一种抗血小板黏附且不影响血小板功能的聚酯材料的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗血小板黏附且不影响血小板功能的聚酯材料的制备方法，属于生物材料表面改性领域。该方法首先采用氨解使聚酯材料表面带上正电的氨基或使多巴胺自聚合于材料表面形成带正电的聚多巴胺涂层，再将带有阳离子的聚酯材料浸入带负电的生物大分子溶液中，如此反复通过层层静电自组装使聚酯材料表面固定亲水和生物相容的生物大分子。该方法可有效降低聚酯材料的静态水接触角，提高材料的亲水性，生物大分子的引入能进一步阻止血小板的黏附，且对血小板的聚集等功能无显著影响。
【专利说明】
一种抗血小板黏附且不影响血小板功能的聚酯材料的制备 方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物材料的表面改性技术领域，具体为一种抗血小板黏附且不影响血 小板功能的聚酯材料的制备方法。
【背景技术】
[0002] 聚酯材料尤其是无纺布类，由于具有较大的比表面和多孔性，良好的物理机械性 能且易加工等优点，已被广泛用于医疗卫生领域，特别是白细胞过滤材料。但是，聚酯材料 表面极性官能团少，疏水性强，血液相容性差，限制了其在生物医用材料领域的应用，因此 必须进行亲水性改性，常用的改性方法包括紫外接枝、高能辐射、等离子体改性、浸泡涂覆 等。
[0003] 聚酯材料用于白细胞过滤时需直接与血液接触，其血液相容性(尤其是抗凝血性 能)尤为重要。材料与血液接触后，首先吸附在材料表面的是蛋白，通过蛋白吸附层引起血 小板黏附从而导致血小板血栓。因此，如何在高效去除白细胞的同时减少血小板的黏附，且 对血小板功能无显著影响是白细胞过滤材料特别是用于血小板过滤材料研究的难点和关 键点。
[0004] 早期关于聚酯材料的表面改性常在其表面涂覆或接枝丙烯酸及其衍生物，再用于 全血或红细胞悬液白细胞过滤材料，尽管显著提高了材料的亲水性和白细胞去除率，但由 于其羧基含量高，对血细胞功能有一定的影响。近年有研究在聚酯无纺布接枝聚丙烯酸的 基础上，再在材料表面沉积羟基磷灰石，在高效去除白细胞的同时红细胞回收率也较高，但 血小板黏附也较多。生物分子如磷脂酰胆碱与细胞膜上的磷脂双分子层结构类似，常用于 血小板用白细胞过滤材料的改性。研究结果显示，磷脂酰胆碱基团改性聚酯无纺布后可显 著提高血小板的回收率，但对血小板功能的影响并未被关注。最新研究采用在材料表面涂 覆或接枝与白细胞受体特异性结合的配体如多肽类，在减少过滤时间的同时白细胞去除也 显著增加，但对血小板黏附及血小板功能的影响并未研究。
[0005] 静电自组装是近年发展起来的新型成膜技术，其原理是基于静电吸附作用力，在 经活化带电荷的基材表面逐层吸附上带相反电荷的聚电解质从而形成多层膜。该法所形成 的涂层比普通的物理吸附更加稳定；与传统的化学固定法相比，静电自组装对所固定分子 的化学键要求小，条件简单、温和，能更好地保持分子的活性。
【发明内容】
[0006] 本发明的发明目的是针对上述技术问题，提出一种抗血小板黏附且不影响血小板 功能的聚酯材料的制备方法。该方法利用层层静电自组装技术使肝素等生物大分子负载于 聚酯材料表面，从而改善聚酯材料的亲水性和血液相容性，使材料抗血小板黏附且对血小 板功能无显著影响。
[0007] 为了实现上述目的，本发明的具体技术方案为：
[0008] 一种抗血小板黏附且不影响血小板功能的聚酯材料的制备方法，其包括如下具体 步骤：
[0009] 第一步，将聚酯材料浸泡于聚乙烯亚胺溶液中通过氨解使材料表面带氨基呈正电 性;或将聚酯材料浸泡于多巴胺溶液中通过氧化使聚多巴胺自聚合于材料表面形成带正电 的聚多巴胺涂层；
[0010] 第二步，将表面呈正电的聚酯材料浸泡于肝素钠溶液中，通过静电相互作用使材 料表面负载呈负电的肝素，再将带负电的材料浸泡于带正电的壳聚糖或多巴胺溶液中，如 此反复浸泡即可通过层层静电自组装使聚酯材料表面负载生物大分子肝素、壳聚糖或多巴 胺。
[0011]测定改性聚酯材料的zeta电位、静态水接触角、肝素含量判断改性效果，测定改性 聚酯材料对血小板的黏附及其对血小板聚集、低渗休克及CD62p的表达率的影响评价材料 的血液相容性。
[0012]具体地，上述抗血小板黏附且不影响血小板功能的聚酯材料的制备方法包括如下 步骤：
[0013] s 1.将聚酯材料浸泡于聚乙烯亚胺溶液(ros配制，pH = 7.4，浓度HOmg/mL)中进 行氨基化处理;或将聚酯材料浸泡于多巴胺溶液(PBS配制，pH=7.4,浓度1-lOmg/mL)中，加 入双氧水(wt5%-15%)，恒温振荡12小时，使多巴胺自聚合于聚酯材料表面形成聚多巴胺 涂层；
[0014] S2.将氨基化或多巴胺涂层的聚酯材料浸泡于肝素钠溶液中（醋酸盐缓冲液配制， pH=4.0,浓度1-lOmg/mL)，恒温振荡15-30min，使肝素通过静电作用负载于材料表面，然后 用pH=4.0的醋酸盐缓冲液漂洗2-4次；
[0015] S3.将S2得到的表面自组装聚阴电解质的聚酯材料浸泡于壳聚糖(醋酸盐缓冲液 配制，ρΗ=4·0,浓度1-lOmg/mL)溶液或多巴胺(PBS配制，ρΗ=7·4,浓度1-lOmg/mL)溶液中， 恒温振荡30-120min，使壳聚糖或多巴胺通过静电作用负载于材料表面，然后分别用pH = 4 · 0的醋酸盐缓冲液或pH=7 · 4的PBS漂洗2-4次；
[0016] S4.完成S3步骤后，多次循环重复步骤S2和S3 (即将S3处理后的聚酯材料按步骤S2 和S3分别浸泡于肝素钠溶液和壳聚糖或多巴胺溶液中），即得到表面负载生物大分子肝素、 壳聚糖或多巴胺的抗血小板黏附的聚酯材料。
[0017] 本发明的积极效果体现在：
[0018] ( -）、本申请利用层层静电自组装技术使肝素等生物大分子负载于聚酯材料表 面，从而改善聚酯材料的亲水性和血液相容性，使材料抗血小板黏附且对血小板功能无显 著影响。
[0019] (二）、静电吸附的物理作用既不会破坏生物大分子的结构，又能使生物大分子保 持其自身的生物活性。肝素是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，将肝素接枝到 材料表面可明显抑制血浆蛋白和血小板的粘附，并抑制血小板活化，提高材料的血液相容 性。
[0020] (三）、通过控制肝素钠、多巴胺等溶液的浓度以及静电自组装膜的层数，控制生物 大分子在聚酯材料表面单一或混合表达以及生物大分子的负载量，从而调控聚酯材料的亲 水性和血液相容性。
【附图说明】：
[0021] 图la为原始聚酯材料的扫描电镜图片。
[0022] 图lb为壳聚糖/肝素静电自组装5双层且外层为肝素的聚酯材料的扫描电镜图片。
[0023] 图lc为壳聚糖/肝素静电自组装10双层且外层为肝素的聚酯材料的扫描电镜图 片。
[0024]图Id为多巴胺/肝素静电自组装5双层且外层为肝素的聚酯材料的扫描电镜图片。 [0025]图le为多巴胺/肝素静电自组装10双层且外层为肝素的聚酯材料的扫描电镜图 片。
[0026]图2a为原始聚酯材料黏附血小板的扫描电镜图片。
[0027] 图2b为壳聚糖/肝素静电自组装5双层且外层为肝素的聚酯材料黏附血小板的扫 描电镜图片。
[0028] 图2c为壳聚糖/肝素静电自组装10双层且外层为肝素的聚酯材料黏附血小板的扫 描电镜图片。
[0029]图2d为实施例1制备的多巴胺/肝素静电自组装5双层且外层为肝素的聚酯材料黏 附血小板的扫描电镜图片。
[0030] 图2e为实施例2制备的多巴胺/肝素静电自组装5双层且外层为肝素的聚酯材料黏 附血小板的扫描电镜图片。
[0031] 图2f为多巴胺/肝素静电自组装10双层且外层为肝素的聚酯材料黏附血小板的扫 描电镜图片。
【具体实施方式】
[0032]为了使申请的发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合【具体实施方式】 对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施 例。
[0033] 本发明实施例中采用的技术及表征手段包括聚酯材料表面静电自组装多层复合 膜，静态水接触角表征材料的亲水性，zeta电位表征材料表面的电负性，甲苯胺蓝法表征材 料表面的肝素含量，扫描电镜观察材料的表面形貌的变化及血小板在材料表面的黏附情 况，通过血小板最大聚集率、低渗休克相对变化率、CD62p表达率来评价材料对血小板功能 的影响。
[0034] 实施例1:抗血小板黏附且不影响血小板功能的聚酯材料的制备方法：
[0035] S1.将聚酯材料浸泡于3mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中1小时，对材料进行氨基化处 理；
[0036] S2.将聚酯材料浸泡于多巴胺溶液(PBS配制，pH=7.4,浓度2mg/mL)中，加入双氧 水(wt5%-15%)，恒温振荡12小时，使多巴胺自聚合于聚酯材料表面形成聚多巴胺涂层； [0037] S3.将S1得到的氨基化聚酯材料或S2得到的多巴胺涂层的聚酯材料浸泡于肝素钠 溶液中（醋酸盐缓冲液配制，pH=4.0,浓度lmg/mL)，恒温振荡15min，使肝素通过静电作用 负载于材料表面，然后用pH=4.0的醋酸盐缓冲液漂洗2-4次；
[0038] S4.将S3得到的表面自组装聚阴电解质的聚酯材料浸泡于壳聚糖(醋酸盐缓冲液 配制，pH=4.0，浓度2mg/mL)溶液中恒温振荡30min;或多巴胺(PBS配制，pH = 7.4，浓度2mg/ mL)溶液中，再加入wt 10 %双氧水，恒温振荡120min，使壳聚糖或多巴胺通过静电作用负载 于材料表面，然后分别用pH=4.0的醋酸盐缓冲液或pH=7.4的PBS漂洗2-4次；
[0039] S5.完成S4步骤后，5次或10次循环重复步骤S3和S4(即将S4处理后的聚酯材料按 步骤S3和S4分别浸泡于肝素钠溶液和壳聚糖或多巴胺溶液中），即得到5双层(双层是指其 中一层聚阴离子，一层聚阳离子)或10双层表面负载生物大分子肝素、壳聚糖或多巴胺的抗 血小板黏附的聚酯材料。
[0040]实施例2:改变反应条件通过层层静电自组装构建亲水的聚酯材料 [0041 ] S1.将聚酯材料浸泡于多巴胺溶液(PBS配制，pH=7.4,浓度lmg/mL)中，加入双氧 水(wt5%-15%)，恒温振荡6小时，使多巴胺自聚合于聚酯材料表面形成聚多巴胺涂层； [0042] S2.将S1得到的多巴胺涂层的聚酯材料浸泡于肝素钠溶液中（醋酸盐缓冲液配制， pH=4.0,浓度lmg/mL)，恒温振荡15min，使肝素通过静电作用负载于材料表面，然后用pH= 4.0的醋酸盐缓冲液漂洗2-4次；
[0043] S3.将S2得到的表面自组装聚阴电解质的聚酯材料浸泡于多巴胺(PBS配制，pH = 7.4，浓度2mg/mL)溶液中，恒温振荡30min，然后用pH=7.4的PBS漂洗2-4次；
[0044] S4.完成S3步骤后，多次循环重复步骤S2和S3(即将S3处理后的聚酯材料按步骤S2 和S1分别浸泡于肝素钠溶液和多巴胺溶液中），即得到双层表面表面负载生物大分子肝素 的聚酯材料。
[0045] 实施例3:通过组装层数调控聚酯材料的亲水性及表面肝素含量
[0046] 按照实施例1和实施例2的方法制备层层静电自组装的聚酯材料，通过静态水接触 角表征不同层数以及不同聚电解质组装的聚酯材料的亲水性。采用甲苯胺蓝法检测材料表 面的肝素含量，具体方法如下：
[0047] S1绘制标准曲线
[0048] 配制 10，20，30，40，50，60，70，80yg/mL的肝素标准溶液，准确移取0.25mL0.005 % 的甲苯胺蓝溶液（用含0.2 %NaCl的0.01 mo 1HC1溶液配制）到8支干净的试管中，再加入 0. lmL不同浓度的肝素标准溶液，再加入lmLO. 2 %NaCl溶液，立即漩涡剧烈震荡后，立即加 入0.5mL正己烷，并立即漩涡震荡，静置后，移取中下层水溶液进行比色，以0.2%NaCl为空 白对照，在630nm读出0D值。以0D值为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线。
[0049] S2材料表面肝素含量检测
[0050] 将2 X 2cm大小不同层数的静电自组装聚酯材料剪成0.2 X 0.5cm长条状，放入试管 中，再加入0.2 % NaCl lmL，漩涡震荡后静置30min后，加入0.5mL正己烧，漩涡震荡后静置，取 中下层水溶液于630nm读出0D值。
[0051] S3材料表面肝素含量计算
[0052]将样品0D值代入标准曲线，得到样品的肝素浓度，再除以聚酯材料的表面积，即得 到单位面积聚酯材料的肝素含量。
[0053]结果如表1所示，随着组装层数的增加，聚酯材料的静态水接触角下降，亲水性增 加，表面肝素含量增加，多巴胺/肝素组装的聚酯材料的亲水性稍好于壳聚糖/肝素钠组装 的聚酯材料。
[0054]表1不同层数的静电自组装PBT膜的亲水性表征结果
[0056]注:PBT-C-H-5:5双层壳聚糖/肝素钠静电自组装表面为肝素的的PBT膜，PBT-C-H-10:10双层壳聚糖/肝素钠静电自组装表面为肝素的的PBT膜，PBT-D-H-5:5双层多巴胺/肝 素钠静电自组装表面为肝素的的PBT膜，PBT-D-H-10:10双层多巴胺/肝素钠静电自组装表 面为肝素的的PBT膜
[0057]以上均为实施例1得到的改性PBT膜
[0058] PBT-D-H-5A:实施例2得到的5双层多巴胺/肝素钠静电自组装表面为肝素的的PBT 膜。
[0059 ]实施例4:通过组装最外层物质调控聚酯材料的表面电负性
[0060] 按照实施例1的方法制备层层静电自组装的聚酯材料，通过测定zeta电位表征外 层分别为壳聚糖、肝素及多巴胺的静电自组装聚酯材料。
[0061] 结果如表2所示，未改性PBT膜表面的正电荷稍多于负电荷，而表面为壳聚糖和多 巴胺的静电自组装聚酯材料表面均是正电荷明显多于负电荷，表面为肝素的静电自组装聚 酯材料则正好相反。这也说明通过静电自组装生物大分子已成功负载到了聚酯材料表面。 [0062]表2表面静电自组装PBT膜的zeta电位结果
[0063]
[0064]注:PBT-H-C-5,5双层壳聚糖/肝素钠静电自组装表面为壳聚糖的PBT膜，PBT-H-D-5,5双层多巴胺/肝素钠静电自组装表面为多巴胺的PBT膜
[0065] 实施例5:不同组装层数的聚酯材料的表面形貌
[0066] 按照实施例1的方法制备层层静电自组装的聚酯材料，采用扫描电镜对不同组装 层数的聚酯材料的表面形貌进行观察。
[0067]结果如图2所示，原始的PBT平板膜表面十分平整光滑，壳聚糖/肝素静电自组装的 PBT膜表面随着膜层数的增加，膜表面不均匀性减轻，颗粒发生聚集，表面覆盖率增加，表面 颗粒形状几乎无法辨认，获得了平坦的均匀涂层。表面覆盖率逐渐增加也是膜内空隙逐渐 减少的过程。而多巴胺/肝素的静电自组装膜表面由于有很多纳米颗粒聚集导致表面粗糙 度明显增加，同样随着膜层数的增加，表面颗粒的均匀性增加。表面形貌的改变也间接证明 了不同官能团成功接枝到了 PBT膜表面。
[0068] 实施例6:不同反应条件及组装层数的聚酯材料对血小板的黏附
[0069] S1.富血小板血浆(PRP)的制备
[0070] 取血液中心制备的新鲜全血200mL(由德阳中心血站提供），采用800g离心力离心 20min，取上层即为富血小板血衆。
[0071] S2.接触材料的血小板浸提液的制备
[0072] 按GBT16886.12-2000《医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品》，聚 酯材料与PRP的比例为6cm2/mL，将材料剪成1.5 X 1.5cm2片和1.5 X 1 cml片，共12cm2，放入12 孔板中，再加入2mLPRP，放入37°C恒温摇床中振荡1小时。将1.5 X lcm大小的材料取出，进行 扫描电镜样品制备。
[0073] S3扫描电镜样品制备
[0074] 将1.5 X lcm大小的材料取出，放入另一个12孔板中，再加入0.25 %戊二醛(PBS配 制，pH = 7 · 4)，室温放置2小时固定。再依次采用25%，50%，70 %，75%，90%，100%的乙醇 梯度脱水，自然干燥后再进行喷金上样。
[0075] 结果如图3所示。未改性的PBT膜表面黏附的血小板较多，血小板呈不规则状铺展， 且可以观察到明显的伪足，这表明血小板在PBT表面上被激活。通过层层静电自组装负载生 物大分子肝素后，PBT材料表面的血小板黏附数量明显减少。改变多巴胺反应条件后，同样 为5双层自组装外层为肝素的PBT膜，实施例1得到的膜黏附的血小板明显少于实施例2得到 PBT膜，说明通过改变反应条件可以调节膜对血小板的黏附。
[0076] 实施例7:不同反应条件及组装层数的聚酯材料对血小板功能的影响
[0077] 富血小板血浆的制备和接触材料的血小板浸提液的制备同实施例5的S1和S2。将 S2PRP中的材料取出后，剩下的PRP分别进行血小板低渗休克相对变化率、血小板最大聚集 率以及⑶62p表达率的检测。
[0078] 结果如表3所示。
[0079] 表3层层静电自组装的PBT膜对血小板功能的影响
[0080]
[0081 ]结果显示，相对于对照组(未接触材料的血小板），未改性的PBT膜对血小板功能有 一定影响，具体表现为血小板低渗休克相对变化率下降，血小板最大聚集率降低，CD62p表 达率增加。通过层层静电自组装是聚酯材料表面负载生物大分子肝素后，血小板功能有所 改善，随着组装层数的增加，当组装层数为10层时，血小板功能相对5层有明显改善，其中， 血小板低渗休克和血小板最大聚集率基本恢复到与对照组同一水平。但多巴胺反应条件改 变后，对血小板功能的影响也有所变化，同样为5层组装外层为肝素的PBT膜，实施例1得到 的TOT膜对血小板功能的影响明显小于实施例2得到的TOT膜。说明通过控制反应条件和自 组装层数将生物大分子肝素负载到材料表面后，可以调节材料对血小板功能的影响。
[0082]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种抗血小板黏附且不影响血小板功能的聚酯材料的制备方法，其特征在于包括如 下具体步骤： 第一步，将聚酯材料浸泡于聚乙烯亚胺溶液中通过氨解使材料表面带氨基呈正电性； 或将聚酯材料浸泡于多巴胺溶液中通过氧化使聚多巴胺自聚合于材料表面形成带正电的 聚多巴胺涂层； 第二步，将表面呈正电的聚酯材料浸泡于肝素钠溶液中，通过静电相互作用使材料表 面负载呈负电的肝素，再将带负电的材料浸泡于带正电的壳聚糖或多巴胺溶液中，如此反 复浸泡通过层层静电自组装使聚酯材料表面负载生物大分子肝素、壳聚糖或多巴胺;得改 性聚酯材料。2. 根据权利要求1所述抗血小板黏附且不影响血小板功能的聚酯材料的制备方法，其 特征在于该方法包括以下具体步骤：51. 将聚酯材料浸泡于聚乙烯亚胺溶液中进行氨基化处理；或将聚酯材料浸泡于多巴 胺溶液中，加入wt%5%-15%双氧水，恒温振荡12小时，使多巴胺自聚合于聚酯材料表面形成 聚多巴胺涂层；52. 将氨基化或多巴胺涂层的聚酯材料浸泡于肝素钠溶液中，恒温振荡15-30min，使肝 素通过静电作用负载于材料表面，然后用pH=4.0的醋酸盐缓冲液漂洗2-4次；53. 将S2得到的表面自组装聚阴电解质的聚酯材料浸泡于壳聚糖溶液或多巴胺溶液 中，恒温振荡30_120min，使壳聚糖或多巴胺通过静电作用负载于材料表面，然后分别用pH= 4.0的醋酸盐缓冲液或pH=7.4的PBS漂洗2-4次；54. 完成S3步骤后，多次循环重复步骤S2和S3,即将S3处理后的聚酯材料按步骤S2和S3 分别浸泡于肝素钠溶液和壳聚糖或多巴胺溶液中，即得到表面负载生物大分子肝素、壳聚 糖或多巴胺的抗血小板黏附的聚酯材料。3. 根据权利要求1所述抗血小板黏附且不影响血小板功能的聚酯材料的制备方法，其 特征在于:Sl步骤中所述聚乙稀亚胺溶液的PBS配制，pH=7.4，浓度为1-lOmg/mL。4. 根据权利要求1所述抗血小板黏附且不影响血小板功能的聚酯材料的制备方法，其 特征在于:Sl步骤中所述多巴胺溶液的PBS配制，pH=7.4，浓度为I -I O mg/mL。5. 根据权利要求1所述抗血小板黏附且不影响血小板功能的聚酯材料的制备方法，其 特征在于:S2步骤中所述醋酸盐缓冲液配制，pH=4.0，浓度1-lOmg/mL。6. 根据权利要求1所述抗血小板黏附且不影响血小板功能的聚酯材料的制备方法，其 特征在于:S3步骤中所述壳聚糖醋酸盐缓冲液配制，pH=4.0，浓度1-lOmg/mL。7. 根据权利要求1所述抗血小板黏附且不影响血小板功能的聚酯材料的制备方法，其 特征在于:S3步骤中所述多巴胺PBS配制，pH=7.4，浓度1-10 mg/mL。
【文档编号】C08L67/00GK105949492SQ201610318716
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】钟锐, 刘嘉馨, 王红, 贺曾, 韩玎玎, 张学俊
【申请人】中国医学科学院输血研究所