一种β-葡萄糖苷酶单克隆抗体及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种β?葡萄糖苷酶单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤S1取抗原β?葡萄糖苷酶注射免疫小鼠；S2间接ELISA法测免疫小鼠的血清效价；S3挑选血清效价为20000以上的小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合；S4融合后采用HAT培养液培养和间接ELISA检测筛选，获得阳性杂交瘤细胞；S5用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100％；S6采用小鼠体内诱生腹水法制备β?葡萄糖苷酶单克隆抗体；S7纯化β?葡萄糖苷酶单克隆抗体。通过本发明方法制备的β?葡萄糖苷酶单克隆抗体具有高效价、高稳定性和高特异性。
【专利说明】
一种β-葡萄糖苷酶单克隆抗体及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其涉及一种β-葡萄糖苷酶单克隆抗体及其制 备方法。
【背景技术】
[0002] β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶， 分子量一般在40_250Kd之间，不同来源的β-葡萄糖苷酶相对分子量由其结构和组成不同而 差异较大。它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和 相应的配基。1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现。后来的研究发现，β-葡萄糖苷 酶存在于自然界许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌体内。它参与生物体的糖代谢，对 维持生物体正常生理功能起着重要作用。木薯(cassava)，别名木番薯、树薯，是世界三大薯 类(马铃薯、甘薯、木薯)之一，也是全球六大粮食作物之一。木薯的块根可作为食物、饲料以 及工业原料，到目前为止，世界上木薯产量的65 %用于人类食用，但是木薯块根、茎叶等除 种子外各部分均含有生氰糖苷，当其进入人畜体内后，可被水解为有剧毒的氢氰酸(HCN)， 使组织细胞室息中毒。Anne Vinther Morant等研究发现木薯组织在受到破坏后，位于液泡 中的生氰糖苷与来源于乳管或者细胞壁中的葡萄糖苷酶相互作用就会被降解成氢氰酸， 而氢氰酸容易挥发，不容易检测。本研究提供一种高纯度的葡萄糖苷酶单克隆抗体及其 制备方法，为后续用免疫学检测方法检测木薯中葡萄糖苷酶，从而间接检测木薯中氢氰 酸含量提供实验基础。
【发明内容】
[0003] 鉴以此，本发明提出一种β_葡萄糖苷酶单克隆抗体的制备方法，获得的β_葡萄糖 苷酶单克隆抗体具有高效价和高稳定性。
[0004] 本发明的技术方案是这样实现的：
[0005] -种β_葡萄糖苷酶单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0006] S1:取抗原β_葡萄糖苷酶注射免疫小鼠；
[0007] S2:间接ELISA法测免疫小鼠的血清效价；
[0008] S3:挑选血清效价为20000以上的小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合；
[0009] S4:融合后采用HAT培养液培养和间接ELISA检测筛选，获得阳性杂交瘤细胞；
[0010] S5:用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100%;
[0011] S6:采用小鼠体内诱生腹水法制备β-葡萄糖苷酶单克隆抗体；
[0012] S7:纯化β-葡萄糖苷酶单克隆抗体。
[0013] 进一步的，所述步骤S1中：无菌条件下取出5周小鼠快速免疫佐剂，与含有抗原β-葡萄糖苷酶的生理盐水等体积混匀，通过小鼠后腿肌肉注射免疫小鼠，按葡萄糖苷酶50μ g八鼠的剂量注射免疫小鼠；第21天按同样方式再加强免疫1针。
[0014] 进一步的，所述步骤S2中：第35天小鼠断尾采血，全血于4°C条件下放置8-12h，然 后在4°C条件下，以lOOOOr/min的转速离心10min，收集血清，通过间接ELISA法对血清的效 价进行检测。
[0015]进一步的，所述步骤S3中：挑选血清效价为20000以上的小鼠，取50ygi3-葡萄糖苷 酶溶于500ul生理盐水，混匀后于小鼠腹腔加强免疫，72小时后摘其眼球取全血，然后使用 体积浓度为75%的酒精中浸泡5min，无菌条件下取出小鼠脾脏，将分离后的脾细胞和骨髓 瘤细胞混合，以1500r/min的转速离心10min，加入体积分数为50%的PEG中进行融合。
[0016] 进一步的，所述步骤S6中：将克隆化后的阳性杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔中诱导 产生大量腹水，同时分泌大量葡萄糖苷酶单克隆抗体于腹水中。
[0017] 进一步的，所述步骤S7中：腹水用滤纸滤去沉淀和脂质，滤液用4倍体积的醋酸缓 冲液稀释，调节pH至4.5，逐滴加入辛酸至终浓度为25μ1/πι1，室温搅拌30min后，以10000r/ min离心20min，收集的上清液在冰浴条件下等体积加入饱和硫酸铵，冰浴搅拌30min后静置 8-12h，以10000r/min离心20min，所得沉淀用磷酸缓冲盐溶液透析，获得β-葡萄糖苷酶单克 隆抗体。
[0018] -种β_葡萄糖苷酶单克隆抗体，根据上述的方法制得。
[0019] 本发明的有益效果是：
[0020] 本发明方法用β-葡萄糖苷酶免疫小鼠，取免疫小鼠脾脏和SP2/0细胞融合，经间接 ELISA发检测和有限稀释法进行克隆，得到抗β-葡萄糖苷酶抗体阳性细胞株，经体内诱生腹 水法得到抗体，用辛酸-硫酸铵法纯化获得高纯度的葡萄糖苷酶单克隆抗体。本发明所提 供的一种葡萄糖苷酶单克隆抗体的制备方法，获得了高纯葡萄糖苷酶单克隆抗体。通 过本发明的方法制备的葡萄糖苷酶单克隆抗体具有高效价、高稳定性和高特异性，为后 期用于葡萄糖苷酶的免疫检测奠定良好基础。
【附图说明】
[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍。
[0022] 图1为抗体纯化前后SDS-PAGE效果图。
【具体实施方式】
[0023] 为对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，发明人结合实施例进行说 明，但以下实施例所描述的仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明 中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施 例，都属于本发明保护的范围。
[0024] 实施例一
[0025] 本发明提供的β_葡萄糖苷酶单克隆抗体的制备方法，步骤如下：
[0026] S1:取抗原β_葡萄糖苷酶注射免疫小鼠：
[0027] 无菌条件下取出250μ1 QuickAntibody-mouse 5w(5周小鼠快速免疫佐剂），与含 有250yg抗原β-葡萄糖苷酶的250μ1生理盐水混匀后，通过小鼠后腿肌肉注射免疫小鼠，按 β-葡萄糖苷酶50yg八鼠的剂量注射免疫小鼠，本实验每只小鼠注射100μ1，共注射免疫5只小 鼠；第21天按上述同样方式，每只小鼠再加强免疫1针。
[0028]本实施例采用5周小鼠快速免疫佐剂取代传统的弗氏佐剂，使得β-葡萄糖苷酶抗 原在小鼠体内可以缓慢释放，该佐剂不需要乳化，不会破坏抗原结构，避免了使用弗氏佐剂 乳化过程中对抗原结构的破坏。
[0029] S2:间接ELISA法测免疫小鼠的血清效价：
[0030]第35天将小鼠断尾采血，全血于4°C条件下放置8-12h，然后在4°C条件下，以 10000r/min的转速离心10min，收集血清，通过间接ELISA法对血清的效价进行检测。
[0031] S3:挑选血清效价为20000以上的小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合：
[0032] 挑选血清效价为20000以上的小鼠，取50ygf3-葡萄糖苷酶溶于500ul生理盐水，混 匀后于小鼠腹腔加强免疫，72小时后摘其眼球取全血，然后使用体积浓度为75%的酒精中 浸泡5min，无菌条件下取出小鼠脾脏，将分离后的脾细胞和骨髓瘤细胞混合，以1500r/min 的转速离心10min，加入PEG中融合。为保证高融合率得到特异性杂交瘤细胞的可能，融合过 程采用体积分数为50 %的PEG，当浓度过大或过低时，细胞融合率明显降低。
[0033] S4:融合后采用HAT培养液培养和间接ELISA检测筛选，获得阳性杂交瘤细胞。
[0034] S5:用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100%。 为了防止无关克隆的过度生长，对阳性杂交瘤细胞需进一步克隆化，阳性杂交瘤细胞用有 限稀释法克隆细胞直至出现阳性单克隆率为100%，以确保抗体由单个克隆所产生。
[0035] S6:采用小鼠体内诱生腹水法制备β-葡萄糖苷酶单克隆抗体：
[0036] 将阳性杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔中诱导产生大量腹水，同时分泌大量β_葡萄糖 苷酶单克隆抗体于腹水中。
[0037] S7:纯化β-葡萄糖苷酶单克隆抗体：
[0038]腹水用滤纸滤去沉淀和脂质，滤液用4倍体积的0.06mol/L，pH=4.0的醋酸缓冲液 稀释，使用氢氧化钠溶液调节pH至4.5,逐滴加入辛酸至辛酸终浓度为25yl/ml，室温搅拌 30min后，以10000r/min离心20min，收集的上清液在冰浴条件下等体积加入饱和硫酸铵，冰 浴搅拌30min后静置8-12h，以10000r/min离心20min，所得沉淀用0.02mol/L的磷酸缓冲盐 溶液(PBS)透析72小时后获得β-葡萄糖苷酶单克隆抗体，于-20°C冻存。采用辛酸一硫酸铵 法比直接用硫酸铵法能获得更高纯度的β-葡萄糖苷酶单克隆抗体。
[0039]小鼠血清效价检测结果
[0040] 通过间接ELISA法对小鼠血清的效价进行检测，用采血前小鼠的血清作为阴性对 照，得到5只小鼠血清效价如表1所示，挑选效价较高的1#和2#小鼠取脾脏进行细胞融合。
[0041] 表1小鼠血清效价
[0043] β_葡萄糖苷酶单克隆抗体的效价和亚型测定
[0044]抗体检测效价的测定采用棋盘法，蛋白用0.05Μ ΡΗ 9.6的碳酸盐缓冲液梯度包 被，100μL7孔包被，37 °C避光反应2h，封闭lh，加 lOOyL/孔梯度稀释的抗体，37 °C反应30min， 洗涤液洗涤4-5次，加 lOOyL/孔酶标羊抗鼠抗体，37 °C反应30min，洗涤液洗涤4-5次，TMB底 物液37°C反应15min，0 · 5M H2S04终止反应后于450nm和620nm双波长条件下读数。选择阳性 吸光度值大于阴性吸光度值的2.1倍时，抗原抗体的稀释倍数为抗原抗体的效价。抗体亚型 用购买的分型试剂盒根据说明书进行检测。
[0045]如表2所示，融合后的细胞经过2-3次的克隆和间接ELISA方法筛选得到6株阳性单 克隆细胞，6株阳性单克隆细胞分别体外诱导法制备腹水。6株抗体效价均达到105及以上， 所有细胞株产生的抗体亚型都是IgG型，其中3C10为IgG2a型，其余抗体均为IgGl型。
[0046] 表2抗体效价和亚型测定
[0049] β-葡萄糖苷酶单克隆抗体纯化前后的SDS-PAGE效果
[0050] 6株抗体分别对比纯化前后的SDS-PAGE效果，参见图1，从左到右的序号分别表示 为：1: 1G2纯化前，2: 1G2纯化后，3: 1Α4纯化前，4: 1Α4纯化后，5: 3F6纯化前，6: 3F6纯化后，7: Marker，8: 3C10 纯化前，9: 3C10 纯化后，10: 3Η12 纯化前，11: 3Η12 纯化后，12: 4Η5 纯化前，13: 4H5纯化后。图1表明，辛酸-硫酸铵纯化方法除去了大部分的杂质，达到了纯化的目的。
[0051 ] β-葡萄糖苷酶单克隆抗体的稳定性测定
[0052]将所有纯化后的抗体分别取100ul，置-20°C反复冻融5次、4°C保存30天，37°C作用 7天，56 °C作用30min，比较处理前后抗体效价的变化情况。6株抗体热稳定性效价检测结果 见表3,所有抗体在56°C处理30min都有不同程度的失活，大部分抗体在-20°C冻融5次和在4 °C保存30天活性下降不明显，只有3C10效价下降相对较多，说明该抗体对温度变化相对敏 感，其他抗体活性相对较稳定。
[0053]表3不同条件下抗体稳定性测定
[0056] β-葡萄糖苷酶单克隆抗体的特异性检测：
[0057] 如表4所示，将6株抗体分别加到事先包被好β_葡萄糖苷酶、钙调蛋白、牛血清白蛋 白的酶标孔中反应，显色结果表明葡萄糖苷酶单克隆抗体只结合葡萄糖苷酶抗原，不 结合钙调蛋白、牛血清白蛋白，说明本发明方法制备得到的抗体为葡萄糖苷酶特异性抗 体，g卩β-葡萄糖苷酶单克隆抗体。
[0058] 表4 β_葡萄糖苷酶单克隆抗体的特异性检测
[0060] 对比例一
[0061] 对比例一与实施例一的区别在于:步骤S2中，无菌条件下取出弗氏佐剂与含有β- 葡萄糖苷酶的生理盐水混匀，按照5〇yg/只的剂量注射免疫小鼠。经测定，获得的小鼠血清 效价大部分低于10000。这是因为弗氏佐剂在乳化过程中破坏了抗原结构。
[0062] 对比例二
[0063]对比例二与实施例一的区别在于：步骤S4中，融合过程采用体积分数为60%的 PEG。
[0064] 对比例三
[0065]对比例三与实施例一的区别在于：步骤S4中，融合过程采用体积分数为40%的 PEG。
[0066] 融合率=(视野内发生融合的细胞总数/视野内的细胞总数)*100% AEG浓度对细 胞融合率的影响如表5所示。
[0067] 表5细胞融合结果
[0069]结果表明体积分数为50%PEG，细胞融合率最佳，当浓度过大或过低时，细胞融合 率明显降低。
[0070] 综上所述，采用本发明所提供的一种β-葡萄糖苷酶单克隆抗体的制备方法，获得 了高纯β-葡萄糖苷酶单克隆抗体。通过本发明的方法制备的β-葡萄糖苷酶单克隆抗体具有 高效价、高稳定性和高特异性，为后期用于β-葡萄糖苷酶的免疫检测奠定良好基础。
[0071] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种β-葡萄糖苷酶单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： Sl:取抗原β-葡萄糖苷酶注射免疫小鼠； S2:间接ELISA法测免疫小鼠的血清效价； S3:挑选血清效价为20000以上的小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合； S4:融合后采用HAT培养液培养和间接ELI SA检测筛选，获得阳性杂交瘤细胞； S5:用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化直至出现阳性单克隆率为100%; S6:采用小鼠体内诱生腹水法制备β-葡萄糖苷酶单克隆抗体； S7:纯化β-葡萄糖苷酶单克隆抗体。2. 根据权利要求1所述β_葡萄糖苷酶单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤Sl 中：无菌条件下取出5周小鼠快速免疫佐剂，与含有抗原β-葡萄糖苷酶的生理盐水等体积混 匀，通过小鼠后腿肌肉注射免疫小鼠，按β-葡萄糖苷酶50yg八鼠的剂量注射免疫小鼠；第21 天按同样方式再加强免疫1针。3. 根据权利要求2所述β-葡萄糖苷酶单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S2 中：第35天小鼠断尾采血，全血于4°C条件下放置8-12h，然后在4°C条件下，以10000r/min的 转速离心10min，收集血清，通过间接ELISA法对血清的效价进行检测。4. 根据权利要求3所述β-葡萄糖苷酶单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S3 中：挑选血清效价为20000以上的小鼠，取50ygi3-葡萄糖苷酶溶于500ul生理盐水，混匀后于 小鼠腹腔加强免疫，72小时后摘其眼球取全血，然后使用体积浓度为75 %的酒精中浸泡 5min，无菌条件下取出小鼠脾脏，将分离后的脾细胞和骨髓瘤细胞混合，以1500r/min的转 速离心10min，加入体积分数为50 %的PEG中进行融合。5. 根据权利要求4所述β-葡萄糖苷酶单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S6 中：将克隆化后的阳性杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔中诱导产生大量腹水，同时分泌大量β_ 葡萄糖苷酶单克隆抗体于腹水中。6. 根据权利要求5所述β-葡萄糖苷酶单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S7 中：腹水用滤纸滤去沉淀和脂质，滤液用4倍体积的醋酸缓冲液稀释，调节pH至4.5，逐滴加 入辛酸至终浓度为25yl/ml，室温搅拌30min后，以lOOOOr/min离心20min，收集的上清液在 冰浴条件下等体积加入饱和硫酸铵，冰浴搅拌30min后静置8-12h，以10000r/min离心 20min，所得沉淀用磷酸缓冲盐溶液透析，获得β-葡萄糖苷酶单克隆抗体。7. -种β-葡萄糖苷酶单克隆抗体，根据权利要求1至7任一项所述的方法制得。
【文档编号】C07K16/40GK105949315SQ201610568754
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月19日
【发明人】余厚美, 张振文, 林立铭, 王琴飞, 徐媛
【申请人】中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所