20(r)-人参三醇衍生物的制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一类20(R)?人参三醇衍生物及其制备方法与应用。本发明所提供的20(R)?人参三醇衍生物，其结构式为式Ⅰ、式II、式III、式IV、式Ⅴ、式VI、式VII、式VIII、式IX、式Ⅹ、式XI和式XII。本发明利用微生物转化技术，对20(R)?人参三醇成功地进行了结构修饰，获得了多种新型化合物，通过体外抗肿瘤细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。
【专利说明】
20(R)-人参三醇衍生物的制备方法与应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体涉及20(R)_人参三醇衍生物及其制备方法以及该 衍生物的医药用途。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，研究和开发抗肿瘤药物一直是医药领 域的重要研究内容。天然产物一直是人类寻找有效活性成分的源泉，在新药开发过程中，一 方面具有良好活性的天然产物可以直接被用于临床;另一方面，以天然活性成分为先导化 合物，通过有机合成、结构改造等方法寻找和开发新的高效低毒药物，是被实践证明最行之 有效的开发新药的途径之一。
[0003] 现代的药理研究表明，20(R)_人参三醇具有较好的抑瘤作用，同时还能增强高三 尖衫酯碱、阿糖胞苷等化疗药物的疗效。但是，20(R)_人参三醇属于四环三萜类化合物，缺 乏活泼基团，反应位点少，采用常规化学反应方法难以制备出满足要求的衍生物。
[0004] 微生物转化的实质是由微生物体系代谢过程中产生的酶作用的催化反应。生物体 系中的酶能催化多种生化反应，并且催化速度超出想象，催化反应不仅能在体内进行，更能 在体外促进天然化合物以及人工合成化合物的多种转化反应。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一系列20(R)_人参三醇衍生物及其制备方法。
[0006] 本发明具体技术方案如下：
[0007] -种具有3位，6位羰基，24β位羟基取代的人参三醇衍生物:3，6-二羰基-24β_羟基 20 (R)_人参三醇，具有式I结构：
[0009] -种具有3位，6位羰基，22β位羟基取代的人参三醇衍生物:3，6-二羰基-22β-羟基 20 (R)_人参三醇，具有式II结构：
[0011] 一种具有3位，6位，12位羰基，23β位羟基取代的人参三醇衍生物:3，6，12-三羰基- 23β-羟基20(R)_人参三醇，具有式III结构：
[0013] 一种具有3位，6位羰基，23α位羟基取代的人参三醇衍生物:3，6-二羰基-23α-羟基 20 (R)_人参三醇，具有式IV结构：
[0015] 一种具有3位，6位，23位羰基取代的人参三醇衍生物：3，6，23-三羰基20 (R)-人参 三醇，具有式V结构：
[0017] 一种具有3位，6位羰基，15α位羟基取代的人参三醇衍生物:3，6-二羰基-15α-羟基 20 (R)_人参三醇，具有式VI结构：
[0019] 一种具有3位，6位羰基，15β位羟基取代的人参三醇衍生物:3，6-二羰基-15β-羟基 20 (R)_人参三醇，具有式VII结构：
[0021] 一种具有3位，6位，15位羰基取代的人参三醇衍生物：3，6，15-三羰基20 (R)-人参 三醇，具有式VIII结构：
[0023] 一种具有3位，6位羰基，16β位羟基取代的人参三醇衍生物:3，6-二羰基-16β-羟基 20 (R)_人参三醇，具有式IX结构：
[0025] 一种具有3位，6位羰基，16β位羟基取代的人参三醇衍生物:3，6-二羰基-16β-羟基 20 (S)-人参三醇，具有式X结构：
[0027] 一种具有3位，6位羰基，Ια位，15α位羟基取代的人参三醇衍生物:3，6-二羰基-Ια， 15α-二羟基20 (R)_人参三醇，具有式XI结构：
[0029] 一种具有3位，6位羰基，5α位，15α位羟基取代的人参三醇衍生物:3，6-二羰基_5α， 15α-二羟基20 (R)_人参三醇，具有式XII结构：
[0031]本发明还提供了上述20(R)_人参三醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：1)发酵 培养微生物，向培养基中加入20(R)_人参三醇接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵 液，所述微生物为犁头霉(468丨(1丨3)，小克银汉霉((]111111；[11〖1^1]16113)，毛霉(111〇01')，链格孢 (Alternaria)，红酵母(Rhodotorula)，共头霉（3}〇1。6口11&1&81：1'11111)或根霉（1?11丨2(^118)属的 菌株;2)将所述发酵液经萃取后，蒸干萃取液，得到转化物残渣;3)将所述转化物残渣以硅 胶柱纯化，所述硅胶柱纯化采用氯甲烷-无水乙醇两相系统梯度洗脱，收集合并组分;4)将 所述组分用反相高效液相色谱纯化，优选制备条件为半制备用色谱柱YMC-Pack 0SD-A，5y m，12.0 X 250mm(日本YMC)，乙腈-水(60:40，V/V)，流速3. OmL/min，检测波长203nm得到结构 式为式I、式Π 、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的化合物。 [0032]其中，微生物优选为毛霉(Mucor)属菌株，更优选总状毛霉。上述方法步骤1)中培 养基中20(R)_人参三醇的浓度为2-2000yg/mL。
[0033]上述方法步骤2)中萃取溶剂为常规机型有机溶剂，优选乙酸乙酯。
[0034]本发明的另一目的是提供本发明人参三醇衍生物式I、式II、式III、式IV、式V、式 VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的化合物的用途。
[0035] 本发明通过实验证实，本发明的20(R)_人参三醇衍生物具有良好的抗肿瘤活性， 可以作为抗肿瘤药物的活性成分，所述肿瘤优选宫颈癌、白血病、耐药白血病、神经母细胞 瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌等。
[0036] 这些抗肿瘤药物的活性成分可以是选自结构式为式I、式II、式III、式IV、式V、式 VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的化合物中的一种或几种。
[0037] 在以上述化合物为活性成分的药物中，需要的时候还可以加入一种或多种药学上 可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩 解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，均可以按照药学领域的常规方法制 备。
[0038]本发明利用微生物转化技术，对20(R)_人参三醇成功地进行了结构修饰，获得了 一类新的人参三醇衍生物，通过体外抗肿瘤细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肿瘤 活性，可以作为抗肿瘤药物的活性成分，具有广泛的用途。
【附图说明】
[0039]图1为本发明所述人参三醇衍生物的HPLC液相色谱图。
【具体实施方式】
[0040] 实施例1、结构式为式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、 式XI和式XII的化合物的制备
[0041] 本发明采用微生物转化方法，以20(R)_人参三醇为原料，经过发酵、提取、分离等 步骤，来制备本发明化合物。具有转化能力的微生物包括:犁头霉(Absidia)，小克银汉霉 (Cunninghamella)，毛霉(Mucor)，链格抱(Alternaria)，红酵母(Rhodotorula)，共头霉 (Syncephalastrum)或根霉（Rhizopus)属的微生物；其中转化能力较强的是犁头霉 (Absidia)和毛霉(Mucor)属的菌株。这些菌株均可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理 中心(CGMCC)或中国食品发酵研究所工业微生物保藏管理中心(CICC)，于固体斜面培养基 上置4°C冰箱内保存。真菌培养基选用马铃薯培养基，细菌培养基选用LB培养基。
[0042] 马铃薯培养基的配制(PDA培养基）：取200g去皮马铃薯，切成薄片，放入适量水中， 煮沸后80 °C保温lh。用双层纱布过滤后取滤液，加入20g葡萄糖，搅拌使葡萄糖完全溶解，以 水定容至l〇〇〇mL。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入3 %琼脂。
[0043]细菌培养基的制备(LB培养基）：每1000mL液体培养基加入5.0g酵母提取物，10.0g 蛋白胨，10.0g NaCl，加水溶解，调pH值至7.0。配制固体斜面培养基再在液体培养基中加入 1.5%琼脂。
[0044] 以总状毛霉Mucor racemosus AS 3.205为例，制备结构式为式I、式II、式III、式 IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的化合物的过程如下：
[0045] 1)发酵、转化以及萃取
[0046] 将总状毛霉Mucor racemosus AS 3.205接入2个250mL三角瓶（装有100mL马铃薯 培养基）中，作为种子液。于摇床上160rpm、26°C下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期， 用无菌移液管吸取lmL的种子液，加入到20个lOOOmL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基）中。振 荡培养1天后，每个摇瓶中加入25mg 20(R)_人参三醇（0.2mL，125mg/mL无水乙醇溶液），共 用500mg底物。相同条件下继续转化7天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸 乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物残渣约1.6g。
[0047] 2)硅胶柱纯化
[0048]将所得残渣溶于少量甲醇，与1.6g柱色谱硅胶(200-300目）混合拌样，自然干燥， 加至装有50g硅胶（200-300目）的色谱柱顶，用二氯甲烷-无水乙醇系统梯度洗脱(50:1-1: 8)，收集洗脱组分，采用TLC分析方法(硅胶G薄层板，二氯甲烷-无水乙醇（15:1)展开，10% 硫酸乙醇溶液喷雾，加热显色)将所得到的相似洗脱组分合并。
[0049] 3)反相高效液相色谱纯化
[0050] 合并组分用反相高效液相色谱纯化。制备条件为半制备用色谱柱￥1(^^士050-A，5μL?，12 · 0 X 250mm(日本YMC)，乙腈-水（60:40，V/V)，流速3 · OmL/min，检测波长203nm。得 到结构式为式I、式Π 、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的化 合物等12个转化产物。色谱图如图1所示。
[0051 ] 化合物I，3，6-二羰基-24α-羟基-20(R)-人参三醇，白色无定形粉末:HR-ESI-MS (m/z)511.3402[M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511.3399)。其13C-NMR数据 如表1所示。
[0052] 化合物II，3,6_二羰基-22β-羟基-20(R)_人参三醇，白色无定形粉末:HR-ESI-MS (m/z)511.3402[M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511.3399)。其13C-NMR数据 如表1所示。
[0053] 化合物III，3，6，12-三羰基-23β-羟基-20(R)_人参三醇，白色无定形粉末：·-ESI-MS(m/z)509.3242[M+Na] + (calculated for。3。1146〇5恥1，[]\1+似]+，509.3243)。其13(：-NMR数据如表1所示。
[0054] 化合物IV，3,6-二羰基-23a-20(R)_人参三醇，白色无定形粉末:HR-ESI-MS(m/z) 511 · 3401 [M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511 · 3399)。其13C-NMR数据如表 1 所示。
[0055] 化合物V，3，6，23-三羰基-20 (R)-人参三醇，白色无定形粉末:HR-ESI-MS(m/z) 509 · 3245[M+Na] + (calculated for C3〇H46〇5Nai，[M+Na] +，509 · 3243)。其 13C-匪R数据如表 1 所示。
[0056] 化合物VI，3,6_二羰基-15α-羟基-20(R)_人参三醇，白色无定形粉末:HR-ESI-MS (m/z)511.3399[M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511.3399)。其13C-NMR数据 如表1所示。
[0057] 化合物VII，3，6-二羰基-15β-羟基-20(R)_人参三醇，白色无定形粉末:HR-ESI-MS (m/z)511.3399[M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511.3399)。其13C-NMR数据 如表1所示。
[0058] 化合物VIII，3,6，15-三羰基-20(R)_人参三醇，白色无定形粉末:HR-ESI-MS(m/z) 509.3244[M+Na] + (calculated for C3〇H46〇5Nai，[M+Na] + ,5109.3243)。其 13C-NMR数据如表 1 所示。
[0059] 化合物1乂，3,6-二羰基-16|3-羟基-20(1〇-人参三醇，白色无定形粉末:册431-13 (m/z)511.3340[M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511.3399)。其13C-NMR数据 如表1所示。
[0060] 化合物X，3，6-二羰基-15β-羟基-20 (s)-人参三醇，白色无定形粉末：HR-ESI-MS (m/z)511.3341 [M+Na] + (calculated for C3〇H48〇5Nai，[M+Na] +，511.3399)。其13C-匪R数据 如表1所示。
[0061 ] 化合物XI，3,6_二羰基-1α，15α-二羟基-20(R)-人参三醇，白色无定形粉末:·-ESI-MS(m/z )527.3351 [M+Na].(calculated for C3〇H48〇6Nai，[M+Na] +,527.3349)。其 13C-NMR数据如表1所示。
[0062] 化合物XII，3,6-二羰基-5α，15α-二羟基-20(R)_人参三醇，白色无定形粉末:册-ESI-MS(m/z)527.3349[M+Na] + (calculated for。3。1148〇6恥1，[]\1+似]+，527.3349)。其13(：-NMR数据如表1所示。
[0063] 表1.式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的 碳谱数据(⑶Cl 3)
[0065] 以上结果表明，所得化合物结构正确。
[0066] 利用其他属的微生物，具体如刺囊毛霉111〇<^8口;[1108118八3 3.3450、少根根霉 1?1120卩118&1'1'1112118八3 3.3457、顶头抱厶(^61]1〇11；[1111181：1'；[(31：11111八3 3.2059，均可以米用以上 相同的过程来制备得到结构式为式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、 式X、式XI和式XII的化合物。
[0067] 实施例2本发明结构式为式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、 式X、式XI和式XII的化合物抗肿瘤活性。
[0068] 1)实验材料
[0069] 仪器与试剂：C02培养箱（Jouan IG0150);酶标仪(Bio-TEK ELx800);荧光倒置显 微镜(Olympus 1X51) ;MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所）、RPM I 1640培养基(Gibcol BRL)，Rnase A、胎牛血清、二甲基亚砜(DMS0)、胰蛋白酶（上海生物 工程有限公司）。
[0070]测试用肿瘤细胞株:Hela细胞(人宫颈癌细胞）、K562细胞(人白血病细胞）、K562/ ADR细胞(人白血病耐药细胞）、SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞）、Du-145 (人前列腺癌细 胞）、HePG2细胞(人肝癌细胞）、MCF-7细胞(人乳腺癌细胞），购于中国医学科学院肿瘤研究 所。
[0071 ]测试样品：实施例1所合成得到的化合物I-XII，纯度在90%以上；同时，选取顺铂 为阳性对照药物，各化合物均以DMS0溶解后稀释。
[0072] 2)实验方法
[0073]采用MTT法测定各受试化合物对肿瘤细胞株的半数抑制率IC5Q值:取对数生长期的 肿瘤细胞，用含10%小牛血清的RPM I 1640培养液调整细胞浓度为5X 105/mL，接种于96孔 培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔l〇〇yL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只 加入RPM I 1640全培养基，每孔100yL，设3个复孔。将96孔培养板置于37 °C、5 % C02培养箱 培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0. . 1-100μΜ，继续培养72h。按MTT法于酶 标仪，测定57Onm的吸光度（A)值，计算抑制率[抑制率=(1 -实验组A值/对照组A值）X 100%]。实验重复3次。应用SPSS 11.5软件作回归方程，计算各受试样品对肿瘤细胞作用 72h的半数抑制浓度（IC50)。
[0074] 3)实验结果
[0075]根据MTT法测试结果，计算本发明化合物I-XII对上述细胞的IC5Q值，结果如表2所 不。
[0076]表2.测试样品体外细胞毒活性筛选结果
[0078]结果表明，本发明的化合物I-XII具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的 活性成分。
【主权项】
1. 具有下列结构式的20(R)_人参三醇衍生物其药学上可成的盐：2. 如权利要求1所述人参二醇衍生物或其药学上可成的盐的制备方法，包括如下步骤： 1) 发酵培养微生物，向培养基中加入20 (R)-人参三醇，接着进行转化培养，除去菌丝体 后得到发酵液，所述微生物为犁头霉，小克银汉霉，毛霉，链格孢，红酵母，共头霉或根霉属 的菌株； 2) 将步骤1)得到的发酵液经萃取，得到转化粗提物； 3) 将步骤2)得到的转化粗提物经过硅胶柱层析，采用二氯甲烷-无水乙醇两相系统梯 度洗脱，收集合并组分； 4) 将步骤3)得到的洗脱组分用反相高效液相色谱进一步纯化，得到如权利要求1所述 的结构式为式I、式Π 、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式X、式XI和式XII的化 合物。3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述微生物为毛霉属的菌株。4. 含有权利要求1所述20(R)_人参三醇衍生物或其药学上可成的盐为活性成分的抗肿 瘤药物，活性成分选自结构式为式I、式Π 、式III、式IV、式V、式VI、式VII、式VIII、式IX、式 X、式XI和式XII的化合物中的一种或几种。5. 如权利要求1所述20(R)_人参三醇衍生物或其药学上可成的盐在制备抗肿瘤药物中 的应用。
【文档编号】C12R1/65GK105949265SQ201610335371
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】陈广通, 宋妍, 李建林, 葛红娟, 李 杰, 颜森森
【申请人】南通大学