一种EpCAM特异性嵌合抗原受体及其编码基因、应用
【专利摘要】本发明公开了一种EpCAM特异性嵌合抗原受体，由人抗EpCAM的单链抗体、人抗体IgG1的CH2CH3、CD28的跨膜区和胞内信号结构、CD137的胞内信号结构、CD3ζ的胞内信号结构串联构成。本发明还公开了上述嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。本发明还公开了上述嵌合抗原受体在制备治疗EpCAM相关肿瘤药物中的应用，即修饰T淋巴细胞，修饰后的淋巴细胞可用于EpCAM相关肿瘤的治疗。
【专利说明】
一种EpCAM特异性嵌合抗原受体及其编码基因、应用
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞免疫技术领域，尤其涉及一种EpCAM特异性嵌合抗原受体及其编 码基因、应用。
【背景技术】
[0002] EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)上皮细胞粘附分子属于黏附分子 家族，也称为 17445八』6?40、1>〇?-1、1?八、0)326、了八〇5了01、0)17-^、6八733-2等<^?〇厶1是 一种由肿瘤相关 |丐信号转导 I (tumor-associated calcium signal transducer 1，TACSTDI) 基因编码的一个分子量30~40kDa的单次跨膜蛋白，参与调节细胞粘附、介导信号转导、细 胞迁移、增殖和分化等功能（Kurtz JE，DufourP.Adecatumumab:an antl-EpCAM monoclonal antibody,from the bench to the bedside[J].Expert Opin BioITher, 2010,10(6):951-958；Trzpis M,McLaughlin PM,de LeijLM,et al.Epithelial cell adhesion molecule.More than a carcinoma marker andadhesion molecule[J].Am J Pathol，2007，171(2):386-395)。
[0003] EpCAM表达在人部分正常上皮细胞和大多数恶性上皮细胞表面，目前普遍认为它 对肿瘤的生物学特性起重要作用。病理情况下，EpCAM几乎表达于所有的腺癌中，包括结直 肠腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝细胞癌、视网膜母细胞瘤 (Kurtz JE,Dufour P.Adecatumumab: an antl-EpCAM monoclonal antibody , from thebench to the bedside[j].Expert Opin BioITher,2010,10(6):951_958)。研究发现 EpCAM也是一些肿瘤干细胞的标记物，Kimura等的研究发现EpCAM阳性的肝癌干细胞能够诱 导免疫缺陷的小鼠发生肿瘤（Kimura 0，Takahashi T，Ishii N，et al .Characterization oftheepithe 1ia 1 cell adhesion molecule(EpCAM) + cell population in hepatocellularcarcinoma cell lines[J].Cancer Sci，2010，101(10):2145-2155·)〇将 肝细胞癌EpCAM阳性及阴性亚群细胞分别注射到免疫缺陷的小鼠体内，结果显示形成肿瘤 所需的癌细胞数EpCAM阳性者远少于EpCAM阴性者，且注射EpCAM阳性癌细胞的小鼠所产生 的肿瘤比注射EpCAM阴性者更大，说明EpCAM阳性的癌细胞致瘤性比EpCAM阴性的癌细胞大。 肝细胞癌细胞系中EpCAM阳性的亚群克隆速率远远大于EpCAM阴性的亚群。研究还发现， EpCAM阳性的癌细胞可以分化为EpCAM阳性和阴性的细胞，而EpCAM阴性的癌细胞只能分化 为EpCAM阴性的细胞，说明EpCAM阳性的癌细胞具有多项分化的潜能。
[0004] EpCAM的表达与肿瘤的预后相关，可作为肿瘤靶向治疗的一个靶位点。EpCAM的抗 体目前在欧洲得到FDA批准治疗癌性腹水，但目前还没有EpCAM的CART在临床应用。
【发明内容】
[0005] 基于【背景技术】存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种EpCAM特异性嵌合抗 原受体。
[0006] 本发明的目的还在于提供编码上述嵌合抗原受体的基因。
[0007] 本发明的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的应用。
[0008] 为了实现上述目的，本发明提出的一种EpCAM特异性嵌合抗原受体，其胞外抗原结 合区为人抗EpCAM的单链抗体。
[0009] 优选地，所述人抗EpCAM的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 优选地，所述嵌人抗EpCAM的单链抗体的重链和轻链分子之间有个连接肽，其氨基 酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011] 优选地，所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0012] 优选地，所述嵌合抗原受体由人抗EpCAM的单链抗体、人抗体IgGl的CH2CH3、CD28 的跨膜区和胞内信号结构、CD137的胞内信号结构、CD3G的胞内信号结构串联构成。
[0013 ]优选地，所述⑶28的跨膜区和胞内信号结构、CD 137胞内信号结构、⑶3ζ的胞内信 号结构串联构成的结构域为Τ细胞共刺激信号传导结构。
[0014] 优选地，所述Τ细胞共刺激信号传导结构的氨基酸序列如SEQ ID Ν0.4所示。
[0015] 优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0016] 本发明还提出的编码上述EpCAM特异性嵌合抗原受体的基因，其核酸序列如SEQ ID NO .6所示。
[0017] 本发明还提出的上述EpCAM特异性嵌合抗原受体在制备治疗EpCAM相关肿瘤药物 中的应用。
[0018] 本发明根据2001年发表的人源抗人EpCAM抗体的重链和轻链的可变区序列(Raum， 2001Cancer Immunol Immunother. Stefanie 2002，Int .J.Cancer)，经过密码子优化，基因 合成抗EpCAM的ScFv序列，并将合成ScFv克隆到pSFG-CH2CH3-CD28-CD137-CD3G中，即构建 成本发明的 EpCAM-scFv-CH2CH3-CD28-CDl 37-〇)3ζ 嵌合抗原受体。
[0019]本发明利用嵌合抗原受体与逆转病毒包装质粒PeqPam3及RD114env在293Τ细胞包 装成逆转病毒，利用该病毒感染T淋巴细胞。利用Elisa检测CAR-Τ细胞在抗原刺激下IFN-γ 的分泌，及通过流式检测对EpCAM阳性的肿瘤细胞的杀伤作用。
[0020] 本发明公布EpCAM特异性的嵌合抗原受体的结构，和体外感染T淋巴细胞的技术。 修饰后的T淋巴细胞释放IFN- γ等杀伤肿瘤细胞。EpCAM特异性的嵌合抗原受体可以用于 EpCAM相关肿瘤(如腺癌、肝细胞癌、视网膜母细胞瘤等)的靶向治疗。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明提出的EpCAM特异性嵌合抗原受体的结构示意图。
[0022] 图2为本发明所得EpCAM-scFv的PCR产物的电泳图。
[0023]图3为本发明所得EpCAM特异性嵌合抗原受体的电泳图。
[0024]图4为流式检测EpCAM特异性CAR-Τ细胞中CAR分子的表达的结果图。
[0025]图5为流式细胞分析肿瘤细胞和T细胞的比例结果图。
[0026]图6为本发明所得嵌合抗原受体EpCAM特异性CAR-Τ细胞与淋巴瘤细胞的MTT检测 结果图。
[0027] 图7为ELISA检测本发明所得CAR-Τ细胞在受到EpCAM刺激后IFN- γ和IL2的表达结 果图。
【具体实施方式】
[0028]下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0029]实施例1 :EpCAM特异性嵌合抗原受体逆转病毒载体的构建 [0030]本发明提出的一种EpCAM特异性嵌合抗原受体，由人抗EpCAM的单链抗体、人抗体 IgGl的CH2CH3、CD28的跨膜区和胞内信号结构、CD137的胞内信号结构、CD3G的胞内信号结 构串联构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0031] 1、利用2001年发表的人源抗人EpCAM单克隆抗体序列，选出VH和VL的序列，用于设 计CAR载体中的scFv序列，采用金斯瑞生物技术公司OptimumGeneTM基因设计软件对密码子 进行进一步优化，在优化的序列两端分别加上NcoI，BAMHI酶切位点，优化后的序列由南京 金斯瑞生物技术公司完成基因合成，合成后的序列克隆在PCDNA3载体，质粒命名为EpCAM-scFv-pCDNA3〇
[0032] 其中插入的EpCAM-scFv序列部分可以经由PCR进行扩增得到，接着进行检测，如图 2所示，其中条带1为EpCAM-scFv的PCR产物，750bp左右;条带2为100bp的参照条带。
[0033] 2、EpCAM-scFv-pCDNA3质粒用限制性内切酶Ncol和BAMHI酶切，酶切体系如下：2yg EpCAM-scFv-pCDNA3、lyL NcoI、lyL BamHI、2yL 10X酶切缓冲液，用水补到20yL，37°C水浴 中过夜，酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外下切取目的条带，采用DNA凝胶回收试剂 盒(AXYGEN公司）回收目的片段;用同样的方法Ncol和BAMHI酶切pSFG-CH2CH3-CD28-CD137-CD3G载体，用琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。将回收后的EpCAM-ScFv与酶切载体通过 T4DNA连接酶连接，反应体系如下：2yL EpCAM-ScFv、2yL载体酶切产物、lyL 10X连接缓冲 液，lyL连接酶，用水补到10yL，16 °C水浴中过夜。取连接产物加入到DH5a感受态中[参考《分 子克隆》第三版中大肠杆菌感受态制备(CaCl2法）]，放置37°C细菌培养箱中过夜培养。挑取 单个菌落，扩大培养，提取阳性克隆的质粒，经酶切（图3)和测序，将正确的载体命名为 EpCAM-scFv-CH2CH3-CD28-CDl 37-〇)3ζ，即本发明提出的EpCAM特异性嵌合抗原受体。
[0034]将所得EpCAM特异性嵌合抗原受体进行检测，其结果如图3所示，其中条带1为 100bp的对照条带，条带2为所得EpCAM特异性嵌合抗原受体。
[0035]实施例2: EpCAM特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞的制备 [0036] 1.含EpCAM特异性嵌合抗原受体逆转病毒的包装
[0037]用无内毒素质粒大提试剂盒内（天根生物）的操作说明书提取逆转录病毒包装载 体PRD114和EpCAM-scFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3G逆转录病毒载体共转染到293T细胞中， 转染后48h收集细胞上清，4000rpm离心10min，去除上清中的细胞及细胞碎片。用0.45μπι的 滤膜过滤，分装冻存，备用。
[0038] 2. Τ淋巴细胞的制备
[0039]采取20mL健康志愿者的新鲜抗凝血，用淋巴分离液(GE公司）分立外周血单核细胞 (PBMC)。分离后的细胞用CD3和CD28平板刺激48h，用T淋巴细胞培养基GT-T551(TAKARA公 司）加3%自身血浆进行诱导，得到T淋巴细胞。
[0040] 3.CAR-T细胞的制备
[0041 ] 用50yg/mL的RetroNectin(TAKARA公司）包被非组织培养板24孔板，每孔加入500μ L，4°C过夜。每孔再加入500yL病毒上清，37°C孵育30min。去除病毒上清，再加入500yL病毒 上清，37°C孵育30min，除病毒上清，每孔加入1.5mL病毒上清，再加入0.5mL稀释后的T淋巴 细胞，从而获得 EpCAM-scFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3G 细胞，即 EpCAM 特异性CAR-T 细胞。 [0042] 4.流式检测EPCAM特异性CAR-T细胞中CAR分子的表达
[0043] 将CAR-T细胞加入5yL FITC标记的抗Fc抗体(Jackson公司），37°C孵育lh后，进行 流式检测，检测结果如图4所示:其中左图为对照的T淋巴细胞，右图为感染嵌合抗原受体的 逆转录病毒的T淋巴细胞，由图4可知:本方法所得CAR-T细胞的效率大于90%。
[0044]实施例3:嵌合抗原受体EpCAM特异性CAR-T细胞对EpCAM相关肿瘤的杀伤作用 [0045] 1. CAR-T细胞对肿瘤的杀伤力检测
[0046] 将EpCAM阳性的结肠癌细胞HT-29用培养基调整到5 X 106/mL，每孔50yL，按效应细 胞和靶细胞比为4:1，加入瘤细胞2.5 X 105个，待细胞完全贴壁后，收集T细胞和CAR-T细胞， 调整细胞浓度为1.25X 106/mL，每孔50yL，然后分别进行流式细胞(培养24h)和MTT检测(培 养4h)。
[0047]首先，收集细胞进行CD3的染色，进行流式细胞分析肿瘤细胞(CD3J和T细胞(CD3+) 的比例，其结果如图5所示。由图5可知:本发明所得嵌合抗原受体EpCAM特异性CAR-T细胞能 有效杀伤结肠癌细胞。
[0048] 其次，同样的实验弃上清加入100yL稀释的CCK8,孵育4小时，酶标仪检测0D450的 吸光值。其检测结果如图6所示，CAR-T细胞对EpCAM表达的肿瘤的杀伤率高于EpCAM不表达 的肿瘤细胞;CAR-T细胞对相关肿瘤杀伤作用高于T细胞，高于单纯培养基。
[0049] 2.ELISA检测CAR-T细胞在受到EPCAM刺激后IFN-γ和IL2的表达 [0050] 将结肠癌细胞HT-29用培养基调整到5X106/mL，每孔50yL，加入结肠癌细胞HT-29 2.5 X 105个，待细胞完全贴壁后，收集T和CAR-T细胞，调整细胞浓度为1 X 106/mL，每孔50yL， 培养24h。收集上清液，利用ELISA试剂盒检测IFN- γ和IL2的表达。
[0051 ]其结果如图7所示，EpCAM特异性嵌合抗原受体修饰的Τ淋巴细胞在收到EpCAM阳性 的结肠癌细胞HT-29刺激后表达和分泌IFN- γ和IL2。
[0052]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种EpCAM特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞外抗原结合区 为人抗EpCAM的单链抗体。2. 根据权利要求1所述EpCAM特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗EpCAM的单链 抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. 根据权利要求1或2所述EpCAM特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌人抗EpCAM 的单链抗体的重链和轻链分子之间有个连接肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4. 根据权利要求1-3任一项所述EpCAM特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗 原受体的氨基末端含有一个信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。5. 根据权利要求1-4任一项所述EpCAM特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗 原受体由人抗EpCAM的单链抗体、人抗体I gG 1的CH2CH3、CD28的跨膜区和胞内信号结构、 CDl 37的胞内信号结构、CD3G的胞内信号结构串联构成。6. 根据权利要求1-5任一项所述EpCAM特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD28的 跨膜区和胞内信号结构、CD137胞内信号结构、CD3G的胞内信号结构串联构成的结构域为T 细胞共刺激信号传导结构。7. 根据权利要求6所述EpCAM特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述T细胞共刺激信号 传导结构的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。8. 根据权利要求1-7任一项所述EpCAM特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗 原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。9. 编码如权利要求1-8任一项所述EpCAM特异性嵌合抗原受体的基因，其特征在于，其 核酸序列如SEQ ID NO.6所示。10. 如权利要求1-8任一项所述EpCAM特异性嵌合抗原受体在制备治疗EpCAM相关肿瘤 药物中的应用。
【文档编号】C12N15/62GK105949323SQ201610483048
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】宋晓彤, 许国贞, 刘振云
【申请人】安徽未名细胞治疗有限公司