一种高产l-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种高产L?赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法。该方法将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的NCgl1221基因失活后构建获得，NCgl1221基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供一种高产L?赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株的构建方法，构建的该菌株由于内源基因NCgl1221失活引起谷氨酸胞外分泌量明显降低，与野生型相比，该菌株可生产高浓度的L?赖氨酸，并能有效降低发酵液副产物谷氨酸的含量，作为L?赖氨酸生产菌株能够进一步降低生产和纯化成本。
【专利说明】
一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建方法，属于生物技 术技术领域。
【背景技术】
[0002] L-赖氨酸属于天冬氨酸家族氨基酸，是人和动物体八大必须氨基酸之一。L-赖氨 酸具有多种生理功能，如具备平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质 的吸收及利用率和促进机体生长发育等，因而被广泛应用于饲料、食品及医药行业中。由于 市场需求旺盛，L-赖氨酸目前已成为仅次于谷氨酸的第二大氨基酸品种，年产量约350万 吨。工业上生产L-赖氨酸的方法主要有三种，即蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法。 其中微生物发酵法由于具有低成本、高产率、低污染等优势成为目前L-赖氨酸生产的主流 方法。
[0003] 目前可用于L-赖氨酸生产的微生物主要为细菌，包括棒状杆菌、短杆菌、念球菌、 假单胞菌、芽孢杆菌、埃希氏菌等，其中以属于棒状杆菌属的谷氨酸棒状杆菌目前应用最为 广泛。虽然自然界微生物能够直接发酵产生L-赖氨酸，但产量通常较低，因此需要对微生物 进行改造。如中国发明专利CN1539015公开了包括accBC、accDA、catA、cysD、cysE在内的多 个可用于赖氨酸产量提高的基因改进位点。中国专利文献CN10 1600796(申请号 200780048626 · 8)、CN1974760(申请号200610163142 · 5)、CN103243042(申请号 201310092638.8)分别对基因从^22534、从^11835、％821090进行失活获得一系列1^-赖氨酸 产率提高的谷氨酸棒状杆菌工程菌。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌的 构建方法。本发明通过改造菌株谷氨酸棒状杆菌获得，具体策略为失活谷氨酸棒状杆菌内 源基因 NCgll221(编码谷氨酸胞外转运蛋白）以降低赖氨酸发酵过程中谷氨酸的胞外分泌， 减少L-赖氨酸发酵时发酵液中副产物谷氨酸的含量，使更多的碳流量流向L-赖氨酸合成方 向，提高L-赖氨酸发酵底物利用率，便于纯化。
[0005] 术语说明
[0006] 本发明中，"失活"可以通过本领域已知的任何失活方法来诱导。"失活"产生的效 果是指内源基因 NCgll221的表达被降低到很低的水平，或者产生不表达基因以及尽管被表 达但表达不具有活性或活性降低的产物。
[0007] 本发明中，"失活"可以通过基因工程手段在内源基因 NCgll221中插入一个或多个 碱基对，或者缺失该内源基因 NCgl 1221中的一个或多个碱基对，或者由基因内部序列转换 或颠换获得。
[0008] 本发明技术方案如下：
[0009] -种高产L -赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，是将谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)的NCgll221基因失活后构建获得，NCgll221基因编码框的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[00?0] 根据本发明优选的，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源于 中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 23604。
[0011 ]根据本发明优选的，上述构建方法，步骤如下：
[0012] (1)通过PCR扩增NCg 11221基因编码框内一段长度大于400bp的基因片段作为同 源臂序列，NCgll221基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0013] ⑵通过PCR扩增抗性标签基因片段；
[0014] (3)将步骤（1)制得的同源臂序列与步骤（2)制得的抗性标签基因片段进行重叠 PCR进行连接，制得融合片段的两末端均含有相同的限制性内切酶酶切位点，并且该酶切位 点不能出现在拟敲除基因和抗性标签基因中；
[0015] (4)制备谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，将步骤(3)制得的融合基因经酶切后转化谷 氨酸棒状杆菌感受态细胞，即得。
[0016] 根据本发明进一步优选的，所述步骤（1)中，PCR扩增以谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)的基因组DNA为模板，获得同源臂NCgl，PCR扩增引物的核 苷酸序列如下：
[0017] FI:CGGGATCCCGTTTTTCATGCTTGCCGTCT；
[0018] Rl：AAGGCCAGCAAAA GCTAAAGCCCAAGAATGCAAC；
[0019] PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μ1: 2xHiFi-PCR maslcr 25μ1 FI (ΙΟμηιοΙ/L) 2μ1
[0020] Rl (10uniol/L) 2μ1 模板 2μ1 dd Η20 19μ1；
[0021] PCR扩增程序如下：
[0022] 95 °C 预变性 5min; 94°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 个循环；72 。(:延伸 10min，4°C 保存。
[0023] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增模板为穿梭质粒pHTOl(购自杭州宝 赛生物科技有限公司）的DNA，获得氯霉素抗性基因 Cnf;PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
[0024] F2:GGTGGTCGGCATTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；
[0025] R2：CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；
[0026] PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μ1: 2xHiFi-PCR maslcr 25μ1 F2 (ΙΟμηιοΙ/L) 2μΙ
[0027] R2 ( 10 μ mol/L) 2μΙ 模板 2μ1 dd Η20 19μΙ ：
[0028] 所述的PCR扩增程序如下：
[0029] 95 °C 预变性 5min; 94°C 变性 30sec，55 °C 退火 30sec，72 °C 延伸 3min，30 个循环；72°C 延伸10min，4°C保存。
[0030] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，重叠 PCR的第一阶段扩增体系如下，总体系为 25μ1： 2xHiFri-PCR master 12.5μ1 NCg! 2μ1
[0031] CnV. 2μ1 dd Η2〇 8.5μ1
[0032] 重叠 PCR的第一阶段扩增程序如下：
[0033] 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 2min，5 个循环；72°C 延伸lOmin;
[0034] 重叠 PCR的第二阶段扩增体系为在第一阶段扩增后的产物基础上加入如下成分， 总体系为50μ1: 2.xHiFi-PCR master 12.5μ1 FI UOumol/L) 2μ1
[0035] ,. 、 R2 Cl〇iamol/L) :2μ1 dd H20 8 5μΙ
[0036] 重叠 PCR的第二阶段扩增程序如下：
[0037] 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 4min，30 个循环；72°C 延伸10min，4°C保存。
[0038]根据本发明优选的，所述步骤(4)的具体步骤如下：
[0039] (i)挑取谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)单菌落，在种子培养基 中培养至菌体浓度OD600为0.7~0.9，置于冰上冷却，冷却后离心，用预冷的电转缓冲液洗涤 菌体3~5次，电转缓冲液重悬菌体，制得感受态细胞；
[0040] (i i)对步骤(3)制得的融合基因进行单酶切，28~32 °C酶切2~5h，高压电击转化 至步骤（i)制得的感受态细胞中，移入液体复苏培养基，在28~32°C培养3~4h后，筛选，即 得。
[0041 ]根据本发明进一步优选的，所述步骤(ii)中单酶切体系如下，总体系为40μ1:
[0042] l〇xK BuiTcr 4μ1 限制性内切酶BamHI 4μ!
[0043] ΜΓ以-Cnf (融合基因） 20μ丨 ddH：0 12μ!,
[0044] 根据本发明进一步优选的，所述步骤(i)中，种子培养基，每升组分如下：
[0045] 蛋白胨8~12g、酵母粉4~6g、氯化钠8~12g、山梨醇85~96g。
[0046] 根据本发明进一步优选的，所述步骤(i)中，电转缓冲液，每升组分如下：
[0047] 山梨醇85~96g、甘露醇85~96g、甘油95~105mL。
[0048] 根据本发明进一步优选的，所述步骤（i)中，高压电击转化的条件为：2100V电击 5ms 〇
[0049]根据本发明进一步优选的，所述步骤(ii)中液体复苏培养基，每升组分如下：
[0050] 蛋白胨8~12g、酵母粉4~6g、氯化钠8~12g、山梨醇85~96g、甘露醇65~73g。
[0051]上述构建方法制得的高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌在生产L-赖氨酸中 的应用。
[0052] 构建原理
[0053]谷氨酸胞外转运蛋白，负责谷氨酸的胞外分泌，但在高产L-赖氨酸菌种中，发明人 通过研究发现该基因的表达则会造成L-赖氨酸发酵时发酵液中副产物谷氨酸的含量的增 加，导致碳流量流向L-赖氨酸合成方向减少，进而影响包括赖氨酸的合成在内的细胞其它 代谢过程。因此，通过构建NCgll221基因失活，从而达到获得L-赖氨酸高产的重组菌。
[0054] 有益效果
[0055] 本发明提供一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株的构建方法，构建的该菌株 由于内源基因 NCgll221失活引起谷氨酸胞外分泌量明显降低，与野生型相比，该菌株可生 产高浓度的L-赖氨酸，并能有效降低发酵液副产物谷氨酸的含量，作为L-赖氨酸生产菌株 能够进一步降低生产和纯化成本。
【具体实施方式】
[0056] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0057]实施例1:基因敲除片段构建
[0058] 1) (i)提取谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)23604基因组DNA，以 该基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到同源臂NCg 1;
[0059] 所述的PCR引物序列如下：
[0060] F1:CGGGATCCCGTTTTTCATGCTTGCCGTCT；
[0061 ] Rl：AAGGCCAGCAAAA GCTAAAGCCCAAGAATGCAAC；
[0062]所述的PCR扩增体系为：
[0065] 所述的PCR扩增程序如下：
[0066] 95 °C 预变性 5min; 94°C 变性 30sec，55 °C 退火 30sec，72 °C 延伸 30sec，30 个循环；72 。(:延伸 10min，4°C 保存；
[0067]琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为528bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒 (上海生工)进行胶回收，回收产物-20°C保存，备用；
[0068] (ii)提取穿梭质粒pHTOl (购自杭州宝赛生物科技有限公司）的DNA，以DNA为模板， 进行PCR扩增，得到Cnf片段；
[0069] 所述的PCR引物序列如下：
[0070] F2:GGTGGTCGGCATTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA；
[0071] R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT；
[0072] 所述的PCR扩增体系为：
[0074] 所述的PCR扩增程序如下：
[0075] 95 °C 预变性 5min; 94°C 变性 30sec，55 °C 退火 30sec，72 °C 延伸 3min，30 个循环；72°C 延伸10min，4°C保存；
[0076] 琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为1274bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒 (上海生工)进行胶回收，回收产物-20°C保存，备用；
[0077] (i i i)将步骤（i)制得的NCg 1片段与步骤（i i )制得的Cnf片段进行重叠 PCR，制得 NCgl-Cnf 片段；
[0078]所述的重叠 PCR的扩增体系为：
[0081 ]所述的重叠 PCR的第一阶段扩增程序如下：
[0082] 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 2min，5 个循环；72°C 延伸lOmin;
[0083] 所述的重叠 PCR的第二阶段扩增程序如下：
[0084] 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 4min，30 个循环；72°C 延伸10min，4°C保存；
[0085] 琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为1777bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒 (上海生工)进行胶回收，回收产物-20°C保存，备用；
[0086] 实施例2:制备地衣芽孢杆菌感受态
[0087] (i)挑取谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)23604单菌落，接种于 1 OmL种子培养基中，37 °C、220r/min，过夜培养；
[0088] 种子培养基，组分如下：
[0089]蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、山梨醇91g。
[0090] (i i )取lmL上述菌液转接到100mL种子培养基中，37 °C、220r/min培养至OD6〇〇 = 0.9；
[0091] (i i i)将菌液转移至100mL离心管，冰浴15-20min，使菌体停止生长；
[0092] (iv)冰浴后4°C、5000g、5min离心，收集菌体；
[0093] (v)离心后的菌体用预冷的电转缓冲液(ETM)洗涤3次；
[0094]电转缓冲液，每升组分如下：
[0095]山梨醇91g、甘露醇91g、甘油100mL。
[0096] (vi)洗涤结束后，使用lOOOyL电转缓冲液重悬菌体；
[0097] (vii)将制备好的感受态细胞分装100yL每管，-80°C保存，备用。
[0098] 实施例3 :NCgl-Cnf片段电转化谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) 23604
[0099] (i)将NCgl-Cnf片段用限制性内切酶BamH I，30°C酶切3h;酶切体系(40yL)如下：
[0101] (ii)浓缩纯化酶切产物
[0102] (1)加入1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积无水乙醇，置于-20°c冰箱20min;
[0103] (2)12000r/min，离心 5min 得沉淀；
[0104] (3) 300yL体积百分比为75 %的乙醇重悬沉淀；
[0105] (4)12000r/min，离心5min，除去乙醇，37°C 风干 30min，
[0106] (5)加入15~18yL ddH20重悬DNA，并置于-20°C保存。
[0107] (iii)电转化
[0108]首先利用核酸超微量分光光度计测定NCgl-Cnf片段浓度，达到300yg/mL浓度后 2100V电击5ms，进行电转化，得到的细胞使用复苏培养基30°C复苏培养lh后，取100yL涂布 在含200yg/mL氯霉素的LB固体培养基上，在37°C培养2天，筛选具有氯霉素抗性的转化子。
[0109]液体复苏培养基，每升组分如下：
[0110]蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、山梨醇91g、甘露醇69.4g。
[0111] 实施例4:阳性重组菌的培养及鉴定
[0112] 挑取上述阳性重组菌落，接种到含200yg/mL氯霉素抗性的液体LB培养基中37°C培 养过夜，培养完成后，使用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取重组菌DNA，并以获得 的基因组为模板，FjPR 2为引物进行PCR扩增，扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行验证；
[0113] 所述的PCR引物序列如下：
[0114] Fi：CGGGATCCCGTTTTTCATGCTTGCCGTCT
[0115] R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT
[0116] 其中，下划线标识的为酶切位点
[0117] 所述的PCR扩增体系为20μ1:
[0119] 所述的PCR扩增程序如下：
[0120] 95 °C 预变性 5min; 94°C 变性 30sec，57 °C 退火 30sec，72 °C 延伸 4min，30 个循环；72°C 延伸10min，4°C保存；
[0121] 琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，使用引物内和办能够扩增出一条特异性 基因条带，大小约为1800b，与理论值1777bp接近，表明目的基因已成功整合到谷氨酸棒状 杆菌基因组上，制得高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌。
[0122] 实施例4: L-赖氨酸发酵测试
[0123] 将制备的高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌接种至100mL LBG培养基（葡萄 糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中220rpm 30°C下进行种子培养20h，其后 按体积百分比2 %接种量接种至100mL发酵培养基（葡萄糖100g/L，蛋白胨20g/L，玉米浆 30mL，尿素5g/L，（NH4)2S〇4 25g/L，L-亮氨酸0.34g/L，KH2P04 2g/L，MgS〇4.7H2〇 1.5g/L，生 物素 0.0 Olg/L)发酵培养36h，并通过日立L-8900型高速氨基酸自动分析仪测定发酵液中氨 基酸的含量。
[0124] 结果显示与原始菌相比，高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌发酵液中谷氨酸 的含量由3.8g/L降低至仪器未检出水平，赖氨酸的产量由40.0g/L提升至43.2g/L。
【主权项】
1. 一种高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌，其特征在于，将谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)的NCgll221基因失活后构建获得，NCgll221基因编码框的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 23604。3. 如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤如下： (1) 通过PCR扩增NCg 11221基因编码框内一段长度大于400bp的基因片段作为同源臂 序列，NCgll221基因编码框的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示； (2) 通过PCR扩增抗性标签基因片段； (3) 将步骤（1)制得的同源臂序列与步骤(2)制得的抗性标签基因片段进行重叠 PCR进 行连接，制得融合片段的两末端均含有相同的限制性内切酶酶切位点，并且该酶切位点不 能出现在拟敲除基因和抗性标签基因中； (4) 制备谷氨酸棒状杆菌感受态细胞，将步骤(3)制得的融合基因经酶切后转化谷氨酸 棒状杆菌感受态细胞，即得。4. 如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（1)中，PCR扩增以谷氨酸棒状 杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因组DNA为模板，PCR扩增引物的核苷酸序列如 下： FI:CGGGATCCCGTTTTTCATGCTTGCCGTCT； R1:AAGGCCAGCAAAA GCTAAAGCCCAAGAATGCAAC； PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μ1: 2><HiFi-PCR masier 2:5μ1 FI (iOumol/L) 2μ1 R1 (l〇ymol/L) 2μ1 模板 2μ1 dd H20 19μ1； PCR扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，54°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 个循环；72°C 延 伸 10min，4°C 保存。5. 如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增模板为穿梭质 粒pHTO 1的DNA; PCR扩增引物的核苷酸序列如下： F2:GGTGGTCGGCATTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA； R2:CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT； PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μ1: 2><HiFi-PCR masier 25μ1 F2 (ΙΟμιηοΙ/L) 2μ1 R2 ( ΙΟμηιοΙ/L) 2μL 糢板 2μ1 dd Η20 】9μΙ; 所述的PCR扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 3min，30 个循环；72°C 延伸 10min，4°C 保存。6. 如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，重叠 PCR的第一阶段扩 增体系如下，总体系为25μ1: 2^HiFi-PCR master 12.5μ1 NCgl 2μ1 CnV 2μΙ dd Η,Ο 8.5μ1 重叠 PCR的第一阶段扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 2min，5 个循环；72°C 延伸 lOmin； 重叠 PCR的第二阶段扩增体系为在第一阶段扩增后的产物基础上加入如下成分，总体 系为50μ1: 2：<HiFi-PCR master 12.5μ1 FI (10umol/L) 2μ1 R2 ( 10 μ moi/L) 2μ! dd Η2(3 8 5μΙ 重叠 PCR的第二阶段扩增程序如下： 95°C 预变性 5min;94°C 变性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 4min，30 个循环；72°C 延伸 10min，4°C 保存。7. 如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体步骤如下： (：0挑取谷氨酸棒状杆菌（(>3巧11663(^61'；[11111〖11^3111；[〇11111)单菌落，在种子培养基中培 养至菌体浓度OD600为0.7~0.9，置于冰上冷却，冷却后离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体 3~5次，电转缓冲液重悬菌体，制得感受态细胞； (ii)对步骤(3)制得的融合基因进行单酶切，28~32°C酶切2~5h，高压电击转化至步 骤(i)制得的感受态细胞中，移入液体复苏培养基，在28~32°C培养3~4h后，筛选，即得。8. 如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（ii)中单酶切体系如下，总体 系为40μ1: 1〇χΚ Buficr 4μ1 限制性内切酶BamH I 4μ1 A^VZ-Cm1' 20μ1 ddH.O 12μΙ〇9. 如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（i)中，种子培养基，每升组分 如下： 蛋白胨8~12g、酵母粉4~6g、氯化钠8~12g、山梨醇85~96g; 优选的，所述步骤(i)中，电转缓冲液，每升组分如下： 山梨醇85~96g、甘露醇85~96g、甘油95~105mL; 优选的，所述步骤(i)中，高压电击转化的条件为:2100V电击5ms; 优选的，所述步骤(i i)中液体复苏培养基，每升组分如下： 蛋白胨8~12g、酵母粉4~6g、氯化钠8~12g、山梨醇85~96g、甘露醇65~73g。10.权利要求1所述构建方法制得的高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌工程菌在生产L-赖氨酸中的应用。
【文档编号】C12P13/08GK105950524SQ201610270794
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】王瑞明, 汪俊卿, 王蕾, 王腾飞, 李桂华, 王建彬, 隋松森
【申请人】齐鲁工业大学, 诸城东晓生物科技有限公司, 山东省饲料质量检验所