抗人c-反应蛋白抗体及其应用

抗人c-反应蛋白抗体及其应用
【专利摘要】本发明涉及抗人C?反应蛋白抗体及其应用。本发明制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(P24及P03)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可满足人临床样本检测的人C?反应蛋白的时间分辨免疫荧光层析定量检测卡。
【专利说明】
抗人G-反应蛋白抗体及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体的涉及两种抗人C-反应蛋白（CRP)抗体及其制备 方法以及上述抗体在人c-反应蛋白检测中的应用。
【背景技术】
[0002] C-反应蛋白（C reactive protein，CRP)是蛋白质家族中的一员，是一种急性期反 应蛋白，在组织损伤和细菌感染时血浆浓度急剧升高，是机体重要的防御分子，主要由肝脏 产生并分泌。CRP由五个完全相同的球形单体以非共价键结合组成稳定的盘状结构，属于正 五聚体家族。CRP在结构上为对称的五面体，其单体由206个氨基酸组成，分子量约为23KDa， CRP的总分子量约为118KDa<XRP参与体内的各种炎症及免疫反应，是冠状动脉粥样硬化性 心脏病(冠心病）的重要标志物。大量研究表明：高水平的CRP是周围性血管病、心肌梗死、脑 血管病及血管性死亡的独立风险预测因子。
[0003] 在正常人血清中CRP含量极少，浓度为0.062-8.2mg/L，半衰期约为15小时。当发生 细菌感染2小时后即开始升高，平均8小时增加1倍，48小时达高峰，其在病毒感染时则不会 升高。CRP持续升高则提示机体存在慢性炎症或自身免疫性疾病。CRP变化不受病人的个体 差异、机体状态及治疗药物的影响。另外，CRP在其他领域亦发挥着重要的作用:①在由慢性 炎症引发心血管疾病的独立危险因素中CRP的作用已被证实，及时监测CRP的水平变化对心 血管疾病的干预及预后起重要作用。有些学者甚至认为CRP可作为心血管危险评估的金标 准，且CRP水平越高，发生心脑血管的危险性就越大;②CRP可用来评价急性胰腺炎的严重程 度，当发生广泛坏死性胰腺炎时血清中CRP的水平可高达250mg/L;③如将CRP与甲胎蛋白联 合应用，可用来鉴别肝脏恶性肿瘤与良性疾病，为临床治疗方案制定提供指导；另外，CRP测 定对肿瘤的治疗和预后亦有积极的意义，恶性肿瘤患者CRP水平大都升高，手术切除肿瘤后 CRP水平则会下降，且进行放疗、化疗和皮质激素治疗对血清CRP的影响非常小，所以测定血 清CRP的水平变化有助于临床估测各个器官系统中恶性肿瘤的进展过程。④评估患者预后： CRP水平越高，提示疾病控制不佳，预后不良。
[0004] 鉴于CRP在众多领域中的重要作用，制备CRP抗体并用于制备CRP定量检测试剂盒 具有重要的临床应用价值。CRP通常是通过抗体浊度法或免疫比浊法测定的，而他们的检测 能力在3-5mg/L以上，这个水平仅仅适用于对感染的预测，而对于冠脉及脑血管的危险预测 是远远不够的。除上述技术以外，使用胶体金和荧光定量检测技术的CRP试纸卡，可满足快 速检测及床旁检测的需求。其中荧光定量检测具备较高的检测性能，因此适用于检测精密 度要求较高的检验中心或大型医院临床科室的应用需求。

【发明内容】

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供能有效的、特异性结合人C-反应蛋白的抗体。更 具体地说：
[0006] 本发明的第一目的在于提供两种抗人C-反应蛋白抗体。
[0007]第一种抗人c-反应蛋白抗体(记为P24)，
[0008] 其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO: 1所示的 HCDR1、如序列SEQ ID N0:2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID N0:3所示的HCDR3;
[0009] 以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID N0:4 所示的LCDR1、如序列SEQ ID N0:5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID N0:6所示的LCDR3。
[0010] 优选的是本发明中的抗体P24的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，轻 链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0011] 第二种抗人c-反应蛋白抗体(记为P03)，
[0012] 其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID N0:9所示的 HCDR1、如序列SEQ ID N0:10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID N0:11所示的HCDR3;
[0013] 以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO: 12 所示的LCDR1、如序列SEQIDN0:13所示的LCDR2和/或如序列SEQIDN0:14所示的LCDR3。
[0014] 优选的是本发明中的抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，轻链可 变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0015] 本发明第二个目的是提供两种单链抗体，所述单链抗体P24的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示;所述单链抗体P03的氨基酸序列如SEQ ID N0:21所示。
[0016] 本发明第三个目的是提供两种编码上述单链抗体的核苷酸序列，编码单链抗体 P24的核苷酸序列如SEQIDN0:18所示，和编码单链抗体P03的核苷酸序列如SEQIDN0:20 所示。
[0017] 本发明第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。
[0018] 本发明第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主细胞。所属宿主细胞 可以是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞，优选为毕赤酵母。
[0019] 本发明第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：
[0020] 1)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；
[0021] 2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。
[0022]本发明的第七个目的在于提供上述抗人C-反应蛋白抗体在检测人C-反应蛋白含 量中的应用。
[0023]本发明的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人C-反应蛋白的抗体对组 合;该抗体对组合的检测灵敏度高，特异性好。
[0024]本发明的第九个目的在于提供一种利用所述抗人C-反应蛋白抗体检测人C-反应 蛋白的时间分辨免疫荧光层析定量检测卡，包括样品垫、荧光结合垫、反应膜和吸水垫;所 述荧光结合垫喷涂有荧光微球标记的抗体P03,所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位 置包被有抗体P24,质控带位置包被抗His标签抗体或Protein L。所述反应膜优选硝酸纤维 素膜。所述抗Hi s标签抗体优选鼠抗Hi s抗体。
[0025]本发明制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的 抗体组合(P24及P03);同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗 体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能均可 满足人临床样本检测的人C-反应蛋白的时间分辨免疫荧光层析定量检测卡。
【附图说明】
[0026] 图1.抗体重链及轻链可变区基因电泳图。Lane 1和Lane4为200bp DNA Ladder; Lane 2为抗体P24重链可变区DNA; Lane 3为抗体P24轻链可变区DNA; Lane5为抗体P03重链 可变区DNA;Lane 6为抗体P03轻链可变区DNA。
[0027] 图2.单链抗体结构示意图。VH表示重链可变区序列，VL表示轻链可变区序列，His标 签为六个组氨酸。
[0028] 图3.单链抗体PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0029] 其中，图3-a.为单链抗体P24基因 PCR产物;图3-b为单链抗体P03基因 PCR产物。
[0030] 图4.重组单链抗体毕赤酵母菌株诱导表达上清培养液鉴定图。
[0031] 其中，图4-a为重组单链抗体P24重组毕赤酵母菌株诱导表达上清培养液SDS-PAGE 电泳鉴定图；图4-b为重组单链抗体P03重组毕赤酵母菌株诱导表达上清培养液SDS-PAGE电 泳鉴定图。
[0032]图5. SDS-PAGE电泳鉴定单链抗体纯化效果图。
[0033] 其中，图5-a为SDS-PAGE电泳鉴定单链抗体P24纯化效果图；图5-b为SDS-PAGE电泳 鉴定单链抗体P03纯化效果图
[0034] 图6.为本发明时间分辨免疫荧光层析定量检测卡结构示意图。1为样品垫、2为反 应膜、3为吸水垫、4为质控线(C线）、5为检测线(T线）、6为荧光结合垫、7为PVC片材。
[0035] 图7.本发明时间分辨免疫荧光层析定量检测卡检测范围拟合曲线。其中横坐标为 蛋白浓度(ng/mL);纵坐标为检测值;r 2为0 · 998。
[0036] 图8.本发明时间分辨免疫荧光层析定量检测卡线性范围拟合曲线。其中横坐标为 理论浓度(ng/mL);纵坐标为检测值;r 2为0.996。
[0037] 图9.时间分辨免疫荧光层析定量检测与酶联免疫检测结果相关性。
【具体实施方式】
[0038] 定义
[0039] "抗体"又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形 的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所 述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。
[0040] "单链抗体"（scFv)指的是抗体的重链可变区（Vh)和轻链可变区（Vl)通过15~20个 氨基酸短肽(1 inker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的1 inker通常富含甘氨酸和丝 氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将Vl的N端连接至VH的C末端，或者相 反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异性，且其具有 分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。
[0041 ]互补决定区（complementarity-determining region，CDR)，也叫做高变区。成型 于抗体单体氨基酸的末端，是靶抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗 体的互补决定区又被称为独特型或者基因型。
[0042]实施例1.抗人C-反应蛋白杂交瘤细胞株的制备 [0043] 1.动物免疫
[0044]以提取于人血浆的C-反应蛋白（购买于HyTest公司）按照一般免疫程序免疫BALB/ c雌性小鼠（购自常州卡文斯实验动物有限公司）。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验 指南》。采用间接ELISA法跟踪免疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，进行小鼠 脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。
[0045] 2.细胞融合
[0046] (1).脾脏细胞的制备
[0047] 将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75% (v/v)的酒精中浸泡10分钟， 于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基 (购自Gibco公司）离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。
[0048] (2).饲养细胞的制备
[0049] 取8~10周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置 75 % (v/v)酒精中浸泡10分钟;无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL 1640HT培 养基(购自SIGMA公司）注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养 基注入20 % 1640HAT培养基中备用；
[0050] 取2~3周龄的雌性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75% (v/v)酒精中浸泡 10分钟;无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的 20 % 1640HAT培养基中，备用。
[0051] ⑶·细胞融合
[0052] 选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0,收集并计数。取约108个上述脾 细胞与2X10 7个上述SP2/0细胞株加入融合管中混合，lOOOrpm离心10分钟后弃上清(尽量 弃净），将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入lmL预热的 PEG1450(聚乙二醇1450,购自SIGMA公司），加入1640HT培养基30mL终止，lOOOrpm离心10分 钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20 %的1640HAT培养基中。
[0053] 将上述HAT培养基充分混匀后，以200yL/孔分装至96孔细胞培养板中，置37°C，5% C〇2的细胞培养箱中培养。一周后用10%1640HT培养基替换20%1640HAT培养基，3天后取上 清进行检测。
[0054] 3.抗人C-反应蛋白特异性杂交瘤株筛选
[0055] (1).检测板的准备：用CB包被液稀释CRP(购买于HyTest公司）至lyg/mL，包被96孔 ELISA酶标板，100yL/孔，2~8 °C包被过夜，洗涤一次拍干；含2 %牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，购买于盐城赛宝生物科技有限公司）的PBST缓冲液封闭（200ul/孔）， 37°C封闭2小时；拍干，备用。
[0056] (2).阳性克隆的筛选:将待检细胞培养上清100μL孔加入上述检测板中，于37°C 作用30分钟后洗涤并拍干，加入lOOyL/孔的HRP标记的羊抗鼠 IgG，于37°C作用30分钟后洗 涤并拍干，加入l〇〇yL/孔的TMB显色液，于37°C避光显色15分钟，每孔加入50yL的2M H2S〇4终 止反应，并于0D450处读取数值。阳性孔确定原则:0D450值/阴性对照值2 2.1。选取阳性克 隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100%即确 定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。杂交瘤细胞株M24及M03均具有较高的效价，遂后续进 一步对上述杂交瘤细胞株进行抗体可变区序列测序分析。
[0057] 实施例2.杂交瘤细胞株抗体可变区序列的测定
[0058] 对上述杂交瘤细胞株M24及M03抗体可变区序列进行测定。
[0059] a. RNA的提取:参照细胞总RNA抽提试剂盒(购自Roche公司）说明书对上述杂交瘤 细胞株M24及M03进行总RNA提取并立即进行反转录；
[0060] b.RNA反转录成为DNA:参照Thermo Scientific Reverted First strand cDNA SynthesisKit (购自Thermo公司）对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存 于-20°C备用；
[0061] c.可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，以鼠 IgG亚型单 克隆抗体可变区序列通用引物为引物，对重链及轻链的可变区序列进行PCR扩增，将PCR产 物经DNA胶回收试剂盒(购自TIANGEN公司）进行回收，见附图1;
[0062] d·可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pMD18-T kit(购自Takara公司） 说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pMDl 8-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5a，挑取 阳性克隆，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。
[0063] 测序得到杂交瘤细胞株M24的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示、轻 链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各 互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID N0:1所示的HCDR1、如序列SEQ ID N0:2所 示的HCDR2和如序列SEQ ID NO:3所示的HCDR3;其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序 列是：如序列SEQ ID N0:4所示的LCDR1、如序列SEQ ID N0:5所示的LCDR2和如序列SEQ ID 从):6所示的1^0)1?3。
[0064] 测序得到杂交瘤细胞株M03的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:15所示、 轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区 的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID N0:9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO: 10所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO: 11所示的HCDR3;其轻链可变区的各互补决定区的 氨基酸序列是：如序列SEQIDN0:12所示的LCDR1、如序列SEQIDN0 :13所示的LCDR2和如 序列SEQ ID从)：14所示的1^0)1?3。
[0065]实施例3.单链抗体的重组表达及纯化
[0066]根据实施例2中测序结果，分别将杂交瘤细胞株M24及M03抗体重链及轻链可变区 之间加入连接肽(GGGGS)3,引入六个组氨酸标签SEQ ID N0:17,并将其全基因融合组氨酸 标签按照毕赤酵母表达系统的偏爱性进行密码子优化的方法，进行单链抗体的重组表达。 所表达得到的抗体分别命名为抗体P24及抗体P03,其结构组成如附图2所示。上述单链抗体 的重组表达具体如下：
[0067] a)融合蛋白基因的表达质粒构建
[0068] 密码子优化后的抗体P24的核苷酸序列如SEQ ID N0:18所示、氨基酸序列如SEQ ID N0:19所示;密码子优化后的抗体P03的核苷酸序列如SEQ ID N0: 20所示、氨基酸序列如 SEQ ID勵:21所示。分别将优化后的抗体?24及?03全基因合成的片段上游引入?？102<^载 体中Xhol酶切位点，下游引入Xbal酶切位点，构建到pUC57质粒中，得到一种长期保存质粒， 质粒记为PUC57-P24及pUC57-P03(由南京金斯瑞科技有限公司提供）。进行PCR扩增，其中上 游引物P1为：5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'；下游引物P2为:5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3'。常规PCR程序后，琼脂糖凝胶电泳分析(附图3-a，图3-b)，显示两种产物大小与预期 大小（800bp、780bp)-致。将PCR获得基因产物回收纯化后，采用XhoI(#R0146S，购自New England Biolabs公司）和XbaI(#R0145V,购自New England Biolabs公司）双酶切，用T4连 接酶连接到pPICZaA(V19520,购自Invitrogen)质粒中，转化到DH5a感受态细胞中，在含有 Zeocin(R250_01，购自Invitrogen公司）的LB平板中37°C培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌 测序，比对，与预期序列完全一致，即得到单链抗体P24及P03的表达质粒，分别记为pPICZa-P24及pPICZa-P〇3。
[0069] b)单链抗体基因在毕赤酵母宿主工程菌株的构建、筛选及表达
[0070] YPDS固体培养基配制：参照Invitrogen公司EasySelect Pichia Expression Kit 说明书;毕赤酵母感受态细胞制备:参照EasySelect Pichia Expression Kit说明书;BMGY 培养基配制：参照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书；BMMY培养 基配制：参照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书。
[0071] 将pPICZa-P24及pPICZa-P〇3质粒，用SacI限制性内切酶酶切线性化。乙醇沉淀后 将线性化载体，分别电转化进入到X-33感受态酵母细胞，分别涂布到含有Zeocin的YPDS固 体培养基，30 °C培养3-5天，就有阳性克隆产生。
[0072] 挑取上述获得的单克隆于5mL BMGY培养基中，30°C培养至0D6Q() = 2.0~6.0时，取 lmL保存菌种，并将剩余菌液重悬后转移至IjBMMY中小量诱导表达，每隔24h补加甲醇至终浓 度为1 % (v/v)。一周后，离心收集菌液上清，通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，观察目标蛋白表 达情况(附图4-a，图4-b)。
[0073] 将上述获得的P24及P03重组基因工程菌株分别接种于500mL BMGY培养基中，30 °C，220rpm培养至菌体密度到0D6QQ = 2.0~6.0，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1.0 % (v/ v)。一周后，收集发酵培养液。
[0074] c)单链抗体纯化
[0075]采用组氨酸标签亲和柱纯化抗体P24及P03单链抗体，预装柱子选择为HisTrap HP，具体步骤如下：
[0076] 步骤一、发酵液的除杂预处理:将上述表达得到抗体P24及P03融合蛋白发酵液上 清，离心收集上清，并加入结合缓冲液，使得上清终浓度为300mM NaCl，20mM NaH2P〇4,10mM Imidazole，调pH7 · 5，0· 45μηι 滤膜过滤。
[0077] 步骤二、HisTrap HP亲和柱纯化:运用全自动智能蛋白纯化系统(AKTA avantl50， 购自GE healcare公司）对预处理获得的抗体P24及P03融合蛋白发酵液进行亲和纯化，柱子 为 HisTrap HP(17-5248-02,购自 GE healcare 公司）。结合缓冲液为 300mM NaCl，20mM NaH2P〇4，10mM Imidazole，pH7.5,洗脱缓冲液为300mM NaCl，20mM NaH2P〇4,500mM Imidazole，pH7.5。洗脱时进行线性洗脱，并收集各个洗脱峰。通过SDS-PAGE电泳鉴定纯度， 由附图5-a和图5-b可知，两种纯化后的蛋白纯度均达到95 %以上，更换缓冲液为PBS溶液并 超滤浓缩(lmg/ml)，过滤除菌于-20°C保存备用。
[0078] 本领域技术人员知晓，重组蛋白可以不带标签，也可带其他标签，也可加入其他形 式的连接肽。无论是否带标签或者带不同形式的标签都可采用Capto L纯化。
[0079] 实施例4.抗体的性能评价
[0080] 1、抗体P24及P03的Western blot鉴定
[0081] a.聚丙烯酰胺凝胶电泳:分别配置12%非变性聚丙烯酰胺凝胶和SDS-聚丙烯酰胺 凝胶;分别上样标准蛋白质及天然CRP蛋白（购买于HyTest公司），恒压下电泳1小时；
[0082] b.转膜:恒流(35mA/膜)条件下转膜1小时，将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质分别转 移至硝酸纤维素膜上。考马斯亮蓝G250对完成转膜的聚丙烯酰胺凝胶进行染色，观察蛋白 的残留情况；
[0083] c.封闭：含5%脱脂奶的TBST缓冲液封闭（封闭液），4°C过夜;封闭后洗涤液(TBST， 详见TaKaRa公司TBST buffer)洗涤一次，10分钟；
[0084] d.抗原抗体反应：封闭液稀释（按1: 400体积比）辣根过氧化物酶标记P24(P24-HRP，lmg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同）及辣根过氧化物酶标记P03(P03-HRP， lmg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同），分别加入上述硝酸纤维素膜中，室温反应 1小时;TBST洗涤5次，每次10分钟；
[0085] e.显色及拍照：吸干硝酸纤维素膜上残留液体，每张硝酸纤维素膜分别加入2mL稳 定型过氧化物酶溶液（lmL)与鲁米诺/增强剂溶液（lmL)的混合液(购买于Thermo公司），均 匀润湿硝酸纤维素膜的表面，室温避光反应一分钟后于凝胶成像系统（购买于GE公司）拍 照，留取结果。
[0086]实验结果表明，本发明两种抗体均可与变性及非变性血液提取的天然CRP反应，证 明了本发明两种抗体与天然CRP的结合力。
[0087] 2、单链抗体P24及P03在时间分辨荧光检测平台的评价
[0088] 用0.05mol/L pH7.2的roS将P24抗体稀释至lmg/ml，划线于硝酸纤维素膜上；用 0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液将时间分辨荧光微球标记的P03抗体稀释10倍，喷涂于结合 垫上；按附图6所示贴膜、切条、装卡(具体制备参见实施例5)。将检测卡分别检测浓度含量 为400、200ng/ml的天然CRP蛋白（购买于HyTest公司）和0.05mol/L pH7.2的PBS，检测结果 如下：
[0090] 由上述结果可知，P24、P03组成的双抗体夹心检测系统可应用于时间分辨荧光检 测平台，能够检测一定浓度的天然CRP蛋白。
[0091] 实施例5. C-反应蛋白的时间分辨荧光免疫检测卡的制备 [0092]本检测方法采用双抗体夹心免疫层析法的原理。
[0093] 1、溶液配制
[0094] 0.05mol/L ρΗ8·0的硼酸缓冲液制备：取0.1mol/L的H3B〇3 70ml，用0.025mol/L的 Na2B4〇7 · 10H20调节pH至8.0,并定容至100ml，置于4°C备用，有效期3个月。
[0095] 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，购自SIGMA公司）溶液制备： 1.5gEDC加入100ml去离子水，配成水溶液置于4°C备用，有效期3个月。
[0096] 封闭液的制备:含10 % BSA (所述百分比均为质量体积比），0.05mo 1 /L pH8.0的硼 酸缓冲液，用〇. 22um滤膜过滤，置于4°C备用，有效期7天。
[0097] 荧光抗体稀释液制备:含1 %BSA，10%海藻糖，0·025%吐温-20，0·05mol/L pH8·0 的硼酸缓冲液，用〇. 22U膜过滤，置于4°C备用，有效期7天。
[0098] 包被抗体稀释液制备：含3 %甲醇，0 · 025 %吐温-20，0 · 05mol/L pH7 · 2的PBS，用 0.22U膜过滤，置于4°C备用，有效期7天。
[0099] 样本稀释液:含0 · 5 % BSA，0 · 025 % 吐温-20，0 · 05 % 安替比林，0 · 05 % procl in300， 0.05mol/L pH8.0的硼酸缓冲液，2-28°C保存有效期1年。
[0100] 2、c-反应蛋白荧光检测卡制备
[0101] 1)时间分辨焚光微球标记
[0102] P03抗体标记方法如下（以500ul反应体系为例）：加400ul硼酸缓冲溶液于2ml离心 管中，加入l〇〇ul浓度1%粒径200nm的空载焚光微球(购自Thermo公司），漩祸振荡混勾。再 加入lOulEDC溶液，室温振荡15min。14000rpm 10°C离心10min，去上清，沉淀用0.5ml硼酸缓 冲液溶解，超声分散，功率100W，时间lmin(超声3s间隔3s)。
[0103] 活化后的微球中加入浓度lmg/ml的P03抗体75ul，250r/min25°C恒温震荡反应2h; 加入58ul封闭液，恒温震荡反应4h。14000rpm 10 °C离心15min，洗涤2次，去上清，沉淀用 〇.5ml硼酸缓冲液溶解，最后一次离心后沉淀用荧光抗体稀释液溶解并超声分散，置于4°C 恒温保存。
[0104] 2)荧光结合垫的喷涂
[0105] P03抗体荧光结合垫6喷点方法如下：用荧光抗体稀释液将上述制备的P03荧光抗 体稀释10倍，喷涂于整条结合垫(长300mm，宽12mm的玻璃纤维)上。
[0106] 3)硝酸纤维素膜的包被
[0107] 硝酸纤维素膜包被方法如下：取0.5ml浓度4mg/ml的P24抗体，加到5ml刻度离心管 中，加包被抗体稀释液至lml，包被于硝酸纤维素膜2的T线5位置。取0.5ml浓度为4mg/ml抗 HIS抗体，加到离心管中，加包被抗体稀释液至lml，包被于硝酸纤维素膜2的C线4位置。
[0108] 4)贴膜、切条、装卡
[0109] 样品垫1、荧光结合垫6、包被有P24抗体的硝酸纤维素膜(反应膜)2、将吸水垫3从 左至右依次设置，且两两之间少许接触，所述硝酸纤维素膜的T线5在左、C线4在右(如附图6 所示），并根据卡壳大小进行切割，装入卡壳，完成检测卡制备。
[0110] 5)试剂盒组装
[0111] 取铝箱袋和干燥剂;打开热封机，预热;将检测卡、干燥剂装入铝箱袋中；用热封机 封好铝箱袋;贴上标签。
[0112] 3、c-反应蛋白荧光检测卡的使用方法
[0113] 1)稀释待测样本:在洁净的离心管加入lmL样本稀释液，再精确吸取10yL血清/血 浆样本，加入到离心管中，振荡充分混匀。
[0114] 2)加样及判读：用移液枪吸取50yL稀释后的样本慢慢加入加样孔中，开始计时，10 ~15分钟内用荧光免疫层析仪定量判定结果。超过15分钟判定，结果无效。
[0115] 4、C_反应蛋白荧光检测卡检测效果评估
[0116] 1)精密性:将P24(包被)-P03(标记)检测卡按检测卡使用方法检测l、10、50mg/l的 CRP参考品（购于hytest)各25次重复测定，剔除离群值后计算检测卡精密度。实验结果显示 三个浓度检测结果变异系数CV〈15%。
[0118] 2)检测范围：将P24(包被)-P03(标记)检测卡检测不同浓度的CRP天然蛋白（购于 hytest)0.5、l、2、4、8、16、32、64、128mg/l，拟合曲线及检测范围为 0.5-120mg/L(如附图7)。
[0119] 3)线性范围：将高值样本与样本稀释液按照一定比例配制成5个系列浓度样本 (0.5、1、10、50、100mg/ml)，用P24(包被)-P03(标记)检测卡检测，每个样本检测3次，将结果 与理论浓度进行回归统计，判断在该浓度范围内是否成线性。线性范围为0.5-100mg/L(如 附图8)。灵敏度是0.5mg/L
[0120] 4)准确度一回收率:将P24(包被)_P03(标记）的检测卡检测添加量分别为1、10、 50mg/l的天然CRP蛋白，检测结果如下表。
[0122] 5、准确度一方法学比对：
[0123] 上述结果显示P24(包被)_P03(标记）的CRP检测卡性能较优，选择同类产品中目前 市场上获得良好信誉的广州万孚生物技术股份有限公司全程C-反应蛋白（hsCRP+常规CRP) 定量检测试剂盒(免疫层析法)作对照产品比对验证。选择20份临床病人标本，按1到20的顺 序编号，用对照产品和待评价的P24(包被)-P03(标记）的CRP荧光检测卡同时进行实验，按 照1，2，3......18，19，20，20，19，18......3，2，1的样本顺序进行测定。对照和待评价产品 的检测结果相关系数R2 = 〇.98,说明两种方法检测结果有较好的相关性(如附图9)。
[0124] 6、配方筛选：
[0125] 除上述最优制备例1外，
【申请人】还尝试多种制备方案，例如下面5组检测卡制备及 应用结果如下表：

【主权项】
1. 抗人C-反应蛋白抗体，包括： 重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO: 1所示的HCDRUn 序列SEQIDN0:2所示的HCDR2和/或如序列SEQIDN0:3所示的HCDR3 ; 以及轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID N0:4所示的 LCDR1、如序列SEQ ID N0:5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID N0:6所示的LCDR3。2. 权利要求1所述的抗人C-反应蛋白抗体，其特征是重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。3. 权利要求1所述的抗人C-反应蛋白抗体，其特征是氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示。4. 编码权利要求3所述抗体的核苷酸序列，如SEQ ID NO: 18所示。5. 含有权利要求4所述核苷酸序列的表达载体。6. 含有权利要求5所述表达载体的重组宿主细胞。7. 生产权利要求3所述抗体的方法，包括： 1) 在合适的条件下培养权利要求6所述重组宿主细胞表达抗体； 2) 然后从宿主细胞中纯化、收集抗体。8. 权利要求1-3任一项抗人C-反应蛋白抗体在检测人C-反应蛋白含量中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK105949309SQ201610225905
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】马永, 赵利利, 杨芸, 王安良, 范宇
【申请人】江苏众红生物工程创药研究院有限公司