一种复合菌剂及其制备与应用

一种复合菌剂及其制备与应用
【专利摘要】本发明涉及微生物菌剂，具体是一种复合菌剂及其制备与应用。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)分别为：CGMCCNO.12306(KY?1)、CGMCCNO.12307(KY?2)、CGMCCNO.12308(KY?3)，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。将所述解淀粉芽孢杆菌分别经过三级液体发酵，而后按体积比(5～1):(1～5)：(5～1)比例将发酵液混合即获得复合菌剂。本发明依据在不同地域不同农作物的根际土壤中获得的三株解淀粉芽孢杆菌，KY?1、KY?2、KY?3，它们具有不同的生理功能，且彼此之间不产生拮抗性。CGMCCNO.1230620160324CGMCCNO.1230720160324CGMCCNO.1230820160324
【专利说明】
一种复合菌剂及其制备与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物菌剂，具体是一种复合菌剂及其制备与应用。
【背景技术】
[0002] 土传病害是指生活在土壤中的病原体在条件适宜时从作物根部或茎基部侵害作 物而引起的病害。常见的有猝倒病、立枯病、枯萎病、黄萎病、软腐病、根腐病、疫病、黑腐病、 菌核病、根结线虫病等。此类病害呈逐年加重的趋势。每年给农业生产造成的直接经济损失 达40%-60%，严重的达80%以上。严重制约设施农业的发展。
[0003]目前该病害的防治方法主要包括轮作、培育抗病品种和使用化学药剂。其中轮作 防病被广泛使用，但对一些特殊经济作物或特定地区无法达到合理轮作的要求，且有较大 的局限性;常规的抗病育种由于存在两方面的问题而进展缓慢，一是利用单一的抗性基因 使得土传病害病原菌发展成为新的小种，二是抗源材料匮乏使常规育种满足不了生产上的 需要，而利用现代生物技术进行抗土传病害的育种工作也尚处于探索阶段。化学药剂由于 可以收到立竿见影的预期效果，也被广泛使用，但化学药剂的长期使用带来了一系列的副 作用，破坏了生态平衡，造成次要病害猖獗，药剂的残留造成水源土壤的污染。
[0004] 同时由于一味追求作物高产，过量使用化肥，使得土壤板结、土壤地力下降，农产 品品质下降，果蔬中硝酸盐含量超标等问题越来越严重。随着经济的发展和生活水平的提 高，农产品的优质及安全生产越来越受到社会的广泛关注。
[0005] 微生物肥料凭借其独特的作用，逐渐被应用于农业生产。微生物肥料中有益微生 物能产生糖类物质，占土壤有机质的〇. 1 %，与植物粘液，矿物胚体和有机胶体结合在一起， 可以改善土壤团粒结构，增强土壤的物理性能和减少土壤颗粒的损失，在一定的条件下，还 能参与腐殖质形成。改善土壤物理性状，有利于提高土壤肥力。
[0006] 它与有机肥或者化肥合理搭配使用，实现平衡施肥，从而提高化肥的利用率，降低 化肥的施用量，节约成本，减少污染；
[0007] 由具有特殊功能的菌种制成的微生物肥料，不但减少农产品污染，改善农产品的 品质，在土传病害的防治方面起着非常重要的作用。
[0008] 土传病害的防治中常用的细菌为Bacillius属(芽孢属）。它是一类广泛存在于自 然界的腐生细菌，生长快、营养简单，能够形成具有较强抗逆能力的芽孢。目前用于植物病 害的主要有13.811131：；[118(枯草芽孢杆菌）、13.06^118(錯样芽胞杆菌）。
[0009] 据相关文献资料显示，解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细 菌，在其自身的生长过程中产生一系列的代谢物质，这些次生代谢产物使得解淀粉芽孢杆 菌能够广泛抑制真菌和细菌的活性，并促进植物生长，防治根结线虫。
[0010] 研究结果表明，生防芽孢杆菌的抑病、促生长机理主要有四种：一、产生抗生素类 物质，直接抑制病原菌生长;二、分泌生长激素类物质，促进植物生长;三、活化养分，供植物 生长所需；四、诱导植物产生抗病性。但对于多菌株混合复配使用并没有相关文献报道。

【发明内容】

[0011] 本发明目的是提供一种复合菌剂及其制备与应用。
[0012] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0013] -种解淀粉芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)分别为： CGMCCN0.12306 (KY-1)、CGMCCN0.12307 (KY-2)、CGMCCN0.12308 (KY-3)，均保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期 为2016年3月24日。
[0014] 其中，菌株从辽宁北票陆地种植的13年生苹果树、辽宁新宾棚栽春茬西红柿以及 吉林松源林下参的根际土壤中中分离筛选了三种芽孢杆菌，通过对其16S基因序列与 GenBank中的数据对比分析发现其与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)相似 性最高，为99.9%，其形态特征及生理生化特性与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amy lol iquef aciens)最相似。从而将分离出来的KY-1KY-2KY-3确认为解淀粉芽孢杆菌。
[0015] 上述菌株的菌落型态为在营养琼脂平板上，37°C，培养96小时，属兼性厌氧。菌落 呈淡黄色不透明，表面粗糙，边缘不规则，锯齿状，有隆起，不产色素。
[0016] 上述保藏的菌种接种于斜面培养基，于37°C恒温静置培养24h，镜检无杂菌且芽孢 率大于95%，并于4°C冰箱保藏。一年内使用。
[0017] 所使用的斜面配方(重量比）：葡萄糖0.1 %~4.00 %、酵母浸粉0.01 %~1.50 %、 蛋白胨0.01 %~1.50%、牛肉膏0.01 %~1.00%、氯化钠0.01 %~1.00%、氯化钙0.01 %~ 1 · 00 %、磷酸氢二钠0 · 01 %~1 · 00 %、可溶性淀粉0 · 02 %~2 · 00 %、硫酸铵0 · 01 %~ 1.00 %、硫酸锰0. lmg/L~1 Omg/L、钼酸钠0. lmg/L~1 Omg/L、琼脂粉1.2 %~2.5 %、余量为 水。口!1=7.1-7.2。121°(：，灭菌3〇11^11。
[0018]保藏的优良的斜面菌种，接种于液体摇瓶培养基中，于180rpm，3(TC~32°C，恒温 振荡培养20h~24h，得摇瓶液体菌种。
[0019] 所使用的液体摇瓶配方（重量比）：葡萄糖0.20 %~5.00 %、豆饼粉0.10 %~ 4 · 00 %、磷酸氢二钾0 · 02 %~1 · 00 %、酵母浸粉0 · 02 %~3 · 00 %、硫酸镁0 · 02 %~2 · 00 %、 蛋白胨0.02 %~2.00 %、蔗糖0.02 %~4.00 %、玉米浆0.02 %~4.00 %、尿素0.02 %~ 4.00%、工业盐0.02%~1.00%、碳酸钙0.02%~2.00%、泡敌0.1 %~0.4%，余量为水。pH =7 · 0-7 · 4。121 °C灭菌 30min。
[0020] -种复合菌剂，将上述所述解淀粉芽孢杆菌分别经过三级液体发酵，而后按体积 比（5~1):(1~5):(5~1)比例将发酵液混合即获得复合菌剂。
[0021] 所述复合菌剂中上述菌株分别经三级液体发酵后的发酵液中芽孢率多90%，血球 活菌计数彡100亿/ml,残留葡萄糖彡0.6%，pH=7.0~8.0。
[0022] 将按上述比例混合的混合发酵液中加入混合发酵液体积0.1~2.0%的稳定剂，即 获得液体制剂。
[0023] 将按上述比例混合的混合发酵液经降膜浓缩至混合发酵液体积的1/2-1/3，而后 加入浓缩后混合发酵液体积0.1~2.0 %的稳定剂和浓缩后混合发酵液体积30 %~40 %的 载体，加入后充分混合，混合后喷雾干燥，即得复合菌粉剂。
[0024] 所述稳定剂为苯甲酸钠和/或氨基酸;载体为膨润土、稻壳粉、沸石粉、白炭黑、碳 酸钙中的几种的混合;其中，氨基酸为赖氨酸。
[0025] 一种复合菌剂的制备方法：
[0026] 将3种解淀粉芽孢杆菌的液体种子液分别按0.5%~1 %接种至一级种子罐培养基 内，于30°C~32°C，罐压= 0.02MPa~0.05MPa，通气比=1:0.5~1:0.8，一级种子罐周期= 12h~24h，进行一级发酵培养，至生物量多10 %，菌体形态一致，短杆状，两端平齐，着色均 一，pH自然回升至6.5~7.0,待用；其中，利用火焰接种法接入一定体积的无杂菌的且符合 标准的摇瓶种子液。
[0027]按照二级种子罐培养基配料，于二级种子罐内灭菌，同时将导种管路灭菌（123°C 灭菌60min。），并用无菌空气保压。当罐温降至32°C左右时，通过无菌的移种管路接入1-15%体积的无杂菌的且符合标准的上述一级发酵培养液，于30°C~32°C，罐压=0.02MPa~ 0.05MPa，通气比=1:0.5~1:0.8，二级种子罐培养周期=12h~24h，进行二级发酵培养，至 生物量多10%，菌体形态一致，短杆状，两端平齐，着色均一，pH自然回升至6.5~7.0,待用； [0028]按照发酵罐培养基配料，于发酵罐内灭菌，同时将导种管路灭菌（123°C灭菌 60min。），并用无菌空气保压。当罐温降至32°C左右时，通过无菌的移种管路接入2-15%体 积的无杂菌的且符合标准的上述二级发酵培养液，于30°C~32°C，罐压= 0.04MPa~ 0.07]\0^，通气比=1:0.8~1:1.2，通过流加浓度为20%~25%氨水控制?!1=6.5-6.7，直至 pH自然回升，同时通过流加80%的葡萄糖溶液，维持发酵过程中残留的葡萄糖浓度多1%， 周期= 30h~72h;当芽孢率大于90%，活菌数大于100亿/ml，残糖彡0.6%，结束发酵，即分 别获得三级发酵液。
[0029]其中，在配糖罐中配制80%的葡萄糖溶液并于115°C、20分钟灭菌消毒，降温至30 °C，待用;加入量为每分钟10L~15L。
[0030]而后按照体积比=(5~1): (1~5) : (5~1)的比例，将发酵液混合即获得复合菌 剂。
[0031 ]将按上述比例混合的混合发酵液中加入混合发酵液体积0.1-2.0 %的稳定剂，即 获得液体制剂。
[0032]将按上述比例混合的混合发酵液经降膜浓缩至混合体积的1/2-1/3，而后加入浓 缩后体积〇. 1-2 %的稳定剂，再加入浓缩后体积30 %~40 %的载体充分混合，喷雾干燥而得 复合菌粉剂。
[0033]所述稳定剂为苯甲酸钠和/或氨基酸;载体为膨润土、稻壳粉、沸石粉、白炭黑、碳 酸钙中的几种的混合;其中，氨基酸为赖氨酸;所述稳定剂为苯甲酸钠和氨基酸，两者质量 比为(2~5):(1~10)。
[0034]所述载体为膨润土、稻壳粉、沸石粉、白炭黑和碳酸钙，按质量比为膨润土 :稻壳 粉:沸石粉：白炭黑：碳酸钙= (20~40): (2~10): (20~35):(1~10): (10~30)的比例混 合。
[0035] (1)一级及二级种子罐培养基配方
[0036] 葡萄糖0 · 20%~5 · 00%、豆饼粉0 · 10 %~4 · 00 %、磷酸氢二钾0 · 02 %~1 · 00 %、酵 母浸粉0.02 %~3.00%、硫酸镁0.02%~2.00%、蛋白胨0.02%~2.00%、蔗糖0.02%~ 4.00%、玉米浆0.02%~4.00%、尿素0.02%~4.00%、工业盐0.02%~1.00%、碳酸钙 0.02%~2.00%、泡敌0.1%~0.4%，余量为水。？!1=7.0-7.4。121°(：灭菌3011^11。
[0037] (2)发酵罐培养基配方
[0038] 葡萄糖0.10 %~6.00%、豆饼粉0.10 %~4.00%、玉米粉0.10 %~4.00%、花生饼 粉0 · 10 %~4 · 00 %、棉籽饼粉0 · 10 %~4 · 00 %、玉米浆0 · 10 %~3 · 00 %、酵母浸粉0 · 10 %~ 2.00%、蛋白胨0.10%~3.00%、工业盐0.10%~2.00%、碳酸钙0.10%~2.00%、余量为 水。pH=6 · 5-7 · 4。121 °C灭菌 30min。
[0039] 本发明的有益效果：
[0040]本发明依据在不同地域不同农作物的根际土壤中获得的三株解淀粉芽孢杆菌， KY-1、KY-2、KY-3，它们具有不同的生理功能，且彼此之间不产生拮抗性。
[0041 ]其中，菌株ΚΥ-1在蛋黄琼脂平板上培养，能够产生透明的水解圈，该菌株具有解磷 解钾功能，溶解矿物磷和其他营养物质促进植物生长。菌株ΚΥ-2是利用杀线虫活性高效筛 选模型筛选而得，对多种蔬菜瓜果的根结线虫，具有很好的防治作用，对白粉虱、棉铃虫、烟 青虫，小菜蛾也有很好的趋避作用。菌株ΚΥ-3在蛋白酶筛选平板上能够产生较大的透明的 水解圈，同时在以大肠杆菌和黑曲霉为鉴定菌的鉴定平板上产生透明的抑菌圈，对多种农 作物的细菌性和真菌性的病害具有很好的防治作用。
[0042]本发明将上述三株解淀粉芽孢杆菌采用发酵工艺获得微生物菌剂，菌剂由活的微 生物菌体及其代谢产物组成，如各种活性酶、抗菌肽、脂肽以及植物激素类，生物活性高;活 菌数高，进入土壤后快速繁殖，增加根际土壤的微生物菌群，改善土壤的物理性质和团粒结 构，缓解土壤板结，促进有机物质的分解，同时不断分泌次生代谢产物，调节植物的生理生 命活动，防治土传病害的发生与传播，增产增收，改善农产品品质。在农产品采摘后的储藏 过程中的防病、保鲜也具有一定的功效。
[0043] 具体，获得粉体的菌剂，具有较高的活菌数，适合与底肥，尤其是优质的农家肥混 合使用。施入土壤后，适应环境能力强，繁殖速度快，在增加根际有益微生物菌群的同时，迅 速分解有机质供植物吸收利用，提高土壤肥力，增强土壤渗水、保水及透气性，促进根系快 速生长，防止土传病害的蔓延。
[0044] 获得液体制剂，主要用于叶面喷施，防虫、治病，促进叶绿素合成，增强光合作用， 加速植物新陈代谢和蛋白质合成，促使作物早熟丰产，增加瓜果的含糖量，提高作物抗病抗 装抗寒能力，提尚果品品质。
[0045] 利用上述获得的菌剂在保持生态平衡、降低成本的同时对大棚蔬菜、瓜果，大田作 物、中药材及园林花卉等多种植物都具有很好的促生长、增产、防病、防虫、提高果实品质的 作用，并且对人体安全，不污染环境。
【具体实施方式】
[0046]本发明微生物菌肥，是由三株解淀粉芽孢杆菌分别经过三级液体发酵达到放罐标 准，再将上述发酵所得的三株解淀粉芽孢杆菌的发酵液混合，再经特殊加工而成。所述的三 株解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)分别为：CGMCCN0· 12306(ΚΥ-1)、 CGMCCNO. 12307(KY-2)、CGMCCN0.12308(KY-3)，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年3月24日。
[0047] 下面结合具体实施案例对本发明做进一步说明
[0048] 实施例1
[0049] 菌株的获得：
[0050] 1. 土样的采集
[0051] (1)于夏季，雨水之后。在作物根际土表下层约5厘米~10厘米的范围内采集土样；
[0052] (2)选择发病区域，但未发病的植株个体下的根际土壤；
[0053] (3)保藏于无菌透气的塑料袋中。
[0054] 2.富集培养
[0055] (1)培养基制备
[0056]普通营养琼脂平板g/L:牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、氯化钠5.0、纯净水1000ml、琼脂 粉2·0、ρΗ=7·0~7.2、制霉菌素5〇11^/1 [0057] (2) 土样处理
[0058] 称取土样lg，加入到99ml的无菌水中，振荡器振荡15min。于无菌条件下过滤，得滤 液
[0059] (3)用无菌水将上述滤液，按照十倍梯度稀释法，逐一稀释至10'10'10'10一6
[0060] (4)将上述稀释液于80°C水浴保温lOmin，涂布于普通营养琼脂平板。每个平板加 入0. lml稀释液。于37°C恒温培养96h
[0061] (5)于无菌条件下，将每一个单菌落涂生化片，采用革兰氏染色法进行显微镜观 察。
[0062] (6)将产芽孢，且为革兰氏阳性的菌落转接普通营养琼脂斜面，于37°C恒温培养 96h(培养基配比同普通营养琼脂平板g/L)
[0063] 3、划线纯化:利用普通营养琼脂平板，采用平板划线法将得到的单菌落斜面培养 物继续纯化，直到得到单一的典型的菌落形态。菌落形态特征为:淡黄色不透明，表面粗糙， 边缘不规则，锯齿状，有隆起，不产色素
[0064] 4、定向筛选
[0065] (1)分解有机磷及无机磷的能力筛选
[0066] 蛋黄平板g/L:牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、氯化钠5.0、纯净水1000ml琼脂粉2.0、pH = 7.0~7.2，无菌蛋黄溶液10ml (1个蛋黄加入20ml无菌水制成无菌溶液）
[0067]无机磷合成培养基g/L:硫酸铵0.5、硫酸镁0.3、磷酸钙10、氯化钠0.3、葡萄糖10g、 1 %硫酸锰lml、1 %硫酸亚铁lml、纯净水1000ml、琼脂20g、pH=7 · 0~7 · 5
[0068] 将纯化后的所有芽孢杆菌分别点种于蛋黄平板和无机磷合成培养基平板，于37°C 恒温培养96小时，选择在两种培养平板上同时产生透明水解圈的菌落斜面培养物进行保 藏。(冷冻干燥保藏:编号为KY-1)
[0069] (2)杀线虫活性高效筛选
[0070] 按照《微生物学报》54(5):589~594 4 May
[0071] 2014;《解淀粉芽孢杆菌杀线虫活性高效筛选模型》施慧孙帆刘仲仲
[0072]张克勤黄晓玮;云南大学生物资源保护于利用重点实验室
[0073]文献报道，进行操作。选择杀线虫活性高的菌株进行冷冻干燥保藏，编号为KY-2。
[0074] (3)真菌、细菌抗性筛选及蛋白酶活性筛选
[0075]真菌抗性筛选培养基g/L: PDA平板
[0076] 马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉15g、纯净水1000ml、pH = 6.0。于121°C，灭菌 30min。备用。
[0077] 将上述培养基降温至40_50°C，于无菌条件下，倒入直径为90mm的培养皿中，每皿 加入20ml。凝固后，再在其上倒入含有黑曲霉孢子(浓度为105)的上层培养基5ml，迅速混 菌，凝固得真菌抗性筛选平板。
[0078]细菌抗性筛选培养基g/L:普通琼脂平板
[0079] 牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、氯化钠5.0、纯净水1000ml、琼脂粉2.0、pH=7.0~7.2。于 121°C，灭菌30min。备用。
[0080] 将上述培养基降温至40-50°C，于无菌条件下，倒入直径为90mm的培养皿中，每皿 加入20ml。凝固后，在再其上倒入含有大肠杆菌(浓度为10 5)的上层培养基5ml，迅速混菌， 凝固得细菌抗性筛选平板。
[0081] 蛋白酶活性筛选平板g/L:
[0082] 牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、氯化钠5.0、纯净水1000ml、琼脂粉2.0、无菌脱脂牛奶 15ml、pH=7·0~7.2。于121°C，灭菌30min。备用。
[0083] 将上述培养基降温至40-50°C，于无菌条件下，倒入直径为90mm的培养皿中，每皿 加入20ml。凝固后，得蛋白酶筛选平板。
[0084]将纯化得到的产芽孢的单菌落斜面培养物分别同时点种到上述三种筛选平板上， 于37°C恒温培养96小时。选取在这三种筛选平板上同时产生透明水解圈的单菌落斜面培养 物进行冷冻干燥保藏。编号为KY-3.
[0085] 5、液体培养特征
[0086] 液体培养基g/L:牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、氯化钠5 · 0、纯净水1000ml、pH = 7 · 0~ 7.2。于121°0，灭菌3〇111；[11。备用。
[0087]在无菌条件下，取ΚΥ-1、ΚΥ-2、ΚΥ-3的斜面培养物2cm2,接入100ml上述液体培养基 中，静置培养。结果：
[0088]静置时有菌膜形成;革兰氏染色为阳性。显微镜检为杆状，内生芽孢，呈椭圆形，两 端钝圆，芽孢囊不膨大，中生到次端生，有运动型。
[0089] 6、生化特性
[0090]水解淀粉和明胶，乙酰甲基甲醇试验(V-P)阴性、硝酸盐还原试验阴性，以及苯丙 氨酸脱氨酶试验、吲哚试验、甲基红试验、硫化氢试验均为阴性。
[0091] 实施例2 [0092]复合菌剂的制备：
[0093] 1.三株解淀粉芽孢杆菌的培养过程包括以下步骤
[0094] 1)固体斜面菌种的制备
[0095]将3种保藏的菌种分别接种于斜面培养基，于37°C恒温静置培养24h，镜检无杂菌 且芽孢率大于95%，并于4°C冰箱保藏。一年内使用。
[0096] 所使用的斜面配方(重量比）：葡萄糖0.1%、酵母浸粉0.5%、蛋白胨0.1%、牛肉膏 0.5 %、氯化钠0.02 %、氯化钙0.01 %、磷酸氢二钠0.04 %、可溶性淀粉1.4 %、硫酸铵 0.01 %、硫酸锰0 . lmg/L、钼酸钠0 . lmg/L、琼脂粉1.5 %、余量为水。pH = 7.1。121°C，灭菌 30min〇
[0097] 2)摇瓶液体菌种的制备
[0098]将上述获得保藏的优良的3种菌种的新鲜斜面培养物，分别接种于液体摇瓶培养 基中，接种量为2cm2/100ml。于180rpm，30 °C~32°C，恒温振荡培养21h，分别获得各自摇瓶 液体菌种。
[0099]所使用的液体摇瓶配方（重量比）：葡萄糖2.00 %、豆饼粉2.00%、磷酸氢二钾 0.04 %、酵母浸粉0.5 %、硫酸镁0.02 %、蛋白胨0.2 %、蔗糖2.00 %、玉米浆1.00 %、尿素 0.2%、工业盐0.02%、碳酸钙0.02%、泡敌0.1%，余量为水。口!1=7.4。121°(：灭菌 30min。 [0100] 3)所述的三级液体发酵时的发酵培养基配方为重量比
[0101] (1) 一级及二级种子培养基配方
[0102] 葡萄糖2.00 %、豆饼粉2.00 %、磷酸氢二钾0.04%、酵母浸粉0.5 %、硫酸镁 0 · 02 %、蛋白胨0 · 2 %、蔗糖2 · 00 %、玉米浆1 · 00 %、尿素0 · 2 %、工业盐0 · 02 %、碳酸钙 0.02%、泡敌0.1%，余量为水。ρΗ=7·4。
[0103] 121 °C，灭菌30min。
[0104] (2)发酵培养基配方
[0105] 葡萄糖3.00%、豆饼粉4.00%、玉米粉2.00%、花生饼粉0.50 %、棉籽饼粉0.10 %、 玉米浆0.55、酵母浸粉0.75 %、蛋白胨0.16 %、工业盐0.34、碳酸钙0.23 %、余量为水。pH = 6 · 5。121 °C灭菌 30min。
[0106] 4)三级液体发酵包括以下步骤：
[0107] 将上述获得的3种摇瓶液体菌种分别进行三级液体发酵，具体如下：
[0108] (1)一级种子罐种子制备
[0109] 按照一级种子罐培养基配料，于一级种子罐内灭菌。当罐温降至32°C左右时，培养 基体积约为200L，利用火焰接种法接入1000ml的无杂菌的且符合标准的摇瓶种子液。培养 条件:温度30°(：~32°(：，罐压=0.0210^~0.0510^，通气比=1 :0.5~1:0.6;三株菌种的培 养周期分别为:KY-1 14.5h、KY-2 12.5h、KY-l 16.5h。
[0110] (2)二级种子罐种子制备
[0111] 按照二级种子罐培养基配料，于二级种子罐内灭菌，同时将导种管路灭菌（123°C 灭菌60min。），并用无菌空气保压。当罐温降至32°C左右时，培养基体积约为2000L，通过无 菌的移种管路接入200L的无杂菌的且符合标准的一级种子罐种子液。培养条件:温度30°C ~32°C，罐压= 0.03MPa~0.05MPa，通气比=1:0.5~1:0.6;三株菌种的培养周期分别为： KY-1 12h、KY-2 13h、KY-3 12h。
[0112] (3)发酵罐制备
[0113] 按照发酵罐培养基配料，于发酵罐内灭菌，同时将导种管路灭菌（123°C灭菌 60min。），并用无菌空气保压。当罐温降至32°C左右时，培养基体积约为20000L，通过无菌的 移种管路接入2000L的无杂菌的且符合标准的二级种子罐种子液。培养条件:温度30°C~32 。(：，罐压=0 · 04MPa~0 · 07MPa，通气比=1:0 · 8~1:1 · 2。通过流加氨水控制pH=6 · 5-6 · 7，同 时通过流加80%的葡萄糖溶液，控制残糖多1 %，直至pH自然回升(pH多7.5)，停止流加氨水 和葡萄糖溶液，继续培养，直到芽孢率大于90 %，结束发酵。其中，菌种KY-1发酵：周期= 38h，活菌数(平板计数）=145.2亿/ml，残糖=0.23 %，放罐体积=28.3T;菌种KY-2发酵:周 期=33h，活菌数(平板计数）=107.4亿/ml，残糖=0.13 %，放罐体积=25.7T;菌种KY-3发 酵:周期=40.5h，活菌数(平板计数）=115.6亿/ml，残糖=0.22 %，放罐体积=26.4T。
[0114] 5)新型复合菌肥的制作
[0115] (1)液体制剂:将上述发酵所得的符合放罐标准的三株解淀粉芽孢杆菌的发酵液， 按等体积的比例混合，总体积约6T。混合后加入混合液总体积0.5 %的稳定剂，检测活菌数 (平板计数）= 122.8亿/ml。灌装、入库。其中，稳定剂为苯甲酸钠和氨基酸，二者的质量比为 2:1，氨基酸为赖氨酸；
[0116] (2)粉剂制备:将上述发酵所得的符合放罐标准的剩余三株解淀粉芽孢杆菌的发 酵液，按等体积的比例混合，经降膜浓缩设备适当浓缩，加入浓缩后混合液总体积0.5 %的 稳定剂，再加入浓缩后混合液总体积32% %载体充分混合，喷雾干燥而得。检测活菌数(平 板计数）= 235.8亿/ml，包装，入库。所述载体为膨润土、稻壳粉、沸石粉、白炭黑和碳酸钙， 按质量比20:30:20:20:10比例混合。其中，稳定剂为苯甲酸钠和氨基酸，二者的质量比为2: 1，氨基酸为赖氨酸。
[0117] 实施例3
[0118] 与实施例2不同之处在于
[0119] 1、固体斜面菌种的制备
[0120]保藏的菌种接种于斜面培养基，于37°C恒温静置培养24h，镜检无杂菌且芽孢率大 于95%，并于4°C冰箱保藏。一年内使用。
[0121] 所使用的斜面配方(重量比）：葡萄糖0.1%、酵母浸粉0.5%、蛋白胨0.3%、牛肉膏 0.3 %、氯化钠0.2 %、氯化钙0.01 %、磷酸氢二钠0.02%、可溶性淀粉2.0 %、硫酸铵0.01 %、 硫酸锰0 · 4mg/L、钼酸钠0 · 2mg/L、琼脂粉2 · 0%，余量为水。pH=7 · 1。121°C，灭菌30min。
[0122] 2、摇瓶液体菌种的制备
[0123] 保藏的优良的斜面菌种，接种于液体摇瓶培养基中，于180rpm，3(TC~32°C，恒温 振荡培养23h，得摇瓶液体菌种。
[0124] 所使用的液体摇瓶配方（重量比）：葡萄糖3.30 %、豆饼粉1.80%、磷酸氢二钾 0.04 %、酵母浸粉0.5 %、硫酸镁0.04 %、蛋白胨0.5 %、蔗糖1.60 %、玉米浆1.10 %、尿素 0.12%、工业盐0.22%、碳酸钙0.42%、泡敌0.1%，余量为水。pH=7.4，121°C灭菌30min。
[0125] 3、所述的三级液体发酵时的发酵培养基配方为重量比
[0126] (1)-级及二级种子罐配方
[0127] 葡萄糖3.30 %、豆饼粉1.80 %、磷酸氢二钾0.04%、酵母浸粉0.5 %、硫酸镁 0.04%、蛋白胨0.5%、蔗糖1.60%、玉米浆1.10%、尿素0.12%、工业盐0.22%、碳酸钙 0.42%、泡敌0.1%，余量为水<^!1=7.4，121°(：灭菌3〇1^11。
[0128] (2)发酵罐配方
[0129] 葡萄糖4 · 50%、豆饼粉2 · 80%、玉米粉2 · 50%、花生饼粉0 · 50 %、棉籽饼粉0 · 16 %、 玉米浆0.35、酵母浸粉0.75 %、蛋白胨0.16 %、工业盐0.34、碳酸钙0.25 %、余量为水。pH = 7 · 0，121 °C灭菌 30min。
[0130] 所述三级液体发酵包括以下步骤：
[0131] 将上述获得的3种摇瓶液体菌种分别进行三级液体发酵，具体如下：
[0132] (1)一级种子罐种子制备
[0133] 按照一级种子罐培养基配料，于一级种子罐内灭菌。当罐温降至32°C左右时，培养 基体积约为190L，利用火焰接种法接入1000ml的无杂菌的且符合标准的摇瓶种子液。培养 条件:温度30°(：~32°(：，罐压=0.0210^~0.0510^，通气比=1:0.5~1:0.6，三株菌种的培 养周期分别为:KY-1 12h、KY-2 13.5h、KY-3 17h。
[0134] (2)二级种子罐种子制备
[0135] 按照二级种子罐培养基配料，于二级种子罐内灭菌，同时将导种管路灭菌（123°C 灭菌60min。），并用无菌空气保压。当罐温降至32°C左右时，培养基体积约为2000L，通过无 菌的移种管路接入190L的无杂菌的且符合标准的一级种子罐种子液。培养条件:温度30°C ~32°C，罐压= 0.03MPa~0.05MPa，通气比=1:0.5~1:0.6，三株菌种的培养周期分别为： KY-1 12h、KY-2 12.5h、KY-3 12h。
[0136] (3)发酵罐制备
[0137] 按照发酵罐培养基配料，于发酵罐内灭菌，同时将导种管路灭菌（123°C灭菌 60min。），并用无菌空气保压。当罐温降至32°C左右时，培养基体积约为22000L，通过无菌的 移种管路接入2000L的无杂菌的且符合标准的二级种子罐种子液。培养条件:温度30°C~32 。(：，罐压=0 · 04MPa~0 · 07MPa，通气比=1:0 · 8~1:1 · 2。通过流加氨水控制pH=6 · 5-6 · 7，同 时通过流加80 %的葡萄糖溶液，控制残糖彡1 %，直至pH自然回升（回升到pH彡7.5 )，停止流 加氨水和葡萄糖溶液。当芽孢率大于90 %，结束发酵。菌种KY-1发酵:周期=47.5h。活菌数 (平板计数）=105.2亿/ml，残糖=0.43 %。放罐体积=24.3T。菌种KY-2发酵:周期=39h。活 菌数(平板计数）=101 · 4亿/ml，残糖=0 · 23 %。放罐体积=28 · 7T。菌种KY-3发酵：周期= 60.5h。活菌数(平板计数）=125.3亿/ml，残糖=0.22 %。放罐体积=25.4T。
[0138] 4、新型复合菌肥的制作
[0139] (1)液体制剂:将上述发酵所得的符合放罐标准的三株解淀粉芽孢杆菌的发酵液， 按等体积的比例混合，混合后加入混合液总体积约(6T)加入混合液总体积0.8 %的稳定剂， 检测活菌数(平板计数）= 100.2亿/ml。灌装、入库。其中，稳定剂为苯甲酸钠和氨基酸，二者 的质量比为3:2，氨基酸为赖氨酸；
[0140] (2)粉剂制备:将上述发酵所得的符合放罐标准的剩余三株解淀粉芽孢杆菌的发 酵液，按等体积的比例混合，经降膜浓缩设备适当浓缩，加入浓缩后混合液总体积0.8 %的 稳定剂，再加入浓缩后混合液总体积37%载体充分混合(膨润土、稻壳粉、沸石粉、白炭黑、 氨基酸、碳酸钙），喷雾干燥而得。检测活菌数(平板计数）=212.2亿/ml，包装，入库。所述载 体为膨润土、稻壳粉、沸石粉、白炭黑、氨基酸、碳酸钙，按质量比25:5:30:10:30比例混合， 氨基酸为赖氨酸；其中，稳定剂为苯甲酸钠和氨基酸，二者的质量比为3: 2，氨基酸为赖氨 酸。
[0141] 实施例4
[0142] 所述的三株解淀粉芽孢杆菌的培养过程包括以下步骤
[0143] 1、固体斜面菌种的制备
[0144] 保藏的菌种接种于斜面培养基，于37°C恒温静置培养24h，镜检无杂菌且芽孢率大 于95%，并于4°C冰箱保藏。一年内使用。
[0145] 所使用的斜面配方(重量比）：葡萄糖0.9%、酵母浸粉0.5%、蛋白胨0.5%、牛肉膏 0.5 %、氯化钠0.2 %、氯化钙0.01 %、磷酸氢二钠0.04%、可溶性淀粉2.0 %、硫酸铵0.01 %、 硫酸猛〇· lmg/L、钼酸钠0· lmg/L、琼脂粉1.8%，余量为水。pHiiHSrC，灭菌30min。
[0146] 2、摇瓶液体菌种的制备
[0147] 保藏的优良的斜面菌种，接种于液体摇瓶培养基中，于180rpm，3(TC~32°C，恒温 振荡培养24h，得摇瓶液体菌种。
[0148] 所使用的液体摇瓶配方（重量比）：葡萄糖4.3 %、豆饼粉3.2 %、磷酸氢二钾 0.04 %、酵母浸粉0.5 %、硫酸镁0.02 %、蛋白胨0.25 %、蔗糖2.50 %、玉米浆1.20 %、尿素 0.2%、工业盐0.02%、碳酸钙0.2%、泡敌0.1%，余量为水。口!1=7.4。121°(：灭菌30min。
[0149] 3、所述的三级液体发酵时的发酵培养基配方为重量比
[0150] (1)-级及二级种子罐配方
[0151] 葡萄糖4.3 %、豆饼粉3.2 %、磷酸氢二钾0.04 %、酵母浸粉0.5 %、硫酸镁0.02 %、 蛋白胨0.25 %、蔗糖2.50 %、玉米浆1.20 %、尿素0.2 %、工业盐0.02 %、碳酸钙0.2 %、泡敌 0· 1%，余量为水。口!1=7.4。121°〇灭菌30min。
[0152] (2)发酵罐配方
[0153] 葡萄糖4.50%、豆饼粉3.40%、玉米粉1.55%、花生饼粉1.00 %、棉籽饼粉0.50 %、 玉米浆0.35 %、酵母浸粉0.55 %、蛋白胨0.56 %、工业盐0.34 %、碳酸钙0.20 %、余量为水。 pH=7 · 5。121 °C灭菌 30min。
[0154] 所述三级液体发酵包括以下步骤
[0155] (1)一级种子罐种子制备
[0156] 按照一级种子罐培养基配料，于一级种子罐内灭菌。当罐温降至32°C左右时，培养 基体积约为180L，利用火焰接种法接入1000ml的无杂菌的且符合标准的摇瓶种子液。培养 条件:温度30°C~32°C，罐压= 0.02MPa~0.05MPa，通气比=1:0.5~1:0.6<^!1自然。三株菌 种的培养周期分别为:KY-1 16h、KY-2 13h、KY-3 15h。
[0157] (2)二级种子罐种子制备
[0158] 按照二级种子罐培养基配料，于二级种子罐内灭菌，同时将导种管路灭菌（123°C 灭菌60min。），并用无菌空气保压。当罐温降至32°C左右时，培养基体积约为1500L，通过无 菌的移种管路接入180L的无杂菌的且符合标准的一级种子罐种子液。培养条件:温度30°C ~32°C，罐压= 0.03MPa~0.05MPa，通气比=1:0.5~1:0.6<^!1自然。三株菌种的培养周期 分别为:KY-1 13h、KY-2 15h、KY-3 15h。
[0159] (3)发酵罐制备
[0160] 按照发酵罐培养基配料，于发酵罐内灭菌，同时将导种管路灭菌（123°C灭菌 60min。），并用无菌空气保压。当罐温降至32°C左右时，培养基体积约为23000L，通过无菌的 移种管路接入1500L的无杂菌的且符合标准的二级种子罐种子液。培养条件:温度30°C~32 。(：，罐压=0 · 04MPa~0 · 07MPa，通气比=1:0 · 8~1:1 · 2。通过流加氨水控制pH=6 · 5-6 · 7，同 时通过流加80 %的葡萄糖溶液，控制残糖多1 %，直至pH自然回升，停止流加氨水和葡萄糖 溶液。当芽孢率大于90 %，结束发酵。菌种KY-1发酵:周期=48h。活菌数(平板计数）=141.2 亿/ml，残糖=0.23 %。放罐体积=25.3T。菌种KY-2发酵：周期=53h。活菌数(平板计数）= 157.2亿/ml，残糖=0.11 %。放罐体积=27.7T。菌种KY-3发酵:周期=46.5h。活菌数(平板 计数）= 165.0亿/ml，残糖= 0.22%。放罐体积= 26.4T。
[0161] 4、新型复合菌肥的制作
[0162] (1)液体制剂:将上述发酵所得的符合放罐标准的三株解淀粉芽孢杆菌的发酵液， 按等体积的比例混合，混合后加入混合液总体积约(6T)加入混合液总体积1.0 %的稳定剂， 检测活菌数(平板计数）= 118.8亿/ml。灌装、入库。其中，稳定剂为苯甲酸钠和氨基酸，二者 的质量比为5:1，氨基酸为赖氨酸；
[0163] (2)粉剂制备:将上述发酵所得的符合放罐标准的剩余三株解淀粉芽孢杆菌的发 酵液，按等体积的比例混合，经降膜浓缩设备适当浓缩，加入浓缩后混合液总体积1.0 %的 稳定剂，再加入浓缩后混合液总体积35%载体充分混合(膨润土、稻壳粉、沸石粉、白炭黑、 氨基酸、碳酸钙），喷雾干燥而得。检测活菌数(平板计数）=233.2亿/ml，包装，入库。所述载 体为膨润土、稻壳粉、沸石粉、白炭黑、氨基酸、碳酸钙，按质量比35:10:15:20:30比例混合， 氨基酸为赖氨酸；其中，稳定剂为苯甲酸钠和氨基酸，二者的质量比为5:1，氨基酸为赖氨 酸。
[0164] 应用例
[0165] 利用上述实施例获得菌剂在北票市五间房镇科技示范园26号棚(98米）内施用，作 物为西红柿，品种为欧盾粉红，使用时间：2015年秋茬，全程使用。
[0166] 方案设计依据
[0167] 1、测土结果(TC-100 土壤养分速测仪）
[0169] 2、番茄需肥规律
[0170] (1)番茄生命周期内中对1?、1(、0&、1%5种元素吸收比例大约为1 :0.26:1.8:0.74: 〇. 18(质量比）；
[0171] (2)分析番茄整个植株体内氮素、磷素、钾素的质量比例为1:0.4:2
[0172] (3)番茄不同生育时期对养分的吸收量不同，一般随生育期的延长而增加。在幼苗 期以氮营养为主，在第一穗果开始结果时，对氮、磷、钾的吸收量迅速增加，氮在三要素中占 50%，而钾只占32% ;到结果盛期和开始收获期，氮只占36%，而钾已占50%，结果期磷的吸 收量约占15%。番茄需钾的特点是从坐果开始一直呈直线上升，果实膨大期吸钾量约占全 生育期吸钾总量的70%以上。直到采收后期对钾的吸收量才稍有减少。
[0173] (4)番茄氮、磷、钾施肥量的比例应为1:1:2
[0174] 3、施肥方案：（每亩使用）
[0176] 试验方案具体实施
[0177] (1)底肥/亩:上述施肥方案中硅钙镁60斤、复合肥160斤、农家粪5方
[0178] (2)种苗处理:种植前先用本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂粉剂500g提前用红糖 发酵2小时以上，用水稀释500倍后蘸根，移栽种苗；
[0179] (2)定植:本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂粉剂500克和本发明解淀粉芽孢杆菌复 合菌剂液体制剂5公斤混合，而后提前用红糖发酵2小时以上，随缓苗水滴灌。加速生根，控 制死苗率，控制节间生长。
[0180] (3)叶面喷施/亩
[0181] 第一穗果坐住后:采用本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂液体制剂60ml和90斤水混 合，而后叶面喷施，7-10天一次，直到采收结束。
[0182 ] (4)每次浇水时，每亩用本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂粉剂500克和本发明解淀 粉芽孢杆菌复合菌剂液体制剂5公斤，间隔10-15天浇灌一次直到采收一共使用6次。
[0183] 4、使用效果：
[0185] (1)生长同步，坐果率高：往年4~5盆果都坐不住，即使坐果果实也少，不整齐。 2015年在常规用肥基础上使用复合菌剂，秧子长势好，又绿又壮，而且成熟的比较集中，果 实比较实成，最多的坐果是6盆果，少的是5盆果，果实整齐，大小均匀。
[0186] (2)抗病性:减少病虫害的发生。往年的溃疡病没有再出现，农用使用次数减少。
[0187] (3)改良土壤:土质明显疏松，踩上去感觉土壤有弹力
[0188] (4)提尚广量和广品品质，增加收?:和2014年相比广量提尚了30%，西红柿品相 好，大部分做为边贸商品出售，价格同比高0.2元/斤，收入比去年增加了 20000元左右。 [0189]由上述可知施入土壤后，三株解淀粉芽孢杆菌在适宜的条件下复活后，快速繁殖， 一边分解有机质提供植物生长所需的营养物质，一边分泌植物细胞分裂素等，促进植物根 系的生长，加速营养的吸收，同时分泌的短肽、小分子蛋白、有机酸以及高活性的酶类，有效 抑制了根际病原菌及寄生虫的繁殖，起到了生根、促根、护根、健根的作用。对于作物而言， 根好啥都好
[0190] 本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂液体制剂的叶面喷施，使得果肉及果皮细胞等速 分裂，膨果快，裂果明显减少。同时改善口感，酸甜可口。没有出现畸形果。
[0191] 有益微生物的添加，改善了土壤的团粒结构及微生态环境，保水保肥，培肥土壤地 力，为作物的生长营造了有利条件。
[0192] 应用例2
[0193] 利用上述实施例获得菌剂在辽宁凌源东远现代农业基地20号大棚内施用，作物为 青椒(甜椒），使用时间：2015年9月16日~2016年4月30日。
[0194] 施肥依据：
[0195] 1、测土结果(TC-100 土壤养分速测仪）
[0201] 2、青椒(甜椒)的需肥规律
[0202] (1)与番茄、茄子相比，甜椒的需肥特性与它们很相似，也是吸钾量最高，其次是 氮，磷最低。甜椒在蔬菜中属高氮、中磷、高钾类型，需肥总量较多。
[0203] (2)甜椒的生长期长，但根系不发达，根量少，入土浅，不耐旱也不耐涝。它的需肥 量大于番茄和茄子，而且耐肥能力强。每生产1吨甜椒，其养分吸收量为N4.91千克、P 2051.19 千克、K2O6.02千克，其吸收比例为1:0.2:1.2
[0204] (3)甜椒的钙营养也不应忽视，一旦缺钙容易使果实发生脐腐病，从而导致果实质 量大大降低
[0205] 施肥方案/亩
[0206]
[0207]试验方案具体实施
[0208] 1、底肥:上述施肥方案中硅钙镁30公斤/亩和复合肥150kg/亩。
[0209] 使用方法:将以上肥料均匀撒入土壤，深翻，旋耕，起垄，灌足底墒水，待栽。（间隔 3-5天后，栽苗。）
[0210] 2、定植:用本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂粉剂500克/亩和本发明解淀粉芽孢杆 菌复合菌剂液体制剂5公斤/亩，提前发酵3小时以上，用水按500倍溶解稀释，随缓苗水冲施 或滴灌。加速生根，控制死苗率，控制节间生长。
[0211] 3、第一穗果坐住后：叶面喷施:本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂液体制剂用水稀 释600倍，叶面喷施，10天一次，直到采收结束前。
[0212] 4、每次浇水时，用本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂液体制剂5公斤/亩，冲施或滴 灌，本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂液体制剂最少使用3次。
[0213] 5、其他大棚受冻害后的补救方案:每个受害大棚，使用本发明解淀粉芽孢杆菌复 合菌剂粉剂和本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂液体制剂混合，而后用水进行400倍稀释，联 合冲施，间隔7天一次，连续3次。
[0214]使用背景：
[0215] 2016年1月份，当地气温较往年同期偏低4°C~5°C，室外达零下23°C.2016年1月20 日上午9点左右，园区突然停电6个小时以上，护棚帘无法放下。十多天的低温，再加上停电 影响，导致冻害大面积发生，对照组的近80个大棚的青椒秧苗已没有生长点，花少。比去年 同期减产约三分之二。每天出货只有20吨左右。而实验处理组的青椒秧苗没有受到丝毫的 冻害影响，长势旺盛，硕果累累。于是我们用同样的处理方法，对发生冻害的对照组的80个 大棚进行补救，10天后，生长点重新分化，开花结果。弥补了损失。
[0216]使用效果：
[0217] 上述实施例获得的本发明解淀粉复合菌剂的实际应用，充分验证了其抗逆性，尤 其是抗寒性。
[0218]
[0219]试验棚20号大棚的综合表现：
[0220] 1、移栽后缓苗期短，生根快，成活率高。
[0221 ] 2、生长期枝粗叶茂，能够抗冻害、抗重茬，抑制细菌病害。
[0222] 3、生长周期长，花匀果多。
[0223] 4、果大均匀、商品率高，提高产量，增加效益。
[0224]综上所述施用上述本发明获得的解淀粉芽孢杆菌复合菌剂具有如下特点：
[0225] 1、基肥:甜椒由于生长期长，根系较弱，为了定植后及时促进幼苗生长和后期植株 多坐果，使用本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂液体制剂的粉剂和液体制剂的500倍水稀释 液蘸根，定植后又作为缓苗水使用。一来，加速解淀粉芽孢杆菌活菌的繁殖，二来，复合菌固 体粉剂中的代谢产物可以杀死幼苗根部携带的病原菌，液体制剂中的植物免疫修复剂，可 以修复在分苗过程中受伤的根部细胞，使受伤的创面快速愈合，防止病原菌的侵入。起到了 生根、促根、护根、健根的作用，所以，秧苗的成活率明显提高。
[0226] 2、追肥："上喷"三株复合菌液体制剂；"下灌"本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂液 体制剂的粉剂和液体制剂的400倍水稀释液，最少3次以上。三株功能性解淀粉芽孢杆菌的 活菌，遇到适宜的条件迅速繁殖，产生抑菌杀虫促生长的代谢产物，快速降低根剂土壤中的 有害微生物，促进根系发育，诱导作物产生抗逆性，所以，生长期枝粗叶茂，能够抗冻害、抗 重茬，抑制细菌病害。这也是"补救方案"的原理所在。
[0227] 应用例3
[0228]利用上述实施例获得的菌剂，在辽宁新民柳河沟苹果园施用，作物为寒富苹果，苹 果树现状:树龄6年，2015年的果已套袋，有部分果树出现了根腐病，叶片卷曲。根腐病严重 的10棵树已濒临死亡，园主已经决定放弃治疗。
[0229] -、针对10颗病树的治疗方案：
[0230] 1、根治根腐病
[0231] (1)清创病灶:剥掉腐烂处的树皮，将变色坏死的"木质部"挖掉。
[0232] (2)病树处理:将本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂液体制剂经水稀释的300倍稀释 液，取远离病区的深层土壤(30厘米以下，尽量减少病原菌的数量），和成泥巴，粘在已经清 创的患处，然后用洁净的透气性良好的布条缠住，等待愈合。
[0233] (3)同时，利用本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂的粉剂和液体制剂的混合物经水 稀释的400倍稀释液进行灌根。连续2次，间隔7-10天
[0234] 二、针对正常生长的果树:提升果实品质的方案
[0235] 在果实膨大期和着色期联合使用本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂液体制剂经水 稀释的300倍稀释，结合常规使用的叶面喷施用肥进行喷施。间隔7-10天，连续喷施2-3次
[0236] 三、使用效果：
[0237] 1、濒临死亡的10棵苹果树神奇般地起死回生。不仅重新生根发叶，而且长势很好， 开花结果。
[0238] 2、其他正常的果树，在技术人员指导下，在果实膨大期和着色期联合使用本发明 解淀粉复合菌剂液体制剂经水稀释的300倍稀释，结合常规使用的叶面喷施用肥进行喷施。 果大均匀，色泽一致，果表鲜亮，口感脆甜，抗氧化，耐储存，受到客户的一致好评，争相购 买。
[0239] 施用上述实施例获得复合菌剂后濒临死亡的10棵苹果树神奇般地起死回生，具体 如下：
[0240] (1)根腐病发病机理:该病常与怄根症状相似，属真菌病害。病菌在土壤中和病残 体上过冬，一般多在3月下旬至4月上旬发病，5月进入发病盛期。发病的根茎：
[0241] (2)本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂中含有的三株功能性解淀粉芽孢杆菌的活菌 液体制剂，具有快速修复受损细胞的功能，能使清创后的病灶处受损的植物细胞恢复正常 的生理功能；另外含有的三株解淀粉芽孢杆菌的代谢产物，有效抑制了病原菌的侵入，为新 生细胞的生长繁殖创造了安全的环境。
[0242] (3) "治标"更要"治本"：根腐病实际是真菌性的土传病害，由于根部腐烂，吸收水 分和养分的功能逐渐减弱，最后全株死亡。主要表现为整株叶片发黄、枯萎。所以，只有根除 "根腐病"的病原菌，才能从根本上杜绝根腐病的发生。利用本发明解淀粉复合菌剂液体制 剂的粉剂和液体制剂混合的，经水稀释的400倍稀释液进行灌根。连续2次，间隔7-10天。其 中有益的活的解淀粉芽孢杆菌的芽孢在土壤中，遇到适宜的萌发的条件(温度、湿度、空气、 有机质)大量的快速繁殖，分泌抑制细菌性和真菌性的代谢产物(短肽、小分子蛋白质、有机 酸、高活性酶类等），以此作为其有利的武器与土传病害的病原菌进行"殊死搏斗"，为作物 根系的发育创造了有利环境。抑制根系腐烂的恶化。
[0243] 并且在果实膨大期和着色期联合使用本发明解淀粉芽孢杆菌复合菌剂液体制剂 经水稀释的300倍稀释液，结合常规叶面喷施用肥进行喷施。间隔7-10天，连续喷施2-3次。 提升果实品质。
[0244] 采用上述实施例获得复合菌剂，因其含有丰富的高活性代谢产物，能够保花保果， 提高坐果率;能够加快果肉及果皮细胞等速分裂，配合叶面喷施，快速吸收利用微量元素， 提高肥料的利用率，进而提升果实品质，具有单果重量增加、色泽鲜艳、抗氧化、改善口感的 功效。
【主权项】
1. 一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：解淀粉芽孢杆菌（B a C i I I u S amy Io liquefac iens)分别为：CGMCCNO · 12306 (KY-I)、CGMCCNO · 12307 (KY-2)、 CGMCCN0.12308 (KY-3 )，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年3月24日。2. -种复合菌剂，其特征在于:将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌分别经过三级液体发 酵，而后按体积比（5~1):(1~5):(5~1)比例将发酵液混合即获得复合菌剂。3. 按权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于:所述复合菌剂中上述菌株分别经三级液 体发酵后的发酵液中芽孢率彡90 %，血球活菌计数彡100亿/ml，残留葡萄糖彡0.6 %，pH = 7 · 0~8·0〇4. 按权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于:将按上述比例混合的混合发酵液中加入 混合发酵液体积0.1~2.0 %的稳定剂，即获得液体制剂。5. 按权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于:将按上述比例混合的混合发酵液经降膜 浓缩至混合发酵液体积的1/2-1/3，而后加入浓缩后混合发酵液体积0.1~2.0 %的稳定剂 和浓缩后混合发酵液体积30 %~40 %的载体，加入后充分混合，混合后喷雾干燥，即得复合 菌粉剂。6. 按权利要求4或5所述的复合菌剂，其特征在于：所述稳定剂为苯甲酸钠和/或氨基 酸;载体为膨润土、稻壳粉、沸石粉、白炭黑和碳酸钙;其中，氨基酸为赖氨酸。7. -种权利要求2所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于： 将3种解淀粉芽孢杆菌的液体种子液分别按0.5%~1 %接种至一级种子罐培养基内， 于30°C~32°C，罐压= 0.02MPa~0.05MPa，通气比=1:0.5~1:0.8，一级种子罐周期=1211 ~24h下进行一级发酵培养至生物量多10%，菌体形态一致，短杆状，两端平齐，着色均一， pH自然回升至6.5~7.0,待用； 将上述一级发酵培养液按1-15%接种至二级种子罐培养基内，于30°C~32°C，罐压= 0.02MPa~0.05MPa，通气比=1:0.5~1:0.8，二级种子罐培养周期=12h~24h下进行二级 发酵培养至生物量多10%，菌体形态一致，短杆状，两端平齐，着色均一，pH自然回升至6.5 ~7.0,待用； 将上述二级发酵培养液2-15%接种至发酵罐培养基内，于30°C~32°C，罐压=0.04MPa ~0.07MPa，通气比=1:0.8~1:1.24!1 = 6.5-6.7;待口!1自然回升4!1 = 7.0~8.0流加80% 的葡萄糖溶液，周期= 30h~72h，即分别获得三级发酵液;在配糖罐中配制80%的葡萄糖溶 液并于115°C、20分钟灭菌消毒，降温至30°C后，加入量为每分钟IOL~15L，而后按照体积比 (5~I): (1~5): (5~1)比例将发酵液混合即获得复合菌剂。8. 按权利要求7所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于:将按上述比例混合的混合发 酵液中加入混合发酵液体积0.1-2.0%的稳定剂，即获得液体制剂。9. 按权利要求7所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于:将按上述比例混合的混合发 酵液经降膜浓缩至混合体积的1/2-1/3，而后加入浓缩后体积0.1-2 %的稳定剂，再加入浓 缩后体积30 %~40 %的载体充分混合，喷雾干燥而得复合菌粉剂。10. 按权利要求8或9所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于:所述稳定剂为苯甲酸钠 和/或氨基酸;载体为膨润土、稻壳粉、沸石粉、白炭黑和碳酸钙;其中，氨基酸为赖氨酸。
【文档编号】A01P21/00GK105950519SQ201610559353
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】张传军, 张晓红, 张中亲, 白玉红, 李冰洁
【申请人】北京康缘益生生物科技有限公司