用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片及其制备方法

用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片及其制备方法
【专利摘要】一种用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的纳米结构微流控芯片及其制备方法，属于生物检测技术领域。本发明设计了两种纳米结构，硅纳米线阵列和SiO2及TiO2反蛋白结构的光子晶体，纳米结构具有粗糙的表面形貌，尺寸上能与循环肿瘤细胞表面结构有效接触，对循环肿瘤细胞进行倒置捕获。在芯片的组装过程采用简易的胶水封装，使得芯片的制作过程更加简单易行。此外，结合纳米磁性复合材料的光动力治疗作用，在芯片内实现循环肿瘤细胞的原位治疗，为了进一步实用化，我们设计并在芯片内嵌入光纤，导入激光，方便的实现芯片内循环肿瘤细胞的原位治疗。最后，我们还进一步提出微流控芯片可植入的开放设想。
【专利说明】
用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于循环肿瘤细胞(循环肿瘤细胞是脱离原发肿瘤部位的癌细胞，作为一种癌症监测的标志物)捕获及治疗的纳米结构微流控芯片及其制备方法。
【背景技术】
[0002]癌症作为人类致死的重大疾病，之所以死亡率如此地高以及难以治愈，主要是在于癌症发现晚及扩散。早期诊断和对癌细胞扩散的抑制乃至治疗对改善癌症治疗现状有着重要意义。
[0003]癌症患者血液外周血中循环肿瘤细胞的数量极少，循环肿瘤细胞的数目为I?10个/mL，故从几百万的白细胞和数十亿的红细胞中有效地分选富集并将稀少的循环肿瘤细胞捕获成为一个难题。
[0004]早期应用免疫磁珠富集技术，分离循环肿瘤细胞[1]，然而这种方法的检测灵敏度不足，技术成本高;之后开始利用细胞的物理特性进行分离[2]，例如循环肿瘤细胞相比较血液中的白细胞和红细胞尺寸存在差异，制备一定尺寸的过滤膜，对细胞流体进行过滤，从而分离循环肿瘤细胞，这种方法的特异性不足。2007年通过光刻蚀得到微柱[3]，并结合微流控芯片对循环肿瘤细胞进行捕获，微流控芯片被开始应用于解决循环肿瘤细胞捕获的问题。
[0005]2009年提出应用化学法刻蚀制备了硅纳米线阵列[4]，由于纳米结构增加了与细胞接触的表面积，并且增加了表面粗糙度，与细胞的伪足绒毛等表面结构的尺寸相当，依靠细胞与纳米结构界面之间的接触可以实现对细胞的捕获，化学法刻蚀形成的纳米结构相比较光刻蚀制备的纳米微柱微结构，尺寸上更小，表面形貌更为丰富，制备工艺及成本也更加有优势，成为微流控芯片微结构设计的新形势。
[0006]然而现存方法对循环肿瘤细胞的捕获效率及捕获纯度与临床应用需求仍然存在很大差距，由于抗原抗体的相互反应需要充分接触及反应时间，微流控芯片不能实现快速的检测，而且捕获效率和捕获纯度仍然有限。

【发明内容】

[0007]本发明为了改善目前微流控芯片存在的问题，结合已有的循环肿瘤细胞捕获方法，将化学法制备的纳米结构作为细胞捕获结构，与玻璃片或PDMS基底通过封装胶水组装成简易微流控芯片，进一步利用表面修饰抗体的纳米磁性复合材料首先与循环肿瘤细胞特异性结合，再通过设有外磁场的微流控芯片体系，从细胞悬液或全血中依靠磁力的物理作用进行分离，进一步到达置于上层的纳米结构层，纳米结构具有粗糙的表面形貌，尺寸上能与细胞表面结构有效接触，对细胞进行倒置捕获。本发明设计了两种纳米结构:硅纳米线阵列和S12及T12反蛋白结构的光子晶体;在芯片的组装过程采用简易的胶水封装，使得芯片的制作过程更加简单易行。此外，结合纳米磁性复合材料的光动力治疗作用，在芯片内实现循环肿瘤细胞的原位治疗，为了进一步实用化，我们设计并在芯片内嵌入光纤，导入激光，方便的实现芯片内循环肿瘤细胞的原位治疗。最后，我们还进一步提出微流控芯片可植入的开放设想。
[0008]—种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片及其制备方法，
[0009](I)纳米结构的制备
[0010]硅纳米线阵列的制备:将硅片超声清洗10?30min，再用去离子水冲洗后放入浓硫酸和过氧化氢组成的piranha溶液(食人鱼溶液)中浸泡2?12h，取出的娃片用去离子水冲洗后，放入硝酸银和氢氟酸组成的刻蚀溶液中避光反应I?3h;然后再将刻蚀后的硅片放入体积分数为15?30%的硝酸水溶液中浸洗I?2h，从而在硅片表面得到垂直于硅片表面生长的娃纳米线阵列，娃纳米线的直径为50?10nm，长度5?50μηι，单位面积内纳米线的密度是30?40个Λ?2。
[ΟΟ??] 反蛋白石结构光子晶体的制备:将20mL?30mL MMA(甲基丙稀酸甲酷)用100?200mL、浓度为0.03?0.04mol/L的氢氧化钠水溶液清洗3?4遍，将2?5mL清洗过的MMA和30?50mL的去离子水混合后加热，在80?90°C条件下加入10?20mg的K2S2O8反应60?lOOmin，得到单分散的PMMA纳米球溶液，PMMA纳米球的尺寸为200?600nm;将干净的载玻片垂直插入单分散的PMMA纳米球液体中，在30?40 °C条件下保持20?24h，烘干，再在100?120 °(:条件下烘40?60min (强化结构)，从而在载玻片表面上得到PMMA蛋白石结构;该蛋白石结构为紧密排列的球阵列，厚度为130?900nm(可以为多层球阵列)，球心间距为200?600nm;将S12或T12前驱体溶液(T12前驱体溶液是由化学纯钛酸丁酯8?12mL、无水乙醇8?12mL、质量分数65%?68%硝酸水溶液0.5?2mL混合后配制而成；S12前驱体溶液由质量分数25?30 %的硅酸乙酯3?4mL、无水乙醇8?12mL和质量分数30?40 %的盐酸水溶液0.0I?0.05mL混合后配制而成)逐滴滴到PMMA蛋白石结构表面(其自行慢慢渗入)，然后在450?550°C进行热处理2?4h，在载玻片表面得到380?980nm光子带隙的反蛋白石结构光子晶体，为规则的反蛋白石结构，反蛋白石结构为原PMMA球紧密堆积的蛋白石结构在渗入T12或S12前驱体溶液后，经热处理后PMMA纳米球被去除，剩下围绕球堆积轮廓的T12或S12的结构，反蛋白石结构的孔中心之间的距离为130?420nm。
[0012](2)对所得的纳米结构进行抗体修饰(采用传统的巯基-马来酰亚胺基团硅烷化偶联法):将硅纳米线阵列或反蛋白石结构光子晶体依次放入体积分数为4%的MPTS溶液(3-巯基丙基三甲氧基硅烧MPTS的乙醇溶液)、ΙμΜ的GMBS溶液(N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺GMBS的二甲基亚砜溶液)、1yg/mL链和亲霉素的磷酸缓冲盐溶液(pH = 7.2?7.4)、10yg/mL生物素化的EpCAM抗体(北京博奥森生物技术有限公司，Cat.Number: bs_0593R-b1)的磷酸缓冲盐溶液，反应时间分别为30?60min，从而获得修饰抗体的纳米结构基板；
[0013](3)芯片封装:将步骤(2)制备的修饰抗体的纳米结构基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS(聚二甲基硅氧烷)之间用多层封口膜(美国Parafilm实验室封口膜)进行隔离，使用封口膜形成的芯片高度(即多层封口膜的厚度)为120μπι?Imm;然后用胶水将基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS的较长一侧封装，待胶水完全固化、芯片结构固定后取出封口膜(从而在基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS之间留有空隙)，再用胶带将进样管和出样管分别粘贴在基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS的较短一侧，并用胶水将整个芯片进行封装，从而制备得到一种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片。
[0014]进一步地，步骤(I)中所述的硅片为P型单面抛光硅片，电阻率为5?10 Ω.cm，晶向[100]，厚度为 360 ?400μπι;
[0015]进一步地，步骤(I)中所述的piranha溶液中浓硫酸溶液和双氧水溶液的体积比为3?7:1，浓硫酸溶液和双氧水溶液的质量分数分别为95?98%和20?40%。
[0016]进一步地，步骤(I)中所述的刻蚀溶液中，HF水溶液的浓度为4.4?4.6mo I/L，AgNO3水溶液的浓度为0.0I?0.0 2mo I /L，两者的用量体积比为1:4。
[0017]进一步地，步骤(3)中所述的嵌入光纤的PDMS的制备:将聚二甲基硅氧烷PDMS与固化剂以质量比5:1的比例混合均匀后倒入方形模具，将I?10根光纤嵌入PDMS中，80?90°C固化I?3h;PDMS的厚度为I?5mm，光纤垂直嵌入TOMS中，光纤顶端位于PDMS厚度一半左右的位置。
[0018]进一步地，步骤(3)中所述的单层封口膜的厚度为120?130μπι。
[0019](4)将循环肿瘤细胞与连有抗体的纳米磁性复合材料共同孵育。
[0020]将细胞培养皿中的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化后用细胞培养基(HyCloneRPMIMedium Modified)重悬，得到细胞悬浮液。再加入连有抗体的纳米磁性复合材料共同孵育3h，得到结合了纳米磁性复合材料的循环肿瘤细胞悬浮液，细胞与复合材料的用量比例:在2?3mL培养基中，2 X 14?3 X 14个细胞中加入10yL?200yL的复合材料。在全血中捕获细胞的实验需要将循环肿瘤胞与全血(24h以内新鲜的正常人抗凝血)共同混合后，其中全血被稀释10?20倍后使用，全血与细胞的混合比例为2?4mL稀释后的血液中加入2 X 14?2X 12个细胞，加入连有抗体的纳米磁性复合材料共同孵育，加入材料的比例为在2?3mL稀释后的血液与循环肿瘤细胞的混合液中加入50yL?10yL的连有抗体的纳米磁性复合材料共同孵育3h，循环肿瘤细胞被纳米磁性复合材料特异的连接，其中所涉及的纳米磁性复合材料以及连有抗体的纳米磁性复合材料参考张勇[5，6]课题组及崔大祥课题组[7]的工作制备合成。
[0021]然后以2?12mL/h的流速将结合了纳米磁性复合材料的循环肿瘤细胞悬浮液细胞或结合了纳米磁性复合材料稀释血液与循环肿瘤细胞混合液。通过注射栗及注射器经由进样管注入到上侧置有磁铁的纳米结构微流控芯片中，此时，可以在共聚焦显微镜下实时观测并记录循环肿瘤细胞的捕获情况。捕获实验结束后，为除去芯片中残留的非特异性捕获的细胞，将磷酸缓冲盐溶液(pH = 7.2?7.4)以2?12mL/h的流速通过注射栗及注射器经由进样管注入到该微流控芯片中进行清洗。
[0022]在捕获实验中，捕获率计算通过血球计数板及流式细胞仪给出通入芯片内循环肿瘤细胞的原始数目，再将通入芯片后的细胞悬浮液或血液进行收集，再次统计其中循环肿瘤细胞的数目，即捕获率=“(通入芯片前原始循环肿瘤细胞的数目一通入芯片后收集到细胞的数目)/原始循环肿瘤细胞的数目X 100%”。捕获实验结束后可以进一步在共聚焦显微镜上以用635nm(光敏剂为Ce6)或544nm(光敏剂为MC540)激光对捕获到的循环肿瘤细胞进行原位光动力治疗:635nm或544nm激光下照射I?5min。对于嵌入光纤的芯片，捕获细胞后可以直接通过超连续光源提供645nm、544nm的激光，经光纤在芯片内实现被捕获循环肿瘤细胞的光动力治疗:635nm或544nm激光下照射I?5min。其中，光动力治疗的效果通过辐照后细胞染色来观察，用5?1yL染料AO及5?1yL染料EB加入500?100yL磷酸缓冲盐溶液中并注入芯片中，染色5?1min后在共聚焦显微镜下观察。染料AO对染活细胞，呈现绿色；染料EB只染凋亡细胞，呈现红色。
【附图说明】
[0023]图1:为捕获循环细胞的硅纳米线阵列结合载玻片的微流控芯片的结构示意图；
[0024]各部件名称为:放置在芯片上表面的磁铁I，用于形成外磁场;表面修饰抗体的硅纳米线阵列12，载玻片基底13，进样管4，出样管5;
[0025]图2:为捕获循环肿瘤细胞的反蛋白石结构结合载玻片的微流控芯片的结构示意图；
[0026]各部件的名称为:放置在芯片上表面的磁铁I，用于形成外磁场;表面修饰抗体的反蛋白石结构22，载玻片基底23，进样管4，出样管5。
[0027]图3:为捕获及治疗循环肿瘤细胞的硅纳米线阵列结合嵌入光纤的PDMS的微流控芯片的结构示意图；
[0028]各部件名称为:放置在芯片上表面的磁铁I，用于形成外磁场;表面修饰抗体的硅纳米线阵列32，嵌入光纤的PDMS基底33，进样管4，出样管5，光纤6;
[0029]图4:为实施例1制备的硅纳米线阵列扫描电镜照片，从图中可以看到规则的硅纳米线阵列垂直生长在硅片表面，其中插图为硅线的截面图，可以看到硅纳米线阵列沿着硅片表面纵向生成，均匀分布。硅纳米线的直径在10nm左右，硅线长度为5μπι左右，单位面积内纳米线的密度是34个Λ?2。
[0030]图5:为实施例2制备的反蛋白石结构光子晶体扫描电镜照片，为规则的反蛋白石结构，中心为空心状，而周围完整的维持住球堆积轮廓。反蛋白石结构的孔中心之间的距离为420nm。
[0031]图6:为实施例1制备的硅纳米线阵列微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的扫描电镜照片;可以看到循环肿瘤细胞的伪足与硅线纳米阵列紧密结合。
[0032]图7:为实施例2制备的反蛋白石结构微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的共聚焦显微镜成像照片;可以看到循环肿瘤细胞(图片中灰色的斑点)被大量地捕获。
[0033]图8:为实施例1在芯片内对被捕获的循环肿瘤细胞进行原位治疗，可以在芯片内实现原位治疗。即在共聚焦显微镜下用635nm激光以20倍镜进行辐照，辐照lmin，之后用10μL AO及1yLEB染料加入500yL磷酸缓冲盐溶液中并注入芯片中，染色5min后以10倍镜进行成像，中间有一个明显的区别圆圈(白色圆圈内部区域)，即为激光辐照产生治疗的部分，细胞发生凋亡与周围未被照射的细胞形成对比。
[0034]图9:为实施实例3通过嵌入光纤微流控芯片在芯片内对被捕获的循环肿瘤细胞进行原位治疗。即在由超连续光源提供635nm激光通过光纤进行辐照，辐照lmin，之后用1yLAO及1yL EB染料加入500yL磷酸缓冲盐溶液中并注入芯片中，染色5min后在共聚焦显微镜下观察，观察光纤辐照区域(a)的细胞发生凋亡，染色呈现红色(由EB染色)；而未经过辐照部分细胞未发生凋亡(b)，呈现绿色(由染料AO染色)ο图片经过灰化处理。
【具体实施方式】
[0035]下面结合附图及实例对本发明作进一步描述:
[0036]实施例1:基于硅纳米线阵列结构的微流控芯片的制备及实验[0037 ]表面修饰抗体的娃纳米线阵列的制备
[0038]清洗:将硅片切为4cmX2cm大小的矩形形状，硅片为P型单面抛光硅片，晶向[100]，电阻率5?10Ω.cm，厚度380±15μπι，放入烧杯中，依次用去离子水、丙酮、乙醇在超声清洗仪中分别清洗1min，取出用去离子水冲洗，放入piranha洗液中浸泡24h !piranha洗液由30mL质量分数98 %的浓硫酸和1mL质量分数为30 %的双氧水混合而成。
[0039]刻蚀:将清洗后的硅片放入装有刻蚀溶液的聚四氟乙烯烧杯中，刻蚀溶液为6mL浓度为4.6mol/L的HF溶液和24mL浓度为0.0lmol/L的AgNO3溶液(以上溶液均为水溶液)混合，避光反应lh，然后放置于20mL质量分数15%的硝酸中浸洗lh。刻蚀得到规则的硅纳米线阵列，如附图3所示，娃纳米线阵列垂直于娃表面，娃线的直径在?10nm，长度?5μηι。
[0040]修饰:硅纳米线阵列依次放入体积分数为4%的MPTS溶液(3-巯基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液)、ΙμΜ的GMBS溶液(Ν-(4_马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺的DMSO溶液)、10μg/mL链和亲霉素的磷酸缓冲盐溶液(pH= 7.2?7.4)、10yg/mL生物素化的EpCAM抗体的磷酸缓冲盐溶液，依次在室温下反应lh，获得修饰抗体的纳米结构的基板。
[0041]芯片封装:首先将上述制备的基板和载玻片之间用封口膜进行隔离，单层的封口膜的厚度为127μπι，使用单层封口膜形成127μπι芯片高度;然后用胶水在基板和载玻片的长边两侧固定结构，待胶水完全固化，取出封口膜，用胶带将进样管和出样管分别粘贴在未封装的短边两侧，并用胶水将整个芯片进行封装，形成如附图1所示结构的纳米结构微流控芯片。
[0042]接下来进行细胞捕获实验:将细胞培养皿中的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化后用细胞培养基重悬，与纳米磁性复合材料共同孵育3h。其中纳米磁性复合材料参考张勇课题组及崔大祥课题组的工作制备合成:首先合成纳米磁性材料Fe304，取1.62g FeCl3.6H20和0.58g FeCl2.4H20混合在1mL去离子水中，并加入质量分数为28%的氨水调节体系pH=9，在氮气保护下搅拌30min，经过磁铁分离得到纳米磁性材料FesO^0.1mL C0_520(非离子表面活性剂)、6mL环己烧、4mL 2mg/mL的Fe304的环己烧溶液，搅拌1miη，加入0.4mL C0-520、0.08mL质量分数为30 %的氨水，超声30min，之后加入0.04mL正娃酸乙酯，充分混合搅拌24h，加入丙酮得到二氧化硅包覆的Fe304。取1mg 二氧化硅包覆的Fe3O4分散在乙醇和去离子水的混合液体中(乙醇15mL，去离子水3mL)，加入300yL氨水，30yL 2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]-三甲氧基硅烷，搅拌24h，通过磁铁吸引，除去上层清液，进一步分散到6mL二甲基亚砜中，5yL APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)以及l.lmg NHS(N_羟基丁二酰亚胺)和1.6mgH)S(碳化二亚胺)，混合搅拌12h，经过磁铁分离后用二甲基亚砜和乙醇清洗三次。进一步取5mg经过修饰的Fe304与Img Ce6在ImL二甲基亚砜中混合，在室温下混合超声30min，并搅拌12h，得到纳米磁性复合材料。
[0043]将细胞培养皿中MCF-7细胞(乳腺癌细胞)加入ImL胰蛋白酶进行消化，再用磷酸缓冲盐溶液(pH = 7.2?7.4)稀释成I X 104cell/mL的细胞悬浮液，加入纳米磁性复合材料共同孵育3h，材料的用量为10yL纳米磁性复合材料加入到2mL细胞悬液中，细胞悬液浓度为IX 104。取ImL加入到注射器中，将注射器与芯片的进样口相连，在芯片上表面放置磁铁，通过注射栗，以4mL/h注入到芯片中，另一端出样管端进行收集。此时，可以在共聚焦显微镜下实时观测并记录细胞捕获情况。
[0044]将捕获细胞的芯片进行处理:
[0045]固定:取出硅片放入细胞培养皿中，加入2mL的I3BS缓冲液，置于水平摇床上，60rpm洗1min，重复两次。之后用移液枪将I3BS缓冲液吸出，加入2mL、质量分数2.5 %戊二醛固定液，60rpm室温固定2h。
[0046]脱水:固定结束后，用2mLPBS缓冲液洗去剩余的固定液，吸净细胞培养皿内液体。然后按以下顺序进行脱水步骤:质量分数30%乙醇，60rpm，1min，重复两次;质量分数50%乙醇，60rpm，1min，重复两次;质量分数75%乙醇，60rpm，1min，重复两次；质量分数80%乙醇;60rpm, 1min，重复两次;质量分数95%乙醇，60rpm, 1min，重复两次;质量分数100%乙醇，60rpm，1min，重复两次。
[0047]干燥:照射扫描电镜之前，用移液枪吸净平皿内质量分数100%乙醇，室温干燥2h。进行扫描电镜测试，可以得到附图5，结合附图5，被捕获的细胞被固定后照射扫面电镜，可以看到细胞紧密的结合在硅纳米线上。
[0048]在微流控芯片中被捕获的循环肿瘤细胞，可以在芯片内实现原位治疗将细胞。即在共聚焦显微镜下用635nm激光以20倍镜进行辐照，辐照lmin，之后用1yLAO及1yL EB染料加入500yL磷酸缓冲盐溶液中并注入芯片中，染色5min，可以明显看到光动力治疗效果。以10倍镜进行成像，如附图7所示看到中间有一个明显的区别圆圈(白色圆圈内部区域)，即为激光辐照产生治疗的部分，细胞发生凋亡与周围未被照射的细胞形成对比。
[0049]实施例2:基于T12反蛋白石结构的微流控芯片的制备及实验方法
[0050]反蛋白石结构光子晶体的制备:首先合成PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)纳米球溶液，PMMA纳米球的尺寸为340nm;取30mL MMA(甲基丙烯酸甲酯)与200mL氢氧化钠溶液(浓度为0.037mol/L)，清洗3?4遍;将2?5mL清洗过的MMA和40mL的去离子水混合后加热，在90°C条件下加入18mg的K2S2O8反应90min，得到单分散的PMMA纳米球溶液。
[0051]用清水洗或用酒精洗，然后再用擦镜纸将载玻片擦干净，垂直插入单分散的PMMA纳米球液体中，置于烘箱中320C烘干24h，再进一步120°C烘干40min，得到PMMA蛋白石结构，将制备好T12前驱体溶液(钛酸丁酯1mL、无水乙醇1mL、质量分数66 %的硝酸ImL混合后配制而成)，滴到PMMA蛋白石模板上，对样品进行热处理500°C处理3h，得到980nm光子带隙的反蛋白石结构的光子晶体，反蛋白石结构的孔中心之间的距离为420nm，如附图4所示。
[0052]修饰:硅纳米线阵列依次放入体积分数为4%的MPTS溶液(3-巯基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液)、ΙμΜ的GMBS溶液(N-(4_马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺的DMSO溶液)、10μg/mL链和亲霉素的磷酸缓冲盐(ρΗ=7.2?7.4)溶液、10yg/mL生物素化的EpCAM抗体的磷酸缓冲盐溶液的溶液，依次在室温下反应lh，获得修饰抗体的纳米结构的基板。
[0053]芯片封装:首先将上述制备的基板和载玻片之间用封口膜进行隔离，单层的封口膜的厚度为127μπι，使用单层封口膜形成127μπι芯片高度;然后用胶水在基板和载玻片的长边两侧固定结构，待胶水完全固化，取出封口膜，用胶带将进样管和出样管分别粘贴在未封装的短边两侧，并用胶水将整个芯片进行封装，形成如附图2所示结构的纳米结构微流控芯片。
[0054]接下来进行细胞捕获实验:将细胞培养皿中的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化后用细胞培养基重悬，与纳米磁性复合材料共同孵育3h。其中纳米磁性复合材料参考张勇课题组及崔大祥课题组的工作制备合成:首先合成纳米磁性材料Fe304，取1.62g FeCl3.6H20和
0.58g FeCl2.4H20混合在1mL去离子水中，并加入质量分数为28%的氨水调节体系pH=9，在氮气保护下搅拌30min，经过磁铁分离得到纳米磁性材料FesO^0.1mL C0_520(非离子表面活性剂)、6mL环己烧、4mL 2mg/mL的Fe304的环己烧溶液，搅拌1miη，加入0.4mL C0-520、0.08mL质量分数为30 %的氨水，超声30min，之后加入0.04mL正娃酸乙酯，充分混合搅拌24h，加入丙酮得到二氧化硅包覆的Fe304。取1mg 二氧化硅包覆的Fe3O4分散在乙醇和去离子水的混合液体中(乙醇15mL，去离子水3mL)，加入300yL氨水，30yL 2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]-三甲氧基硅烷，搅拌24h，通过磁铁吸引，除去上层清液，进一步分散到6mL二甲基亚砜中，5yL APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)以及l.lmg NHS(N_羟基丁二酰亚胺)和1.6mgH)S(碳化二亚胺)，混合搅拌12h，经过磁铁分离后用二甲基亚砜和乙醇清洗三次。进一步取5mg经过修饰的Fe304与Img Ce6在ImL二甲基亚砜中混合，在室温下混合超声30min，并搅拌12h，得到纳米磁性复合材料。
[0055]将细胞培养皿中MCF-7细胞(乳腺癌细胞)加入ImL胰蛋白酶进行消化，再用磷酸缓冲盐溶液稀释成I X 14CelΙ/mL的细胞悬浮液，加入纳米磁性复合材料共同孵育3h，材料的用量为10yL纳米磁性复合材料加入到2mL细胞悬液中，细胞悬液浓度为I X 104。取ImL加入到注射器中，将注射器与芯片的进样口相连，在芯片上表面放置磁铁，通过注射栗，以4mL/h注入到芯片中，另一端出样管端进行收集。此时，可以在共聚焦显微镜下实时观测并记录细胞捕获情况。实时拍摄的捕获照片如附图6所示。结合附图6可以看到有这种反蛋白石的结构具有捕获细胞的能力。
[0056]实施例3:基于硅纳米线阵列结构结合嵌入光纤的微流控芯片的制备及实验
[0057]清洗:将硅片切为4cmX 2cm大小的矩形形状，硅片为P型单面抛光硅片，晶向[100]，电阻率5?10Ω.Cm，厚度380±15μπι，放入烧杯中，依次用去离子水、丙酮、乙醇在超声清洗仪中分别清洗1min，取出用去离子水冲洗，放入piranha洗液中浸泡24h !piranha洗液由30mL质量分数98 %的浓硫酸和1mL质量分数为30 %的双氧水混合而成。
[0058]刻蚀:将清洗后的硅片放入装有刻蚀溶液的聚四氟乙烯烧杯中，刻蚀溶液为6mL、浓度为4.6mol/L的HF溶液和24mL、浓度为0.0lmol/L的AgNO3溶液(以上溶液均为水溶液)混合，避光反应lh，然后放置于20mL体积分数15%的硝酸中浸洗lh。刻蚀得到规则的硅纳米线阵列，如附图3所示，硅纳米线阵列垂直于硅表面，硅线的直径在?lOOnm，长度?5μπι。
[0059]修饰:硅纳米线阵列依次放入体积分数为4%的MPTS溶液(3-巯基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液)、ΙμΜ的GMBS溶液(Ν-(4_马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酸亚胺的DMSO溶液)、10μg/mL链和亲霉素的磷酸缓冲盐溶液(pH= 7.2?7.4)、10yg/mL生物素化的EpCAM抗体的磷酸缓冲盐溶液，依次在室温下反应lh，获得修饰抗体的纳米结构的基板。
[0060]嵌入光纤的PDMS的制备:将聚二甲基硅氧烷与固化剂以质量比5:1混合均匀后倒入方形模具，将4根光纤垂直嵌入PDMS，80 °C固化Ih IDMS的厚度2mm，光纤嵌入一半的厚度。[0061 ]芯片封装:首先将上述制备的基板和嵌入光纤PDMS用封口膜进行隔离，单层的封口膜的厚度为127μπι，使用单层封口膜形成127μπι芯片高度;然后用胶水在基板和载玻片的长边两侧固定结构，待胶水完全固化，取出封口膜，用胶带将进样管和出样管分别粘贴在未封装的短边两侧，并用胶水将整个芯片进行封装，形成如附图1所示结构的纳米结构微流控芯片。
[0062]接下来进行细胞捕获实验:将细胞培养皿中的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化后用细胞培养基重悬，与纳米磁性复合材料共同孵育3h。其中纳米磁性复合材料参考张勇课题组及崔大祥课题组的工作制备合成:首先合成纳米磁性材料Fe304，取1.62g FeCl3.6H20和
0.58g FeCl2.4H20混合在1mL去离子水中，并加入质量分数为28%的氨水调节体系pH=9，在氮气保护下搅拌30min，经过磁铁分离得到纳米磁性材料FesO^0.1mL C0_520(非离子表面活性剂)、6mL环己烧、4mL 2mg/mL的Fe304的环己烧溶液，搅拌1miη，加入0.4mL C0-520、0.08mL质量分数为30 %的氨水，超声30min，之后加入0.04mL正娃酸乙酯，充分混合搅拌24h，加入丙酮得到二氧化硅包覆的Fe304。取1mg 二氧化硅包覆的Fe3O4分散在乙醇和去离子水的混合液体中(乙醇15mL，去离子水3mL)，加入300yL氨水，30yL 2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]-三甲氧基硅烷，搅拌24h，通过磁铁吸引，除去上层清液，进一步分散到6mL二甲基亚砜中，5yL APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)以及l.lmg NHS(N_羟基丁二酰亚胺)和1.6mgH)S(碳化二亚胺)，混合搅拌12h，经过磁铁分离后用二甲基亚砜和乙醇清洗三次。进一步取5mg经过修饰的Fe304与Img Ce6在ImL二甲基亚砜中混合，在室温下混合超声30min，并搅拌12h，得到纳米磁性复合材料。
[0063]将细胞培养皿中MCF-7细胞(乳腺癌细胞)加入ImL胰蛋白酶进行消化，再用磷酸缓冲盐溶液(pH = 7.2?7.4)稀释成I X 104cell/mL的细胞悬浮液，加入纳米磁性复合材料共同孵育3h，材料的用量为10yL纳米磁性复合材料加入到2mL细胞悬液中，细胞悬液浓度为IX 104。取ImL加入到注射器中，将注射器与芯片的进样口相连，在芯片上表面放置磁铁，通过注射栗，以4mL/h注入到芯片中，另一端出样管端进行收集。此时，可以在共聚焦显微镜下实时观测并记录细胞捕获情况。
[0064]嵌入光纤微流控芯片在芯片内对被捕获的循环肿瘤细胞进行原位治疗。即由超连续光源提供635nm激光，通过光纤对芯片内被捕获样品进行辐照，辐照lmin，之后用1yL AO及1yL EB染料加入500yL磷酸缓冲盐溶液中并注入芯片中，染色5min后在共聚焦显微镜下观察，观察光纤辐照区域的细胞发生凋亡附图9(a)，染色呈现红色(由EB染色)；而未经过辐照部分细胞未发生凋亡附图9(b)，呈现绿色(由染料AO染色)。图片经过灰化处理。
[0065]本文引用的所有文献通过整体引用并入本文。为方便起见，以下列出本文引用的参考文献:
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【主权项】
1.一种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片的制备方法，其步骤如下: (1)纳米结构的制备 硅纳米线阵列的制备:将硅片超声清洗10?30min，再用去离子水冲洗后放入浓硫酸和过氧化氢组成的P iranha溶液中浸泡2?12h，取出的娃片用去离子水冲洗后，放入硝酸银和氢氟酸组成的刻蚀溶液中避光反应I?3 h;然后再将刻蚀后的硅片放入体积分数为15?30%的硝酸水溶液中浸洗I?2h，从而在硅片表面得到垂直于硅片表面生长的硅纳米线阵列，娃纳米线的直径为50?10nm，长度5?50μηι，单位面积内纳米线的密度是30?40个/μm2； 反蛋白石结构光子晶体的制备:将20?30ml MMA用100?200ml、浓度为0.03?0.04mol/L的氢氧化钠水溶液清洗3?4遍，将2?5ml清洗过的MMA和30?50ml去离子水混合后加热，在80?90 °C条件下加入10?20mg的K2S2O8反应60?lOOmin，得到单分散的PMMA纳米球溶液，PMMA纳米球的尺寸为200?600nm;将干净的载玻片垂直插入单分散的PMMA纳米球液体中，在30?40°C条件下保持20?24h，烘干，再在100?120°C条件下烘40?60min，从而在载玻片表面上得到PMMA蛋白石结构；该蛋白石结构为紧密排列的球阵列，厚度为130?900nm，球心间距为200?600nm;将S12或T12前驱体溶液逐滴滴到PMMA蛋白石结构表面，然后在450?550 °C进行热处理2?4h，在载玻片表面得到380?980nm光子带隙的反蛋白石结构光子晶体，为规则的反蛋白石结构，反蛋白石结构为原PMMA球紧密堆积的蛋白石结构在渗入T12或S12前驱体溶液后，经热处理后PMMA纳米球被去除，剩下围绕球堆积轮廓的T12或S12的结构，反蛋白石结构的孔中心之间的距离为130?420nm; (2)对所得的纳米结构进行抗体修饰:将硅纳米线阵列或反蛋白石结构光子晶体依次放入体积分数为4%的MPTS溶液、ΙμΜ的GMBS溶液、10yg/mL链和亲霉素的磷酸缓冲盐溶液、10yg/mL生物素化的EpCAM抗体的磷酸缓冲盐溶液，反应时间分别为30?60min，从而获得修饰抗体的纳米结构基板； (3)芯片封装:将步骤(2)制备的修饰抗体的纳米结构基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS之间用多层封口膜进行隔离，使用封口膜形成的芯片高度为120μπι?Imm;然后用胶水将基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS的较长边一侧封装，待胶水完全固化、芯片结构固定后取出封口膜，再用胶带将进样管和出样管分别粘贴在基板和载玻片或嵌入光纤的PDMS的较短边一侧，并用胶水将整个芯片进行封装，从而制备得到用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片。2.如权利要求一种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片的制备方法，其特征在于:步骤(I)中所述的硅片为P型单面抛光硅片，电阻率为5?10 Ω.cm，晶向[100]，厚度为360 ?400μπι。3.如权利要求一种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片的制备方法，其特征在于:步骤(I)中所述的piranha溶液中浓硫酸溶液和双氧水溶液的体积比为3?7: I，浓硫酸溶液和双氧水溶液的质量分数分别为95?98%和20?40%。4.如权利要求一种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片的制备方法，其特征在于:步骤(I)中所述的刻蚀溶液中，HF水溶液的浓度为4.4?4.6mol/L，AgN03水溶液的浓度为0.01?0.0211101/1，两者的用量体积比为1:4。5.如权利要求一种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片的制备方法，其特征在于:步骤(I)中T12前驱体溶液是由化学纯钛酸丁酯8?12mL、无水乙醇8?12mL、质量分数65%?68%硝酸水溶液0.5?2mL混合后配制而成;S12前驱体溶液由质量分数25?30%的硅酸乙酯3?4mL、无水乙醇8?12mL和质量分数30?40%的盐酸水溶液0.01?0.05mL混合后配制而成。6.如权利要求一种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片的制备方法，其特征在于:步骤(3)中所述的嵌入光纤的TOMS的制备是将聚二甲基硅氧烷PDMS与固化剂以质量比5:1的比例混合均匀后倒入方形模具，将I?10根光纤嵌入TOMS中，80?90°C固化I?3h ；PDMS的厚度为I?5mm，光纤垂直嵌入PDMS中，光纤顶端位于PDMS厚度一半左右的位置。7.如权利要求一种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片的制备方法，其特征在于:步骤(3)中所述的单层封口膜的厚度为120?130μπι。8.—种用于循环肿瘤细胞捕获的纳米结构微流控芯片，其特征在于:是由权利要求1?7任何一项方法制备得到。
【文档编号】C12M1/42GK105950436SQ201610247371
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】董彪, 许红威, 徐诗函, 宋宏伟, 白雪, 徐琳, 孙雪珂
【申请人】吉林大学