枯草芽孢杆菌se201412及富有机硒菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)SE201412，其保藏编号为CCTCC No.M 2015708，该菌株十分耐硒，能在含硒培养基中发酵产生有机硒含量达5000mg/L?12000mg/L的发酵液，将该发酵液制备成富有机硒菌剂施用于处于生长期作物的液面，能够生产富硒农产品，且生产得到的农产品能够达到富有机硒粮、油、水果、蔬菜、干果的质量标准，且能够提高农产品的品质，产量，增强农作物抗病能力。CCTCC NO：M201570820151126
【专利说明】
枯草芽孢杆菌SE201412及富有机砸菌剂
技术领域
[00011本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及枯草芽孢杆菌SE201412及富有机硒菌剂。
【背景技术】
[0002] 硒是人类和动物必须的微量元素，缺硒可引40多种起多种疾病，目前研究表明，每 天每人满足50微克硒，可使人健康长寿，而且通过食品补有机硒被认为是最安全，最方便的 手段。
[0003] 全世界75 %的国家和地区缺硒少硒，我国缺硒省市达20多个，土壤中硒含量约 0.03-0. lmg/kg，向土壤补硒是获得富硒农产品（食品）的一种有效办法。多年来，人们以富 硒矿石、富硒煤矸石等原料，经粉碎、碱处理得到少部分(20 % )可溶性无机硒，与氮、磷、钾、 铜、锌、铁、镁、硼等无机盐或有机质复混成富硒肥料，或把硒制备成硒酸钠、亚硒酸钠，并以 其溶液再与无机或有机肥料混配成富硒肥料，喷施到作物叶片或直接施到土壤中，这些富 硒肥料虽然可以生产富硒农产品和富硒食品，但作物对肥料中无机硒的利用率仅10 % -15%〇
[0004] 此外，一方面，富硒矿石、富硒煤矸石中伴生有超标的重金属鎘、铅、砷、汞、钒，使 用富硒矿石、富硒煤矸石矿粉作为富硒肥料，易污染良田。另一方面，硒酸钠、亚硒酸钠价格 每吨超过百万元，如果植物的总利用率仅为10%-15%，则生产富硒农产品费用太高。
[0005] 农用微生物菌剂是一类有别于无机复合肥料、有机肥料的功能性微生物肥料。农 用微生物菌剂利用有益微生物转化硒，把无机硒转化成有机硒，以提高农作物对硒利用率， 进而提尚农广品含砸量。
[0006] 目前富硒微生物包括：富硒酵母、富硒食用菌、光合细菌等。专利CN200710010871 发明的一种富硒联合固氮菌剂，在制备菌剂中加入可溶性无机硒，利用固氮菌将无机硒转 化为有机硒，但其制剂中只采用固氮菌，仅具有单一固氮生理功能的富硒微生物肥料并作 为作物根部使用的固体肥料，不能直接大量生产出水溶性有机硒。
[0007] 专利CN102618469A，发明名称:一种荚膜红细菌及其应用，公开了一种荚膜红细菌 AYGHJ-16，属光合细菌，利用光能对物质进行代谢，促进无机硒的转化和吸收，并有固氮和 固碳作用，不能直接大量生产出水溶性有机硒。
[0008] 专利100512666C，发明名称:一种含硒微生物饲料添加剂及其制备方法，公开了利 用微生物活菌为红假单孢菌、纳豆菌芽孢杆菌和酵母菌进行液体发酵、固体发酵，实现无机 硒的微生物转化，不能直接大量生产出水溶性有机硒。
[0009]施用水溶性有机砸是大幅度提尚作物对砸利用率和生广富有机砸粮、油、水果、疏 菜、干果的重要途径。但是，目前市场生产的富硒酵母不能直接生产出水溶有机硒，而现有 技术也没有生产出水溶有机硒超过3000mg/kg的相关报道。
【发明内容】
[0010]针对现有技术存在的缺陷和不足，本发明的发明人经过多年的大量反复筛选，得 到了一株十分耐硒，且能分泌水溶性有机硒的菌株。
[0011] 本发明的技术方案之一是:一种枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)SE201412,该 菌已于2015年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC;地址：中国武汉，武汉 大学；邮编：430072)，保藏编号CCTCC NO.M2015708。
[0012] 该菌株是从湖北恩施市盐业复烤厂发酵烟草废弃物中分离得到的，该菌株十分耐 硒，能在无机硒高达30000mg/kg浓度的发酵液中正常生长，且能在发酵液中分泌水溶性有 机硒5000mg/L-12000mg/L，其中所述的水溶性有机硒为但不局限于硒氨基酸、硒低聚糖、硒 肽中的一种或多种。
[0013] 本发明的技术方案之二是:所述枯草芽孢杆菌SE201412在生产富有机硒菌剂中的 应用。
[0014] 本发明的技术方案之三是：一种富有机硒菌剂的制备方法，将枯草芽孢杆菌 SE201412接种于含硒培养基中发酵培养，取发酵液即得。
[0015] 所述含硒培养基可在本领域常用培养基的基础上加入亚硒酸钠得到。本发明优选 的含硒培养基为:葡萄糖4-8g/L，蔗糖3-7g/L，牛肉膏3-7g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠2-6g/ L，亚硒酸钠0.3-30g/L，pH6.8-7.6。本发明进一步优选的含硒培养基为:葡萄糖6g/L，蔗糖 5g/L，牛肉膏 5g/L，蛋白胨 1 Og/L，氯化钠 4g/L，亚硒酸钠 0.5-22g/L，pH7.2-7.6。
[0016] 在大规模生产过程中，所述含硒培养基内还添加有消泡剂，所述消泡剂可根据本 领域常识进行选择，本发明优选GPE-6330生物发酵专用消泡剂，所述消泡剂的用量优选为 0·5_1·5g/L〇
[0017] 所述发酵培养的条件可依据本领域常识确定，本发明优选的发酵培养条件为:温 度30-37°C，压力0.04-0.06MPa，搅拌转速160-220r/min，发酵液体积与通入空气体积比1: (0.2-0.4)。进一步优选的发酵培养条件为：温度32-35°(：，压力0.051〇^，搅拌转速190-200r/min，发酵液体积与通入空气体积比1:0.3。
[0018] 发酵培养采用的菌株是经过活化和扩大培养后得到的，所述活化和扩大培养可采 用本领域常规技术手段实现。将扩大培养后的种子液接种进入含硒培养基中进行发酵培 养，接种量为本领域常规接种量，优选为1 -2.5 %。
[0019] 其中，所述活化采用的固体培养基为:葡萄糖4-8g/L，蔗糖3-7g/L，牛肉膏3-7g/L， 蛋白胨8-12g/L，氯化钠2-6g/L，琼脂15-20g/L，pH6 · 8-7 · 6。优选为，葡萄糖6g/L，鹿糖5g/L， 牛肉膏5g/L，蛋白胨1 Og/L，氯化钠4g/L，琼脂18g/L，pH7.2-7.6。
[0020] 所述活化的具体操作为:将固体培养基加入试管内，灭菌后摆斜面，冷却凝固，将 枯草芽孢杆菌SE201412接种在培养基上，于30-35°C培养试管斜面长满菌。
[0021 ]所述扩大培养采用的种子液培养基为:葡萄糖4-8g/L，蔗糖3-7g/L，牛肉膏3-7g/ L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠2-6g/L，pH6 · 8-7 · 6。优选为，葡萄糖6g/L，鹿糖5g/L，牛肉膏5g/L， 蛋白胨 1 〇g/L，氯化钠 4g/L，pH7 · 2-7 · 6。
[0022] 所述扩大培养的条件为:温度30-37°C，压力0.04-0.061〇^，搅拌转速160-22(^/ 11^11，发酵液体积与通入空气体积比1 :(0.2-0.4)，发酵时间12-2411。优选为，温度32-35°(：， 压力0.05MPa，搅拌转速190-200r/min，发酵液体积与通入空气体积比1:0.3，发酵时间14-18h〇
[0023] 在发酵制备富有机硒菌剂时，将菌株(或种子液)接入发酵培养基后，每隔2-4小时 取发酵液样品，用酸度计测定pH并保持发酵液pH在6.8-7.6之间；同时，用可见光分光光度 计测定细菌细胞浓度，当前后两次取样检测到的细菌细胞浓度在最大吸光值处没有明显增 加时，即可认定发酵结束。
[0024]经过大量实验发现，在上述培养基和培养条件下，发酵时间为12_24h，优选为14-18h〇
[0025]本发明所述菌株可在较大的亚硒酸钠范围内（0.3_30g/L)进行发酵，在工业化大 生产过程中，为了充分确保发酵效果，一般而言，当发酵培养基内的亚硒酸钠用量超过lg/L 时，采用分批加入亚硒酸钠进行发酵培养的方式。
[0026]优选地，在配制培养基的时候，先加入25-35 %重量的亚硒酸钠，剩余的亚硒酸钠 用水溶解后，在发酵过程中，分批逐渐加入发酵罐内。
[0027]进一步优选地，先将25-35 %重量的亚硒酸钠加入起始发酵培养基中，然后将剩余 的亚硒酸钠用其重量5-7倍的水溶解后，在发酵2-4h后每隔1-1.5h向发酵体系中加入适量 溶液。
[0028]所述适量没有特殊限制，以能够在发酵结束前加完，且最后一次添加后发酵尚未 结束，能够继续发酵一段时间以消耗新加入的亚硒酸钠为宜。
[0029]再进一步优选地，先将30%重量的亚硒酸钠加入起始发酵培养基中，然后将剩余 的亚硒酸钠用其重量6倍的水溶解后，在发酵3h后每隔lh向发酵体系中加入溶解液总体积 1/10的溶液。
[0030] 采用上述任意一种制备方法得到的发酵液，其有机硒含量为500mg/kg-30000mg/ kg，其中溶于水的有机硒占总有机硒的60%-90%，其中10%-40%为微生物自身合成的有 机硒，并经酶降解后可生产出完全溶于水的有机硒。此外，此种方法培养得到的发酵液，其 内并不含有镉、铅、砷、汞等重金属，在作为菌肥应用于作物种植时，更加安全，不会对土壤 造成重金属污染。
[0031 ]本发明的技术方案之四是：一种富有机硒菌剂，所述富有机硒菌剂是采用上述任 意一种制备方法得到的。
[0032] 具体地，发酵菌剂可以为液体或固体粉末，例如，可以直接取发酵液包装后制成液 体菌剂;也可以将发酵液浓缩后再包装制成液体菌剂;或者将发酵液浓缩后经过冷冻干燥 制成固体粉末菌剂。具体的制备方法可为:发酵培养结束后，采用固液离心机处理发酵液， 取上清液;或浓缩所述上清液取浓缩液或将上清液浓缩、干燥后取干粉即得水溶性有机硒。 对于离心后的沉淀物可采用如下方法回收利用：向沉淀物中加入纤维素酶酶解，离心酶解 液，再将酶解沉淀物用蛋白酶酶解后离心，合并两次离心液，其内仍含有水溶性有机硒。也 可将两次离心液浓缩得浓缩液;或将浓缩液冻干得干粉。
[0033] 本发明所述的富有机硒菌剂不添加防腐剂即可长期保存，且能保持良好的功效。 在具体的生产中，也可以向其中加入防腐剂以进一步延长其保存期限，所述防腐剂可选自 E-聚赖氨酸、脱氢乙酸钠、丙酸钙、双乙酸钠、乳酸钠、乳酸链球菌素中的一种或几种。防腐 剂的加入量可依据本领域常识而定，本发明优选的防腐剂的加入质量占发酵液体积的 0·1%-0·6%〇
[0034] 优选地，富有机硒菌剂中有机硒含量为300mg/kg-30000mg/kg。
[0035]优选地，富有机硒菌剂中枯草芽孢杆菌SE201412的活菌数为10-30亿/mL，进一步 优选为15-25亿/mL。
[0036]本发明的技术方案之五是：富有机硒菌剂在作物种植中的应用。其中，所述作物优 选为粮食作物、油料作物、水果、蔬菜、干果、木本油料中的任何一种。
[0037]具体地，所述粮食作物包括但不局限于水稻、玉米、小麦、荞麦、马铃薯、红薯;所述 油料作物包括但不局限于大豆、芝麻、油菜、花生;所述水果包括但不局限于荔枝、龙眼、香 蕉、橙子，橘子、莲雾、苹果、枣;所述蔬菜包括但不局限于白菜、萝卜、花菜、大蒜、葱、芹菜，所 述干果包括但不局限于核桃、板栗;所述木本油料包括但不局限于油茶、油桐。
[0038]所述富有机硒菌剂的具体应用方式为：用水稀释所述富有机硒菌剂至有机硒含量 为20mg/kg-5 Omg/kg，使用稀释后的富有机硒菌剂对生长期的作物叶面或经济林叶面喷施 1_3次即可。
[0039] 优选地，喷施2或3次时，喷施间隔时间为6-8天。
[0040] 优选地，喷施量为10-50L/667M2。
[0041]采用本发明的富有机硒菌剂对生长期的作为进行干预，能够使得作物中总硒含量 达到0.01-0.0511^/1^，其中有机硒达到80%-85%，达到富有机硒粮、油、水果、蔬菜、干果的 质量标准，并能够提高农产品品质，产量和增强农作物抗病能力。
[0042]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳 实施例。
【附图说明】
[0043] 图1为菌株SE201412显微镜（1000X)观察照片；
[0044] 图2为菌株SE201412的平板菌落形态；
[0045] 图3为菌株SE201412进化树。
【具体实施方式】
[0046] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明涉及到的原料 或试剂均可市购获得;涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。本发明采用GB/ T5009.93-2003《食品中硒的测定》、GB/T5009.11-2003《食品中总砷和无机砷的测定》、GB/ T23942-2009化学试剂、电感耦合等离子体原子发射光谱法通则、杭州市农业标准规范 DB3301检测发酵液中的有机硒和重金属含量。
[0047]其中，枯草芽孢杆菌SE201412的分离鉴定方法如下：
[0048] 分离:从湖北恩施市盐业复烤厂发酵烟草废弃物中取材料lg，在无菌超净工作台 上，用无菌水振荡稀释Π ^-ΠΓ8，用移液管取0. lml-0.2ml移入已灭菌倒有专用培养基（自 来水1000ml，硒（由亚硒酸钠提供)5g、20g葡萄糖、15g蛋白胨、5g氯化钠、0.5g牛肉膏升、酵 母膏0.25%、磷酸氢二钾0.1 %、PH 7.5)的培养皿上，用涂布棒涂匀，无菌培养，选取在高硒 培养基上生长旺盛的单菌落。
[0049] 鉴定:经鉴定，该菌株形态或生理生化特征是:革兰氏染色阳性、细胞杆状、直径< lum、如图1所示，形成芽孢，不膨大，无伴胞晶体;接触酶、氧化酶阳性，好氧生长，VP试验阳 性，VP <PH6试验阳性，VP > PH7试验阴性，甲基红试验阴性，利用葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、 甘露醇产酸;利用葡萄糖不产气;利用柠檬酸盐，还原硝酸盐，水解淀粉、液化明胶、分解酪 素。在?册、7%恥(：1、70°(：均生长。
[0050]根据细胞形态、生化实验结果和基因序列测定结果，该菌株SE201412鉴定为枯草 芽孢杆菌Baci 1 lus Subti 1 is，已于2015年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称 CCTCC;地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号CCTCC No.M2015708。
[0051]该菌株的显微镜观察照片、平板菌落形态、进化树分别如图1、图2、图3所示。表1列 出了该菌株16S rRNA基因测序BLAST结果，表2，表3列出了该菌株的生理生化特性 [0052] 表1菌株SE201412 16S rRNA基因测序BLAST结果
[0055] 表2菌株SE201412生理生化特性-酶活、碳源同化
[0058] +:阳性反应;阴性反应
[0059] 表3菌株SE201412生理生化特性一利用碳源产酸
[0062] +:阳性反应;-:阴性反应;W:弱阳性
[0063] 实施例1富有机硒菌剂的制备方法
[0064] (1)菌株活化:将复壮培养基加入试管中，置伽马射线辐照机下，在2.5kGy条件下 灭菌后，摆成斜面，冷却凝固；将4°C冷藏中的枯草芽孢杆菌SE201412试管菌种用接种环种 取1环接种在试管复壮培养基上，接种100支试管种，置32°c培养箱中培养至SE201412试管 斜面长满菌；
[0005]其中，所述复壮培养基为:6g葡萄糖、5g鹿糖、5g牛肉膏、10蛋白胨、4g氯化钠、18g 琼脂、1000毫升水、PH7.4。
[0066] (2)扩大培养:取曝气的自来水100L装入200L发酵罐中，再加入600g葡萄糖、500g 蔗糖、500g牛肉膏、1000g蛋白胨、400g氯化钠，GPE-6330生物发酵专用消泡剂0.1kg，用氢氧 化钠调PH7.4，用伽马射线辐照机3kGy灭菌发酵罐通气管道、灭菌发酵罐罐体，灭菌发酵液， 然后将100支枯草芽孢杆菌SE201412复壮试管种接入发酵罐中，设定发酵搅拌速度195转/ 分钟，罐内温度32°C，罐内压力0.05MPa，罐内空气流量l:0.3(v/v)。接入种子后，每隔3小时 取样发酵液用酸度计测定PH(维持发酵液PH7.4)和用722可见光分光光度计测定细菌细胞 浓度，发现发酵液12h细菌细胞浓度与15h细菌细胞浓度在最大吸光值处没有明显增增加， 结束发酵，整个发酵时间15h。
[0067] (3)富硒菌剂的生产:在2吨的发酵罐中加入1吨曝气自来水，再加入6000g葡萄糖、 5000g蔗糖、5000g牛肉膏、10000g蛋白胨、4000g氯化钠，纯度99%亚硒酸钠673.7g，GPE-6330生物发酵专用消泡剂lkg，调PH7.6。用伽马射线辐照机4kGy灭菌发酵罐通气管道、灭菌 发酵罐罐体，灭菌发酵液，将扩大培养的100L枯草芽孢杆菌SE201412菌种子液在无菌条件 下送入发酵罐中，设定发酵搅拌速度195转/分钟，罐内温度32°C，罐内压力0.05MPa，罐内空 气流量1:0.3(v/v)。接入种子后，检测发酵液的pH值并维持发酵液的pH值为7.4,并采用分 光光度计检测发酵进程，发酵15h结束发酵。
[0068]经检测，发酵液中有机硒含量为300mg/L。
[0069] 实施例2富有机硒菌剂的制备方法
[0070] (1)菌株活化:将复壮培养基加入试管中，置伽马射线辐照机下，在2.5kGy条件下 灭菌后，摆成斜面，冷却凝固；将4°C冷藏中的枯草芽孢杆菌SE201412试管菌种用接种环种 取1环接种在试管复壮培养基上，接种200支试管种，置32°C培养箱中培养至SE201412试管 斜面长满菌；
[007?]其中，所述复壮培养基为：12g葡萄糖、10g鹿糖、10g牛肉膏、20蛋白胨、8g氯化钠、 36g琼脂、2000毫升水、PH7 · 6。
[0072] (2)扩大培养：取曝气的自来水200L装入0.5吨发酵罐中，再加入1200g葡萄糖、 l〇〇〇g蔗糖、l〇〇〇g牛肉膏、2000g蛋白胨、800g氯化钠，GPE-6330生物发酵专用消泡剂0 · 2kg， 调PH7.5，用伽马射线辐照机3kGy灭菌发酵罐通气管道、灭菌发酵罐罐体，灭菌发酵液，然后 将接种的200支枯草芽孢杆菌SE201412复壮试管种接种接入发酵罐中，设定发酵搅拌速度 195转/分钟，罐内温度35 °C，罐内压力0.05MPa，罐内空气流量1:0.3 (v/v)。接入种子后，检 测发酵液的pH值并维持发酵液的pH值为7.6,并采用分光光度计检测发酵进程，发酵15h结 束发酵。
[0073] (3)富硒菌剂的生产：在2吨的发酵罐中加入2吨曝气自来水，再加入12000g葡萄 糖、10000g蔗糖、10000g牛肉膏、20000g蛋白胨、8000g氯化钠，GPE-6330生物发酵专用消泡 剂2kg，纯度99 %亚硒酸钠6666.7g，调PH7.6，用伽马射线辐照机3.5kGy灭菌发酵罐通气管 道、灭菌发酵罐罐体，灭菌发酵液，然后将扩大培养的200L种子液在无菌条件下倒入2吨发 酵罐中，设定发酵搅拌速度195转/分钟，罐内温度35 °C，罐内压力0.05MPa，罐内空气流量1: 〇.3(v/v)，采用与步骤(2)相同方式检测pH值和发酵进程。
[0074] 该实施例使用的亚硒酸钠总量为22444.6g，发酵罐里先加6666.7g亚硒酸钠，剩余 的亚硒酸钠装脉冲输液瓶中用l〇〇kg无菌水溶解后，用伽马射线辐照机3.5kGy灭菌，在发酵 3h后每隔lh均匀向罐内输送10kg亚硒酸钠溶液并向罐内加氢氧化钠溶液保持发酵液PH为 7.5。
[0075]发酵罐培养15h结束发酵，管道输入储罐，用自动灌装机灌装，每瓶灌5L封盖后用 伽马射线辐照机3kGy灭菌后存放1年。
[0076] 经检测，发酵液中有机硒含量为5000mg/L。
[0077]实施例3富有机硒菌剂的制备方法
[0078] (1)菌株活化:将复壮培养基加入试管中，置伽马射线辐照机下，在2.5kGy条件下 灭菌后，摆成斜面，冷却凝固；将4°C冷藏中的枯草芽孢杆菌SE201412试管菌种用接种环种 取1环接种在试管复壮培养基上，接种50支试管种，置32°C培养箱中培养至SE201412试管斜 面长满菌；
[0079] 其中，所述复壮培养基为:3g葡萄糖、2.5g蔗糖、2.5g牛肉膏、5蛋白胨、2g氯化钠、 9g琼脂、500毫升水、PH7 · 5。
[0080] ⑵扩大培养:取曝气的自来水50L装入100L发酵罐中，再加入300g葡萄糖、250g蔗 糖、250g牛肉膏、500g蛋白胨、200g氯化钠，GPE-6330生物发酵专用消泡剂0.05kg3lPH7.6， 用伽马射线辐照机4kGy灭菌发酵罐通气管道、灭菌发酵罐罐体，灭菌发酵液，然后将接种的 50支枯草芽孢杆菌SE201412复壮试管种接种接入发酵罐中，设定发酵搅拌速度195转/分 钟，罐内温度35°C，罐内压力0.045MPa，罐内空气流量1:0.35(￥八），发酵罐培养1511，结束发 酵。
[0081 ] (3)富硒菌剂的生产:在1吨的发酵罐中加入0.5吨水，再加入3000g葡萄糖、2500g 蔗糖、2500g牛肉膏、5000g蛋白胨、2000g氯化钠，纯度99 %亚硒酸钠3366 · 9g，GPE-6330生物 发酵专用消泡剂〇. 5kg，用氢氧化钠调PH7.6，用伽马射线辐照机2kGy灭菌发酵罐通气管道、 灭菌发酵罐罐体，灭菌发酵液，然后将扩大培养的50L枯草芽孢杆菌SE201412种子液在无菌 条件下接入发酵罐中，设定发酵搅拌速度195转/分钟，罐内温度34°C，罐内压力0.05MPa，罐 内空气流量1: 〇. 3(v/v)。发酵罐培养15h，管道输入储罐，用自动灌装机灌装，每瓶灌5L封盖 后置，用伽马射线辐照机2kGy灭菌后存放1年。
[0082]经检测，发酵液中有机硒含量为3000mg/L。
[0083]效果实验例一 [0084]实验方法：
[0085] (1)分别取有机硒含量200mg/kg富有机硒菌剂1 · 2L、2 · 4L、3 · 6L、4 · 8L，兑水25L依 次稀释为10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg的富硒菌剂，制备成四种不同硒含量的菌剂 供水稻田备用，同时设定空白对照(纯水）；
[0086] (2)分别将四种菌剂以及纯水施用于处于抽穗开花生长期的水稻叶面上（施用一 次），施用量约为25L/667M 2;
[0087] (3)大米收获后，测定大米硒含量，有机硒利用率等数值，结果列于表4:
[0088] 表4发酵有机硒生产富有机硒大米效果
[0090] 注：以上数据由国家富硒产品质量监督检验中心(恩施州产品质量监督检验所)检 测提供;试验地土壤中不含硒。
[0091] 效果实验例二 [0092]实验方法：
[0093] (1)分别取有机硒含量200mg/kg富有机硒菌剂1 · 2L、2 · 4L、3 · 6L、4 · 8L，兑水25L依 次稀释为10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg的富硒菌剂，制备成四种不同硒含量的菌剂 供苹果园备用；同时设定空白对照(纯水）；
[0094] (2)分别将四种菌剂及纯水施用于处于苹果开花初期树叶面上(施用一次），施用 量约为 25L/667M2;
[0095] (3)苹果收获后，测定苹果硒含量，有机硒利用率等数值，结果列于表5:
[0096] 表5发酵有机硒生产富有机硒苹果效果
[0097]
[0098] 注：以上数据由湖北民族学院生物示范中心开放平台检测提供;试验地土壤中不 含硒。
[0099] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)SE201412,其保藏编号为CCTCC No.M 2015708。2. 权利要求1所述枯草芽孢杆菌SE201412在生产富有机硒菌剂中的应用。3. -种富有机硒菌剂的制备方法，其特征在于:将枯草芽孢杆菌SE201412接种于含硒 培养基中发酵培养，取发酵液即得。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:所述含硒培养基为:葡萄糖4-8g/L，蔗 糖 3-7g/L，牛肉膏3-7g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠 2-6g/L，亚硒酸钠0 · 3-30g/L，pH6 · 8-7 · 6; 优选地，葡萄糖6g/L，鹿糖5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠4g/L，亚硒酸钠0.5_ 22g/L，pH7.2-7.6。5. 根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于:所述含硒培养基内还含有消泡剂， 所述消泡剂优选为GPE-6330，所述消泡剂的用量优选为0.5-1.5g/L。6. 根据权利要求3-5任一项所述的制备方法，其特征在于:所述发酵培养的条件为:温 度30-37°C，压力0.04-0.06MPa，搅拌转速160-220r/min，发酵液体积与通入空气体积比1: (0 · 2-0 · 4)，发酵时间 12-24h; 优选地，温度32-35 °C，压力0.05MPa，搅拌转速190-200r/min，发酵液体积与通入空气 体积比1:0.3，发酵时间14-18h。7. 根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其特征在于：当所述含硒培养基中亚硒酸 钠含量超过lg/L时，先加入25-35%重量的亚硒酸钠配制培养基，然后以水溶解剩余亚硒酸 钠，并在发酵过程中将其分批加入发酵体系中； 优选地，用剩余亚硒酸钠重量5-7倍的水溶解亚硒酸钠，并在发酵2-4h后每隔1-1.5h将 其分批加入发酵体系中。8. 权利要求3-7任一项所述制备方法得到的富有机硒菌剂。9. 根据权利要求8所述的富有机硒菌剂，其特征在于:所述富有机硒菌剂的有机硒含量 为300mg/kg-30000mg/kg;优选地，所述富有机硒菌剂中枯草芽孢杆菌SE201412的活菌数为 10-30亿/mL。10. 权利要求3-7任一项所述制备方法得到的富有机硒菌剂或权利要求8或9所述富有 机硒菌剂在作物种植中的应用。
【文档编号】A01N59/02GK105950503SQ201610338121
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】刘金龙, 郑威, 刘欋霄, 郑倬, 温亮, 戴光忠, 杨军, 孙志国
【申请人】湖北民族学院, 湖北省农业科学院农业经济技术研究所, 湖北省富硒产业研究院