野生型RPE中的水平（图3d)。此外，利用对照AAV2/5-CAG-EGFP载体转导CHM1RPE并不显著改变各级分中Rab27A的比例。[0101]总之，我们提供了以下概念验证:AAV2/5介导的CHM基因转移恢复了CHM患者的RPE中的正常细胞表型。[0102]体内基因转移[0103]为了补充这些体外研究，我们向小鼠眼部注射PBS、AAV2/5-CAG-EGFP或AAV2/5-CAG-CHM并且测定表达。早在注射后3天，在用AAV-CAG-EGFP注射的小鼠的眼底中可以略微感知到EGFP表达。对注射后2周的视网膜提取物进行的Q-PCR研究显示注射AAV2/5CAG-CHM的小鼠的视网膜提取物中的人CHM的特异性表达以及注射CAV2/5-CAG-EGFP的眼中的EGFP的特异性表达(图4a)。相同时间点的蛋白质印迹分析确认了蛋白质水平下的这种特异性表达（图4b)。我们在注射后1周、2周（图4c)和1个月通过眼底镜检查观测了EGFP表达的演变，并且检测到表现稳定的广泛转导。荧光显微术确认了直到视神经的一半视网膜的转导，并且在RPE和光感受器二者中均检测到了EGFP表达（图4d)。[0104]总之，小鼠视网膜中的体内AAV2/5介导的基因转移导致RPE和光感受器二者中的基因表达。[0105][0106]干细胞已经彻底改变了人细胞培养领域，因为它们代表了理论上可以产生为身体中的任何细胞类型的多能性细胞的永久繁殖(Yu和Thomson，2008)。具体地说，诱导性多能干细胞（iPSc)代表了一种优异的工具，因为它们可以由成人体细胞产生（Takahashi等，2007;Yu等，2007)，因此避开了使用人胚胎干(ES)细胞所涉及的伦理考虑因素。另外，因为理论上干细胞可以分化成身体的任何细胞类型，所以它们允许得到还不能通过常规技术分离的原代细胞类型(Grimm，2004)。此外，如果原材料来自患有特定遗传病的个体，则祀细胞类型可以代表疾病特异性细胞模型(Park等，2008)。[0107]我们使用iPSc技术产生了疾病特异性视网膜色素上皮(RPE)模型，利用所述模型，我们能够为基因疗法方式提供概念验证。这是此类策略的第一个示例。通常，使用iPSc衍生的细胞模型来进一步理解疾病的病理生理学（singh等，2003)，用于筛选药理学药物的效率(Egawa等，2012)，或鉴于细胞移植用于产生细胞前体(Tucker等，2011)。我们在这里证明，iPSc衍生模型用于测试基因替代策略在相应治疗试验中将被靶向的细胞类型中的效率的进一步潜力。[0108]目前广泛认为AAV载体对于视网膜基因疗法是安全和有效的。在所鉴定的各种AAV血清型中，六4￥2/2^4￥2/4^4￥2/5^4￥2/8和44￥2/9均被证明取决于物种以可变的效率转导视网膜细胞类型（Vandenberghe和Auricchio，2012)。所有这5种血清型均转导RPE，而除AAV2/4之外的所有血清型转导光感受器(Weber等，2003)。另外，就光感受器转导来说，在小鼠眼和猪眼中证明AAV2/5、AAV2/8和AAV2/9显示出比AAV2/2更高的效率(Allocca等，2007;]\11188〇1;[110等，2011)。迄今为止在人中，已经测试了44￥2/2(1^;[11131^(^6等，2008;]^118￥；[1'1:11等，2008;Maguire等，2008)和AAV2/4(未公开)这两种血清型，并且积累的毒理学数据表明这些载体对于人眼是安全的，然而最有效的载体仍有待确定。[0109]我们在iPSc衍生的人RTO中测定了前述AAV血清型的转导效率。与文献一致，与AAV2/2相比，AAV2/5导致相同启动子的2倍高的表达水平。然而，我们证明，出乎意料地，AAV2/8比利用AAV2/2观察到的低。我们最初认为这是由于我们所使用的第一AAV2/8储液是由与其它血清型不同的载体产生平台产生的。因此，我们从相同的产生平台获得第二储液，但是结果相同。此外，我们探究了剂量依赖性效应，但是在人RPE中AAV2/5始终比AAV2/8更有效。另外，AAV2/9的结果类似。可能这是由于细胞表面受体的差异所致，因为AAV24结合α-2-3N连接的唾液酸，而AAV2/2、AAV2/8和AAV2/9不使用该受体(综述参见Agbandje-McKenna和1(16丨118(^1^扣，2011)。因为我们已经证明人丨？3(3衍生的1?^细胞的特征在于具有功能性体内RPE的典型特性，所以在体外观察到的在所有剂量下AAV2/5相对于AAV2/8和AAV2/9的优势必定也适用于体内。因此，可能在人RPE中，较低剂量的AAV2/5病毒载体将提供优于其它血清型的转导，这具有重要的安全意义。[0110]我们证明RPE的AAV2/5转导是剂量依赖性的，并且证明通过使用CAG启动子而不是CMV启动子，可以进一步提高转导效率。我们达到了最高85%的转导效率，如果我们考虑使用AAV载体进行体外转导的众所周知的困难，那么这是令人惊讶的。转导可能受助于RPE的吞噬特性，这代表了其在眼中的关键作用之一(Sparrow等，2010)。在体内，光感受器每天持续更新它们的外段盘并且脱落它们在R0E侧的旧段。RPE负责脱落盘的吞噬，所述脱落盘如果积累的话将是毒性的。因此，iPSc衍生的RPE的吞噬能力模拟了向视网膜下空间施用的AAV载体所遇到的情形，并且进一步突出了这一模型的优异潜力。在体内，光感受器持续更新它们在顶侧的外段盘，因此每天脱落它们在它们的底部的旧段。RPE负责脱落盘的吞噬，所述脱落盘如果积累的话将是毒性的。这一特性也可以解释所有物种中与利用AAV载体的光感受器相比RPE更高的转导效率(Vandenberghe等，2011)。最后，一旦RPE在培养中汇合，细胞分裂即停止，因此使得可以长时间观测转基因表达，因为AAV载体不随时间而损失。[0111]为了确定我们是否可以使用人RPE的细胞模型测试AAV2/5介导的基因转移方法的效率，我们由患有无脉络膜症的个体的成纤维细胞产生iPSc衍生的RPE。无脉络膜症是一种视网膜营养不良，其中RPE的变性似乎在其病理生理学中起关键作用（Krock等，2007;Tolmachova等，2010)。此外，它是iPSc衍生方法的一个完美候选，因为不存在为基因拯救(generescue)研究提供信息的疾病特异性动物模型(Tolmachova等，2013,Tolmachova等，2012)。我们在这里证明了无脉络膜症特异性RPE表达特征性蛋白质，是功能性的，并且模拟了在患者中见到的生物化学缺陷：所编码的蛋白质REP1的缺失导致Rab蛋白质、尤其是Rab27A的异戊二烯化不足，从而导致膜缔合Rab的数目的减少以及细胞溶质库的增加。这提供了用于评估功能恢复的定量读出。使用两个独立测定，我们证明，CHM基因转移通常能够减少细胞溶质Rab库，尤其是Rab27A库。这提供了人RPE中的概念验证:AAV2/5介导的CHM基因转移可以恢复正常的细胞表型。[0112]本文描述的工作证明在不存在适当的动物模型的情况下，使用人疾病特异性细胞模型进行概念验证的可能性。这受助于以下事实：已经通过靶向视网膜的临床试验验证了载体本身（即使是不同血清型），因此体外研究主要评估了转基因的功能。如果AAV介导的视网膜基因疗法领域继续积极进展，则这一相同的策略可以被应用于其中影响RPE的多种IRD，因此促进临床转化。[0113]我们在患病视网膜的相关人细胞模型中提供概念验证的方法是其种类中的第一个示例，并且彻底改变了"临床前"思维。已经发表了另外两篇文章，其确认了使用条件性小鼠模型进行无脉络膜症的表型恢复研究以及基本上基于细胞模型(CHM成纤维细胞和iPSc)提供概念验证的困难(Tolmachova等，2013;Vasireddy等，2013)。在这里，我们更进了一步并且在RPE细胞(受影响的主要细胞类型）中提供了概念验证，因此避免了由疾病发病机理中不涉及的细胞类型进行外推。另外，前述这些论文评价了AAV2/2介导的CHM基因疗法的效率，我们证明其在人RPE中的效率低于AAV2/5。[0114]总之，这些数据首次提供了以下证明：与AAV2/2、AAV2/4、AAV2/8和AAV2/9载体相比，我们用于在CAG启动子的控制下载送(VehiCle)CHM基因的AAV2/5载体是用于患有无脉络膜症的患者的人RPE细胞的基因疗法的更好载体。[0115]参考文献[0116]在本申请通篇中，各个参考文献描述了本发明所属领域的现状。这些参考文献的公开内容在此通过引用并入本公开中。[0117]Agbandje-McKennaM?KleinschmidtJ(2011)AAVcapsidstructureandcellinteractions.MethodsMolBiol807:47-92[0118]AlloccaM，MussolinoC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