一种选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的培养基及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的培养基及其制备方法，在NAC基础培养基中添加了处于对数生长期的铜绿假单胞菌的培养上清液和抗生素组合。所述培养上清液中含有铜绿假单胞菌分泌的群体感应物质，能加快细菌的生长并促进铜绿色素的分泌，大大缩短了检测时间；所述抗生素组合包括碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类抗生素，各抗生素的添加量均为0.016g/L，能特异性抑制敏感铜绿假单胞菌株和单一药物耐药铜绿假单胞菌株的生长，达到选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的目的，特异性强，灵敏度高。而且，这种培养基能长时间保存，能有效应用于临床样本中广泛耐药铜绿假单胞菌的快速检测。
【专利说明】
一种选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的培养基及其制 备方法
技术领域
[0001] 本发明属于病原微生物学领域，具体涉及一种选择性分离培养广泛耐药铜绿假单 胞菌的培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，能引起化脓性病变，感染后因脓汁和渗 出液呈绿色，故又名绿脓杆菌，是临床上重要的条件致病菌之一。铜绿假单胞菌感染可发生 在人体任何部位和组织、常见于烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道，也可引起心内 膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症，甚至导致严重的呼吸道感染，如肺部慢性纤维化患者的感 染。由于耐药性强和生物被膜的形成，铜绿假单胞菌感染很难治愈。
[0003]在临床样本检验中，常常通过使用血液琼脂培养基培养从检测样本中的众多菌落 中挑取高度怀疑的菌落进行分离培养，并在确认所培养聚落无杂菌污染后，再对该培养菌 落进行系统鉴定和药物敏感性实验。该传统检测方法检测时间常常达72小时或以上，耗时 较长。目前认为使用NAC琼脂培养基能够大大缩短检测时间的常用培养基，但该培养基配方 中含有能影响铜绿假单胞菌生长速度的奈叮酸抗生素，使得该检测方法也需48小时。另外， 上述检测方法往往只能从几百或上千菌落中挑选出1~3个菌落进行药物敏感性试验，容易 漏检耐药菌株，灵敏度较低。
[0004] 细菌产生自诱导物质(autoinducers，AIs)作为细菌间相互联系的信号分子，其浓 度随着细菌的增殖而升高。由于该信号分子能自由通过细胞膜，因此细胞内外的浓度相近。 当该信号分子浓度达到一定范围，能激活细菌胞内的受体，从而改变基因表达，调控细菌的 生物行为，如产生毒素、形成生物膜、生成孢子和产生荧光等，这种现象就是群体感应 (quorum sensing，QS)。目前研究较多的革兰阴性菌的群体感应物质为N-酰基高丝氨酸内 酯(N-acylhomoserine lactones，AHLs)，能促进铜绿假单胞菌分泌绿脓菌素时间提前，但 是由于该类群体感应物质分子量及其相近，分离纯化难度大，纯化成本较高。另外，细菌的 群体感应物质是极为复杂的，人为地往培养基中添加一种单一物质，在不同条件下效果会 不一样。
【发明内容】
[0005] 为克服上述技术缺陷，本发明的目的在于提供了一种选择性分离培养广泛耐药铜 绿假单胞菌的培养基及其制备方法，能有效缩短检测时间，并具有灵敏度高以及操作简便 的特点。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供的一种选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的培 养基，包括NAC基础培养基、培养上清液、蒸馏水和抗生素组合;所述培养上清液为处于对数 生长期的广泛耐药铜绿假单胞菌的培养上清液;所述培养上清液与蒸馏水的体积比为1:19 ~1:4;所述抗生素组合中的各抗生素的添加量均为0.016g/L。
[0007] 优选的，所述NAC基础培养基的配方为蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁 0 · 2g/L、溴棕三甲铵0 · 2g/L、萘啶酸0 · 015g/L和琼脂15g/L。
[0008] 优选的，所述上清液中含有铜绿假单胞菌分泌的群体感应物质，所述群体感应物 质为N-酰基高丝氨酸内酯。
[0009] 优选的，所述抗生素组合包括碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类 抗生素。
[0010] 优选的，所述碳青霉烯类抗生素为亚胺培南，所述氨基糖苷类抗生素为阿卡米星， 所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星。
[0011]优选的，所述培养上清液与所述蒸馏水的体积比为1: 9。
[0012] 本发明还提供了上述培养基的制备方法，该方法包括如下步骤：
[0013] (1)采用脑心浸液肉汤(BHI)液体培养基接种培养铜绿假单胞菌至对数生长期，离 心，取上清液，并使用直径为0.22μπι的灭菌灭菌过滤器过滤灭菌，获得培养上清液；
[0014] (2)按NAC基础培养基配方称取蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、 溴棕三甲铵〇. 2g/L、萘啶酸0.015g/L和琼脂15g/L，加入步骤（1)获得的培养上清液和蒸馏 水，混匀，121°C高压灭菌25min;所述培养上清液与蒸馏水的体积比为1:19~1:4;
[0015] (3)灭菌后放置室温冷却至60°C后分别添加抗生素组合，混匀，室温冷却。
[0016] 优选的，所述步骤(2)中所述培养上清液与所述蒸馏水的体积比为1:9。
[0017]优选的，所述步骤(3)中所述抗生素组合包括碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生 素和喹诺酮类抗生素，所述碳青霉烯类抗生素为亚胺培南，所述氨基糖苷类抗生素为阿卡 米星，所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星。
[0018] 优选的，所述亚胺培南、所述阿卡米星和所述环丙沙星的添加量均为0.016g/L。
[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0020] (1)本发明培养基利用了培养上清液中的群体感应物质，可促进铜绿色素的分泌， 缩短检测时间。
[0021] (2)本发明培养基包括抗生素组合，能特异性抑制敏感铜绿假单胞菌株和单一药 物耐药铜绿假单胞菌株的生长，达到选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的目的，特异 性强，灵敏度高。
【具体实施方式】
[0022]为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。
[0023]实施例1:添加铜绿假单胞菌培养上清液的NAC培养基与添加 N-酰基高丝氨酸内酯 的NAC培养基的效果比较
[0024]往NAC培养基中添加铜绿假单胞菌培养上清液所制备得到的培养基是本发明培养 基的一个优选实施例，以下是本优选实施例的具体实验步骤：
[0025] 1、NAC培养基的制备
[0026] 称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸0.015g、 琼脂15g，并溶于1L蒸馏水中，混匀，于121°C高压灭菌25min后浇注到无菌平板上，室温冷 却，获得NAC培养基琼脂平板，设为对照组1。
[0027] 2、添加 N-酰基高丝氨酸内酯的NAC培养基的制备
[0028] 称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸0.015g、 琼脂15g，加入lOmmol的N-酰基高丝氨酸内酯（Sigma-Aldrich)和1L蒸馏水，混匀，121°C高 压灭菌25min后浇注到无菌平板上，室温冷却，获得添加 N-高丝氨酸内酯的NAC培养基琼脂 平板，设为对照组2。
[0029] 3、添加不同比例的铜绿假单胞菌培养上清液的NAC培养基的制备
[0030] (1)采用脑心浸液肉汤(BHI)液体培养基接种培养铜绿假单胞菌(ATCC27853株)至 对数生长期，l〇〇〇〇g离心5分钟，取上清液，并使用直径为0.22μπι的灭菌过滤器过滤灭菌，获 得培养上清液。
[0031] (2)称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸 0.015g、琼脂15g，加入50mL铜绿假单胞菌的培养上清液和950mL蒸馏水，混匀，121°C高压灭 菌25min后浇注到无菌平板上，室温冷却，获得铜绿假单胞菌培养上清液和蒸馏水体积比为 1:19的NAC培养基琼脂平板A，设为实验组1。
[0032] (3)称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸 0.015g、琼脂15g，加入100mL铜绿假单胞菌的培养上清液和900mL蒸馏水，混匀，121°C高压 灭菌25min后浇注到无菌平板上，室温冷却，获得铜绿假单胞菌培养上清液和蒸馏水体积比 为1:9的NAC培养基琼脂平板B，设为实验组2。
[0033] (4)称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸 0.015g、琼脂15g，加入200mL铜绿假单胞菌的培养上清液和800mL蒸馏水，混匀，121°C高压 灭菌25min后浇注到无菌平板上，室温冷却，获得铜绿假单胞菌培养上清液和蒸馏水体积比 为1:4的NAC培养基琼脂平板C，设为实验组3。
[0034] 3、取10 0株从临床样本中分离纯化获得的铜绿假单胞菌（经梅里埃VI T EK 2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定），分别接种在以上培养基琼脂平板上，36°C ~37.5°C培养8h后，观察这些细菌分别在对照组和试验组上的菌落大小和荧光深浅，荧光 强度检测使用Millinodi.Quantum，紫外线波长350nm〇
[0035] NAC培养基是一种临床样本检测中用于检测铜绿假单胞菌的常规培养基，检测时 间为24~48h。表1为本优选实施例的实验结果，通过对比发现，铜绿假单胞菌在以上培养基 中培养8h后，对照组1中的菌落较小，荧光值偏低，而添加了具有促进铜绿假单胞菌生长作 用的群体感应物质的对照组2中的菌落较大，菌落表现为铜绿色，荧光值较高;3组实验组中 的菌落较大且有铜绿色素分泌，荧光值较高，其中以实验组2的促铜绿假单胞菌生长的作用 最为明显。该实验结果说明处于对数生长期的铜绿假单胞菌的培养上清液中含有适量的细 菌群体感应物质，能有效促进铜绿假单胞菌的生长，促进铜绿色素分泌时间提前。因此，本 发明创造采用进入对数生长期的铜绿假单胞菌的培养上清液代替单一的群体感应物质N-酰基高丝氨酸内酯，作为本发明培养基中的关键组分，并且当铜绿假单胞菌培养上清液和 蒸馏水的体积比为1:9时获得最优实验效果。
[0036] 表1
[0038]实施例2:选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌培养基的制备及其与NAC培养基 的效果比较
[0039]进一步地，结合实施例1所获得的实验结果，往NAC培养基中同时添加抗生素组合 以及处于对数生长期的铜绿假单胞菌的培养上清液是本发明培养基的一个优选实施例，以 下为具体实验步骤：
[0040] 1、NAC培养基的制备
[00411 称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸0.015g、 琼脂15g，并溶于1L蒸馏水中，混匀，于121°C高压灭菌25min后浇注到无菌平板上，室温冷 却，获得NAC琼脂平板，设为对照组。
[0042] 2、选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的培养基的制备
[0043] (1)采用BHI液体培养基接种培养铜绿假单胞菌至对数生长期，10000g，离心5分 钟，取上清液，使用直径为〇. 22μπι的灭菌过滤器过滤灭菌，获得培养上清液。
[0044] (2)称量蛋白胨20g、磷酸氢二钾0.3g、硫酸镁0.2g、溴棕三甲铵0.2g、萘啶酸 0.015g、琼脂15g，加入100mL培养上清液和900mL蒸馏水，混勾，121°C高压灭菌25min。
[0045] (3)灭菌后放置室温冷却至60°C后分别添加亚胺培南、阿卡米星和环丙沙星，各抗 生素的添加量均为0. 〇16g，混匀，浇注到无菌平板上，放置冷却，获得选择性分离培养广泛 耐药铜绿假单胞菌琼脂平板，设为实验组。
[0046] 3、从临床样本中分离纯化获得的12株药物敏感铜绿假单胞菌、15株单一药物耐药 铜绿假单胞菌和23株广泛耐药铜绿假单胞菌(经梅里埃VITEK 2Compact全自动细菌鉴定及 药敏分析系统鉴定），分别在以上两种琼脂平板上进行培养，24h后，并观察这些细菌是否能 在这两种培养基平板上生长及其菌落形态，观察方法同实施例1。
[0047] 表2为本优选实施例的结果，在对照组中，敏感菌、单一耐药菌和广泛耐药菌3种菌 均能在NAC培养基中生长，而且菌落大小及荧光值菌无明显差别；在实验组中，仅广泛耐药 菌能在同时添加了培养上清液和抗生素组合所制备得到的培养基中生长，形成铜绿色菌 落，且大小与对照组肉眼观察无明显差异。该结果说明了本发明培养基特异性强，能有效选 择性分离广泛耐药铜绿假单胞菌，实现对广泛耐药铜绿假单胞菌的特异性检测。
[0048] 表 2
[0050] 实施例3:选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌培养基的保质期测试
[0051] 1、将实施例2中所制备的未经测试的空白平板于4°C冰箱中储存一周、1个月和3个 月后取出培养基平板，作为实验组。
[0052] 2、制备NAC培养基琼脂平板，作为对照组。
[0053] 3、分别在以上两种培养基平板接种从临床样本中分离纯化获得的药物敏感铜绿 假单胞菌、单一药物耐药铜绿假单胞菌和广泛耐药铜绿假单胞菌，培养24h后，观察这些细 菌是否能在这两种培养基平板上生长及其生长形态。
[0054] 表3为实验结果，由表3结果可见，药物敏感株和单一药物耐药株在试验组中无生 长，广泛耐药株能在实验组上生长且形成铜绿色菌落，这三种类型铜绿假单胞菌均在对照 组中形成铜绿色菌落，与实施例2实验结果一致。说明该选择性分离培养广泛耐药铜绿假单 胞菌的琼脂平板在储存上述时间后仍有效，说明本发明培养基耐储存，保存性能良好。
[0055] 表 3
[0057] 实施例4:阴性对照试验
[0058] 进行实施例3的同时进行了阴性对照试验，在本发明的一种选择性分离培养广泛 耐药铜绿假单胞菌培养基制备的琼脂平板上，接种从临床上分离得到的耐甲氧西林葡萄球 菌(MRSA)、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs酶）阳性大肠杆菌、肺炎克雷博菌、表皮葡萄球菌、屎肠 球菌、粪肠球菌和不动杆菌，培养24h后均未见生长，说明本发明培养基特异性较好。
[0059]最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对发明专利保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，在不脱离本发明技术方案的实质和范围的前提下，还可以对本发明的技术方案做出 修改或者等同替换，这些都属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种选择性分离培养广泛耐药铜绿假单胞菌的培养基，其特征在于，所述培养基包 括NAC基础培养基、培养上清液、蒸馏水和抗生素组合； 所述培养上清液为处于对数生长期的广泛耐药铜绿假单胞菌的培养上清液； 所述培养上清液与所述蒸馏水的体积比为1:19~1:4; 所述抗生素组合中的各抗生素的添加量均为〇.〇16g/L。2. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述NAC基础培养基的配方为蛋白胨 20g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、溴棕三甲铵0.2g/L、萘啶酸0.015g/L和琼脂15g/ L03. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养上清液中含有铜绿假单胞菌分 泌的群体感应物质，所述群体感应物质为N-酰基高丝氨酸内酯。4. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述抗生素组合包括碳青霉烯类抗生 素、氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类抗生素;所述碳青霉烯类抗生素为亚胺培南，所述氨基糖 苷类抗生素为阿卡米星，所述喹诺酮类抗生素为环丙沙星。5. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养上清液与所述蒸馏水的体积比 为 1:9〇6. 权利要求1-5之一所述的培养基的制备方法，其特征在于，所述培养基的制备方法包 括如下步骤： (1) 采用脑心浸液肉汤液体培养基接种培养铜绿假单胞菌至对数生长期，离心，取上清 液，并使用直径为〇. 22μπι的灭菌过滤器过滤灭菌，获得培养上清液； (2) 按NAC基础培养基配方称取蛋白胨20g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.2g/L、溴棕 三甲铵0.2g/L、萘啶酸0.015g/L和琼脂15g/L，加入蒸馏水和所述步骤（1)获得的培养上清 液，混匀，121°C高压灭菌25min;所述培养上清液与蒸馏水的体积比为1:19~1:4; (3) 灭菌后放置室温冷却至60°C后分别添加抗生素组合，混匀，室温冷却。7. 根据权利要求6所述的培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述培养上 清液与所述蒸馏水的体积比为1: 9。8. 根据权利要求6所述的培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述抗生素 组合包括碳青霉烯类抗生素、氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类抗生素。9. 根据权利要求6所述的培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述碳青霉 烯类抗生素为亚胺培南，所述氨基糖苷类抗生素为阿卡米星，所述喹诺酮类抗生素为环丙 沙星。10. 根据权利要求9所述的培养基，其特征在于，所述亚胺培南、所述阿卡米星和所述环 丙沙星的添加量均为0. 〇16g/L。
【文档编号】C12R1/385GK105950521SQ201610580754
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月21日
【发明人】李小锋, 李晨阳, 金京勋, 黄金玲, 莫纯聪, 李云飞, 张美芳
【申请人】广东和信健康科技有限公司