一种靶向乳腺癌干细胞的双特异性嵌合抗原受体基因修饰的t淋巴细胞的制备方法及其产品的制作方法

一种靶向乳腺癌干细胞的双特异性嵌合抗原受体基因修饰的t淋巴细胞的制备方法及其产品的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种靶向乳腺癌干细胞的双特异性嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方法，其中包括如下特征：整合素相关蛋白(CD47)和转录共激活因子(TAZ)两者均在乳腺癌组织中高表达，尤其在乳腺癌干细胞中表达特异升高；通过建立的CD47和TAZ过表达乳腺癌细胞，其表现出更强的增殖和转移能力以及肿瘤干细胞特征；本发明靶向该两者乳腺癌干细胞抗原CD47和TAZ胞外域，免疫产生特异性结合的单克隆株，通过基因重组获得与两者特异结合的单链抗体，因而构建成含抗人CD47和TAZ的双特异嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染人T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达人CD47和TAZ的乳腺癌干细胞，激活第一信号和共刺激信号而引发抗乳腺癌毒性活性，在体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤活性。
【专利说明】
一种靶向乳腺癌干细胞的双特异性嵌合抗原受体基因修饰的 T淋巴细胞的制备方法及其产品
技术领域
[0001] 本发明涉及一种靶向乳腺癌干细胞的嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备 方法，其中包括如下特征：乳腺癌组织和乳腺癌干细胞特异性高表达整合素相关蛋白 (⑶47)和转录共激活因子(TAZ)，构建的⑶47和TAZ过表达乳腺癌细胞表现出更强的增殖、 转移能力以及肿瘤干细胞特征;本发明靶向乳腺癌干细胞抗原CD47和TAZ胞外域，获得与两 者特异结合的单链抗体，构建成含抗人CD47和TAZ的双特异嵌合抗原受体基因 （double chimeric antigen receptor，Di-CAR)，重组到病毒载体上并转染人T淋巴细胞，可特异结 合表达人CD47和TAZ的乳腺癌干细胞，在体内体外试验激活免疫信号而引发强大的抗乳腺 癌毒性;本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体T淋巴细胞制备的试剂盒，可用 于制备靶向乳腺癌杀伤的嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞。
【背景技术】
[0002] 淋巴细胞免疫技术在国内外已经用于临床治疗恶性肿瘤，并取得一些临床疗效， 主要包括细胞因子诱导杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞和浸润性T淋巴细胞等，但其为非特 异性免疫作用，由于肿瘤细胞本身免疫逃逸和抗原隐蔽性，其对体内肿瘤细胞清除还非常 有限。
[0003] 嵌合抗原受体基因修饰淋巴细胞技术的出现为临床治疗癌症提供了新的方向，其 技术在体内能激活自身免疫系统，持续性地靶向肿瘤细胞进行杀伤，最终达到完全清除恶 性肿瘤细胞的目的，因而该技术给癌症临床治疗提供更好的应用平台。但是由于在实体瘤 方面肿瘤抗原发现有限，而且很多肿瘤抗原除了在肿瘤细胞本身表达，也在正常组织中表 达，因而无法对肿瘤细胞产生很好的特异性，杀伤肿瘤细胞同时也损伤了正常组织和器官， 找到具有特异性的肿瘤抗原是该技术应用的关键。
[0004] 本发明提供了在乳腺癌组织和乳腺癌干细胞特异性高表达整合素相关蛋白 (CD47)和转录共激活因子(TAZ)，CD47和TAZ过表达乳腺癌细胞表现出更强的增殖、转移能 力以及肿瘤干细胞特征，以结合肿瘤细胞特异表达的CD47和TAZ的双特异嵌合抗原基因重 组到病毒载体上并转染人T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表 达CD47和TAZ的乳腺癌细胞，特别是乳腺癌干细胞;激活第一信号和共刺激信号而体内体外 引发抗乳腺癌细胞毒性活性，将有效地清除体内恶性肿瘤细胞和延长患者生存期。

【发明内容】

[0005] 本发明针对现有临床应用T淋巴细胞技术靶向肿瘤细胞杀伤特异性差；以及在体 内激活患者自身免疫作用抗肿瘤不足，特别对具有高耐药性、自我更新和成瘤性等的乳腺 癌干细胞无杀伤作用，造成大多数恶性肿瘤临床治疗有限。本发明在前期研究工作中发现 乳腺癌组织、乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞均特异表达的两个肿瘤抗原CD47和TAZ。同时我们 通过构建的CD47和TAZ过表达慢病毒载体，包装成病毒后转染乳腺癌细胞，发现其具有更强 的增殖和转移能力，并表现出肿瘤干细胞表型，和体内成瘤实验具有肿瘤干细胞特征。
[0006] 本发明根据该两个肿瘤抗原CD47和TAZ的胞外区通过杂交瘤技术获得与两者特异 性结合反应的单克隆细胞株和单克隆抗体，蛋白测序确定单克隆抗体的重链和轻链的可变 区，利用基因 PCR技术将重链和轻链通过链接子(linker)连接产生单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，在酶联免疫法和细胞流式检测该两个scFv能特异结合⑶47和 TAZ两个肿瘤抗原，这两个scFv可以作为结合CD47和TAZ两个肿瘤抗原的抗体。
[0007] 本申请发明人利用DNA修饰酶-1011易位甲基胞嘧啶双加氧酶2(teneleven translocation methylcytosine dioxygenase 2，TET2)可抑制介素6(interleukin 6，IL_ 6)转录表达，我们发现将TET2在T淋巴细胞中高表达可抑制IL-6基因表达和分泌，从而阻止 了T淋巴细胞分泌IL-6而产生的"免疫因子风暴"。因而我们根据这些科研结果，构建成含特 异结合⑶47以及TAZ的双特异嵌合抗原受体基因，并引入TET2以及⑶28、⑶137和⑶3ζ胞内 信号区的基因片段，重组到病毒载体上并转染人Τ淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受 体基因，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性。
[0008] 本发明涉及一种靶向乳腺癌干细胞的嵌合抗原受体基因修饰的Τ淋巴细胞的制备 方法，其特征在于，CD47和ΤΑΖ两者均在乳腺癌组织中高表达，尤其在乳腺癌干细胞中表达 特异升高;通过建立的CD47和ΤΑΖ过表达乳腺癌细胞，其表现出更强的增殖和转移能力以及 肿瘤干细胞特征;本发明靶向该两者乳腺癌干细胞抗原CD47和ΤΑΖ胞外域，免疫产生特异性 结合的单克隆株，通过基因重组获得与两者特异结合的单链抗体，因而构建成含抗人CD47 和ΤΑΖ的双特异嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染人Τ淋巴细胞，高表达该双特异 性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达人CD47和ΤΑΖ的乳腺癌干细胞，激活第一信号和共刺 激信号而引发抗乳腺癌毒性活性，在体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤活性。
[0009] 所述双特异性嵌合抗原受体(Di-CAR)基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染Τ淋 巴细胞，再将T淋巴细胞培养到第14天，获得Di-CAR-T细胞;通过荧光定量PCR技术检测，转 染了Di-CAR病毒载体的T淋巴细胞其表达Di-CAR基因高于未转染的T淋巴细胞为50倍以上；
[0010] 所获得的T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达CD47 和TAZ的乳腺癌干细胞，同时激活第一信号和共刺激信号而引发抗肿瘤细胞毒性活性，体内 体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性;其高表达其特异标志物CD3+/CD8+，阳性率高于90 %以 上，而调节性T淋巴细胞⑶4+/⑶25+/Foxp3+阳性率低于5%以下。
[0011] 本发明所述的⑶47和TAZ基因和蛋白质在乳腺癌组织中高表达，通过荧光定量PCR 检测，与正常乳腺组织相比，两者在乳腺癌组织中表达分别为89.00和134.55倍；蛋白印迹 分析检测，两者在乳腺癌组织中表达分别为正常乳腺组织的23.49和35.67倍。
[0012] 优选地，所述的CD47和TAZ基因和蛋白质在乳腺癌干细胞中高表达，体外培养获得 的CD44+CD24-乳腺癌干细胞荧光定量PCR检测，与乳腺癌细胞相比，两者在乳腺癌组织中表 达分别为23.45和54.33倍;蛋白印迹分析检测，两者在乳腺癌干细胞中表达分别为乳腺癌 细胞的11.56和25.61倍。
[0013] 本发明还通过构建CD47和TAZ两个慢病毒载体，分别包装后转染乳腺癌细胞，其高 表达CD47和TAZ基因与蛋白；体外细胞增殖培养分析，该两种CD47和TAZ病毒转染的乳腺癌 细胞在第7天增殖倍数分别为未转染的乳腺癌细胞增殖的9.44和12.56倍;Transwell细胞 迀移实验中，该两种细胞发生了明显的迀移，而未转染的乳腺癌细胞迀移不明显。而且CD47 和TAZ两个慢病毒转染的乳腺癌细胞通过流式细胞仪检测，发现两者表达CD44+CD24-表型 明显高于未转染的乳腺癌细胞，即该两种乳腺癌细胞的CD44+CD24-阳性率分别为67.56 % 和78.90%，而未转染的乳腺癌细胞仅为1.45%。
[0014] 裸鼠体内成瘤实验中，仅100个CD47和TAZ病毒转染的乳腺癌细胞接种时，在第7天 就形成肿瘤，而未转染的乳腺癌细胞接种1〇 6数量级时方形成肿瘤，表明高表达了 CD47和 TAZ的乳腺癌细胞具有肿瘤干细胞的表型和特性。
[0015] 本发明所述的含特异结合CD47的特异嵌合抗原受体基因，包括特异结合CD47的单 链抗体并串联了两个共刺激分子胞内域(CD28和CD137)和CD3G胞内信号区的基因片段，可 激活第一信号和共刺激信号，即激活机体免疫应答而引发抗肿瘤细胞毒性活性和肿瘤凋亡 作用。
[0016] 本发明所述的TAZ的特异嵌合抗原受体基因，包括TAZ的单链抗体并链接了抑制 IL-6基因转录的TET2基因片段，抑制T淋巴细胞分泌IL-6而防止了 "免疫因子风暴"。
[0017] 同时所述双特异性嵌合抗原受体基因之间链接了弗林蛋白酶切割位点，其在细胞 内蛋白翻译后可产生两个独立发挥功能的嵌合抗原受体。
[0018] 本发明所述方法中τ淋巴细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等的 单个核细胞。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或 骨髓。
[0019] 本发明所述将人IFNy-信号肽-scFv(CD47)-CD8a铰链区-CD28-CD137-CD3G胞内 区，以及scFv(TAZ)-IgD铰链区-TET2通过Furin切割位点和连接序列连接在一起，形成重组 基因序列，基因序列通过化学合成获得，形成完整的双特异性嵌合抗原受体基因的cDNA，即 Di-CAR〇
[0020] 将Di-CAR构建在病毒载体中，并转染患者自体T淋巴细胞，再将T淋巴细胞培养到 第14天，获得Di-CAR-T淋巴细胞。通过荧光定量PCR技术检测，转染了Di-CAR病毒载体的T淋 巴细胞其表达Di-CAR基因高于未转染的T淋巴细胞为50倍以上。蛋白印迹技术检测其Di-CAR融合蛋白表达水平，可表达scFv(CD47)-CAR 53kDa和scFv(TAZ)-CAR 42kDa的融合蛋 白。
[0021] 本发明所述方法中来源50ml外周血单个核细胞诱导培养获得T淋巴细胞，增殖倍 数达1000倍以上，培养到14天T淋巴细胞数达3 X109以上。
[0022]本发明所述方法中培养获得的T淋巴细胞，高表达其特异标志物⑶3+/CD8+，阳性 率高于90%以上，而调节性T淋巴细胞⑶4+/CD25+/Foxp3+阳性率低于5%以下，体内体外试 验具有很强抗肿瘤杀伤毒性。
[0023]本发明使用的T淋巴细胞激活培养器为使用小鼠抗人⑶3单克隆抗体(0KT3)包被 的培养器，包括细胞培养板、培养皿和培养瓶等，优选地为细胞培养皿。
[0024]本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基加入含l-500ng/mll-500ng/ ml IL-la、10-2000活性单位(IU)/ml IL-2和5% (体积比）自体血清或胎牛血清，如CellGro SCGM、A頂-V、X-VIV0和GT-T551等商品化产品。
[0025]本发明还提供了一种制备靶向乳腺癌干细胞的嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细 胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
[0026] (1)获得如上所述的稳定表达Di-CAR的病毒载体；
[0027] (2)T淋巴细胞因子，包括IL-la和IL-2;
[0028] (3)0ΚΤ3 包被 75cm2 培养瓶；
[0029] (4)淋巴细胞培养基，包括无血清培养基；
[0030] (5)淋巴细胞分离液；
[0031] (6)生理盐水；
[0032] (7)使用说明书；
[0033] 其中，所述使用说明书包括如上所述的方法。
[0034] 本发明还提供了上述方法及其试剂盒制备T淋巴细胞，可用于乳腺癌的临床免疫 治疗。
【附图说明】
[0035] 图1中表示为⑶47和TAZ基因在乳腺癌组织和正常乳腺组织中表达水平
[0036]图2表示为蛋白印迹技术检测⑶47和TAZ蛋白在乳腺癌患者和正常乳腺组织中表 达水平
[0037]图3表示为CD47和TAZ基因在乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞中表达水平
[0038]图4表示为蛋白印迹技术检测CD47和TAZ蛋白在乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞中表 达水平
[0039] 图5表示为MTT法检测效果例三中制备的CD47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF-7细胞增殖活 性曲线
[0040] 图6表示为效果例三中制备的CD47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF-7细胞流式细胞检测 [00411图7表示为Di-CAR慢病毒转染T淋巴细胞后经培养后的表达水平
[0042]图8表示为蛋白印迹技术检测Di-CAR融合蛋白在Di-CAR慢病毒转染乳腺癌患者来 源的T淋巴细胞表达水平
[0043]图9表示为实施例一制备的乳腺癌患者Di-CAR慢病毒转染T淋巴细胞流式细胞结 果图
[0044] 图10表示为乳腺癌患者来源Di-CAR慢病毒转染T淋巴细胞(Di-CAR-T)对MCF-7和 BSC的杀伤活性曲线图
[0045] 图11表示为Di-CART细胞治疗乳腺癌鼠模型的肿瘤大小变化曲线
【具体实施方式】
[0046] 本发明发现乳腺癌组织、乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞均特异表达的两个肿瘤抗原 ⑶47和TAZ。同时我们通过构建的⑶47和TAZ过表达慢病毒载体，包装成病毒后转染乳腺癌 细胞，发现其具有更强的增殖和转移能力，并表现出肿瘤干细胞表型，和体内成瘤实验具有 肿瘤干细胞特征。将该两个特异结合CD47以及TAZ的双特异嵌合抗原受体基因重组到病毒 载体上并转染人T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达CD47以 及TAZ的乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞，激活第一信号和共刺激信号而体内体外试验中引发 抗肿瘤细胞毒性活性。
[0047] 通过采集乳腺癌患者肿瘤组织(通过伦理委员会备案和与患者签署知情同意书）， 对CD47和TAZ基因和蛋白质在乳腺癌组织中进行检测分析，焚光定量PCR检测发现，与正常 乳腺组织相比，两者在乳腺癌组织中表达分别为89.00和134.55倍;蛋白印迹分析检测，两 者在乳腺癌组织中表达分别为正常乳腺组织的23.49和35.67倍。
[0048] 本发明体外培养获得的CD44+CD24-乳腺癌干细胞，荧光定量PCR检测，CD47和TAZ 基因和蛋白质在乳腺癌干细胞中高表达，与乳腺癌细胞相比，两者在乳腺癌组织中表达分 别为23.45和54.33倍;蛋白印迹分析检测，两者在乳腺癌干细胞中表达分别为乳腺癌细胞 的 11.56 和 25.61 倍。
[0049] 另外通过构建CD47和TAZ两个慢病毒载体，分别包装后转染乳腺癌细胞，其高表达 CD47和TAZ基因与蛋白；体外细胞增殖培养分析，该两种CD47和TAZ病毒转染的乳腺癌细胞 在第7天增殖倍数分别为未转染的乳腺癌细胞增殖的9.44和12.56倍;Transwell细胞迀移 实验中，该两种细胞发生了明显的迀移，而未转染的乳腺癌细胞迀移不明显。
[0050] CD47和TAZ两个慢病毒转染的乳腺癌细胞通过流式细胞仪检测，发现两者表达 ⑶44+⑶24-表型明显高于未转染的乳腺癌细胞，即该两种乳腺癌细胞的⑶44+⑶24-阳性率 分别为67.56 %和78.90 %，而未转染的乳腺癌细胞仅为1.45 %。裸鼠体内成瘤实验中，仅 100个CD47和TAZ病毒转染的乳腺癌细胞接种时，在第7天就形成肿瘤，而未转染的乳腺癌细 胞接种1〇 6数量级时方形成肿瘤，表明高表达了CD47和TAZ的乳腺癌细胞具有肿瘤干细胞的 表型和特性。
[0051] 对本发明涉及的一种靶向乳腺癌干细胞的嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的 制备方法进行具体说明。
[0052]本发明涉及一种靶向乳腺癌干细胞的嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备 方法，其特征在于，构建成含特异结合CD47以及TAZ的双特异嵌合抗原受体基因重组到病毒 载体上并转染人T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达CD47以 及TAZ的乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞，激活第一信号和共刺激信号而体内体外试验中引发 抗肿瘤细胞毒性活性。
[0053]本发明所述的含特异结合CD47的特异嵌合抗原受体基因，包括特异结合CD47的单 链抗体并串联了两个共刺激分子胞内域(CD28和CD137)和CD3G胞内信号区的基因片段，可 激活第一信号和共刺激信号，即激活机体免疫应答而引发抗肿瘤细胞毒性活性和肿瘤凋亡 作用。
[0054] 本发明所述的TAZ的特异嵌合抗原受体基因，包括TAZ的单链抗体并链接了抑制 IL-6基因转录表达的TET2基因片段，抑制T淋巴细胞分泌IL-6而防止了治疗中"免疫因子风 暴"的产生。
[0055] 同时所述双特异性嵌合抗原受体基因之间链接了弗林蛋白酶切割位点，其在细胞 内蛋白翻译后可产生两个独立发挥功能的嵌合抗原受体。
[0056] 本发明所述将人IFNy-信号肽-scFv(CD47)-CD8a铰链区-CD28-CD137-CD3G胞内 区，以及scFv(TAZ)-IgD铰链区-TET2通过Furin切割位点和连接序列(Linker)连接在一起， 形成重组基因序列，基因序列通过化学合成获得，形成完整的双特异性嵌合抗原受体基因 的cDNA，BPDi-CAR。
[0057] 将两个特异性嵌合抗原受体基因，即人IFNy-信号肽-ScFv(CD47)-CD8a铰链区-CD28-CD137-CD3G胞内区，以及scFv(TAZ)-IgD铰链区-TET2通过Furin切割位点和连接序列 连接在一起，形成重组基因序列，序列通过化学合成获得，形成完整的双特异性嵌合抗原受 体基因的cDNA，即Di-CAR;
[0058] 将Di-CAR的目的DNA片段和pUC229载体Hind III/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶 作用下，将两者于4°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后 进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定;PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合Di-CAR大小和序 列后，将测序正确的菌液转接于l〇ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37°C培养过夜，用北 京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置_80°C 超低温冰箱中长期保存；
[0059] 将Di-CAR的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2载体Hind III/BamH I双酶切后，在T4DNA 连接酶作用下，将两者于37°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞 DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；
[0060] 取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培 养皿6X 106个细胞数接种于培养皿中，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜;第二天转染前移 去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；取9yg包装混合液和3yg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，取36μ1 lipofectamine2000加入 1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，室 温放置5min;混合质粒溶液和1 ipofectamine 2000稀释液，置室温20min;混合液缓慢滴加 至293FT细胞的培养液中，混匀，于37°C、5 %C02细胞培养箱中培养;培养6h后弃去含有转染 混和物的培养基，加入l〇ml的roS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后 倒弃；缓慢加入含10 %血清的细胞培养基20ml，于37 °C、含5 %⑶2培养箱内继续培养48-72h；
[00611 根据细胞状态，收集转染后48h的293FT细胞上清液;于4°C，4000g离心10min，除去 细胞碎片；以0.45μπι滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清 液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为 2h，离心温度控制在4°C;离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒 保存液，轻轻反复吹打重悬;经充分溶解后，高速离心lOOOOrpm，离心5min后，取上清荧光法 测定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分装，保存于-80°C超低温冰箱。
[0062]本发明所述方法中T淋巴细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等的 单个核细胞。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或 骨髓。
[0063]采集来源于乳腺癌患者自体外周血50-100ml，经淋巴细胞分离液分离纯化得到单 个核细胞后，用无血清培养基重悬并稀释到2-5 X 106细胞/ml，并补充l-500ng/ml IL-la、 10-2000IU/ml IL-2和5%自体血清，取10ml加入到鼠抗人CD3(0KT3)包被的75cm2培养瓶 中，于37°C、含5%C0 2培养箱培养到第3天;第3天离心收获T淋巴细胞，并通过苔盼兰计数。 [0064]第3天收获的T淋巴细胞用无血清培养基重悬为5-10 X106细胞/ml，取6ml加入到 0KT3包被的75cm2培养瓶中，并加入100μ1 lE+7TU/ml重组Di-CAR慢病毒，体系为6ml，混匀， 37 °C、5 %⑶:^的培养箱中孵育8-12个小时后，更换无血清培养基10ml，所述完全培养液优选 含l-500ng/ml IL-la、10-2000IU/ml IL-2和5 %自体血清；当T淋巴细胞生长密度达到10 X 1〇6细胞/ml时，转入新的75cm2培养瓶中生长，并补充完全无血清培养液到50ml培养体系；于 37°C、含5 %C02培养箱内培养到第14天，期间根据T淋巴细胞密度和培养基颜色变化补充含 10-2000IU/ml IL-2和5%自体血清新鲜完全无血清培养液，或扩瓶到175cm2培养瓶中或转 移到1-3L培养袋中生长；
[0065]培养到第14天的T淋巴细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了Di-CAR病毒载体的 T淋巴细胞其表达Di-CAR基因高于未转染的T淋巴细胞为50倍以上；蛋白印迹技术检测其 Di-CAR融合蛋白表达水平，可表达scFv (CD47) -CAR 53kDa和scFv (TAZ) -CAR 42kDa的融合 蛋白。
[0066]本发明所述方法中来源50ml外周血单个核细胞诱导培养获得T淋巴细胞，增殖倍 数达1000倍以上，培养到14天Τ淋巴细胞数达3 Χ109以上。
[0067]本发明所述方法中培养获得的Τ淋巴细胞，高表达其特异标志物⑶3+/CD8+，阳性 率高于90%以上，而调节性Τ淋巴细胞CD4+/⑶25+/Foxp3+阳性率低于5%以下，所述的Τ淋 巴细胞体内体外试验具有很强抗肿瘤杀伤毒性。
[0068]本发明使用的T淋巴细胞激活培养器为使用小鼠抗人⑶3单克隆抗体(0KT3)包被 的培养器，包括细胞培养板、培养皿和培养瓶等，优选地为细胞培养皿。
[0069]本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基加入含l-500ng/mll-500ng/ ml IL-la、10-2000活性单位(IU)/ml IL-2和5% (体积比）自体血清或胎牛血清，如CellGro SCGM、A頂-V、X-VIV0和GT-T551等商品化产品。
[0070]本发明还提供了一种制备靶向乳腺癌干细胞的嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细 胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
[0071 ] (1)获得如上所述的稳定表达Di-CAR的病毒载体；
[0072] (2)T淋巴细胞因子，包括IL-la和IL-2;
[0073] (3)0KT3 包被 75cm2 培养瓶；
[0074] (4)淋巴细胞培养基，包括无血清培养基；
[0075] (5)淋巴细胞分离液；
[0076] (6)生理盐水；
[0077] (7)使用说明书；
[0078] 其中，所述使用说明书包括如上所述的方法。
[0079 ]作为本发明T淋巴细胞增殖培养中使用的细胞培养板、细胞培养皿、培养瓶、细胞 培养袋，可例举为75cm2细胞培养瓶、175cm2细胞培养瓶、225cm2细胞培养瓶、1L或2L细胞培 养袋等细胞培养用器材(容器），均可用于本发明，优选细胞培养袋。
[0080]本发明的制造方法中对T淋巴细胞进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选例如为 50 %小牛血清、40 %细胞培养液和10 %二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为T淋巴细胞培 养液。
[0081 ]在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限 制，如大于〇容量％至20容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量，优 选为5% (体积比）。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血浆的 来源，可以是自己（意味着与所培养的细胞来源相同）或非自己（意味着与所培养的细胞的 来源不同）中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外，也可以添 加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。
[0082]本发明的自体T淋巴细胞增殖的制备使用上述各种成分及培养基来实施。本发明 中使用的培养培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可 在37°C、5%C02等条件下培养。还可以实施如下等操作：间隔适当的时间添加新鲜培养基来 稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。
[0083] 本发明还提供T淋巴细胞在临床应用中多次的抗乳腺癌治疗，更好地在生物体内 发挥抗肿瘤免疫应答，达到很好的治疗效果。此外，上述T淋巴细胞还具有如下优点，多次T 淋巴细胞治疗将更好地引发T淋巴细胞杀瘤活性，激活机体自身免疫应答，产生高效、长效 地抗肿瘤免疫效应，因此非常利于乳腺癌患者疗效的提高和生存期的延长。
[0084] 以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。
[0085]效果例一整合素相关蛋白（⑶47)和转录共激活因子(TAZ)在乳腺癌组织中高表达 [0086] 采集100例乳腺癌患者肿瘤组织和50例志愿者正常乳腺组织(通过伦理委员会备 案和与患者签署知情同意书），取lg组织在液氮中研磨，后用Trizol-步法提取总RNA，取2μ g逆转录合成模板cDNA。取2μ1逆转录产物进行PCR反应以检测靶基因的mRNA表达水平。按美 国Invitrogen公司荧光定量PCR试剂盒说明书，建立终体积为20μ1的PCR反应体系，2μ1逆转 录产物、10μ1 SYBR Green Mix、上下游引物（ΙΟμ mol/L)各O.SyhPCR热循环参数为：95°C 5min，然后94°C变性30s、60°C退火30s，进行45个循环。引物序列如下：
[0087] TAZ正义链：5，-GTGTCCAATCACCAGTCCTG-3，，
[0088] 反义链：5 ' -GCTGAAGAAGTGGGAGTGTAGC-3 ' ；
[0089] CD47正义链：5，-GTGGTTGTTGGAGCCATCCT-3，，
[0090] 反义链：5 ' -TGCCATGATGCAGAGACACA-3 ' ；
[0091] 看家基因 NADPH正义链:5' -GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3'，
[0092] 反义链：5' -CGCTCCTGGGAAGATGGTGAT-3'。
[0093]经美国ABI 7500荧光定量PCR仪上机检测，结果采用法进行计算。图1中为 ⑶47和TAZ基因在乳腺癌组织和正常乳腺组织中表达水平，结果显示两者在乳腺癌组织中 表达均值分别为正常乳腺组织的75.1和92.34倍;表明⑶47和TAZ基因在乳腺癌组织中高表 达。
[0094]乳腺癌患者和正常健康人lg组织经匀浆裂解后进行蛋白凝胶电泳。根据目的蛋白 的分子量，配制10%分离胶，浓缩胶浓度为5%。待检测蛋白样品上样量:20yg/孔。电泳条 件:浓缩胶恒压90V，约20分钟;分离胶恒压120V，通过标准分子量预染蛋白来确定电泳停止 时间。湿转法，转膜条件:300mA恒流;0.45μηι孔径PVDF膜，转膜时间80分钟。转膜完成后丽春 红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。封闭:将膜完全浸没于5 % (mg/mL)牛血清白蛋白 (BSA)的转膜缓冲液(含体积比3 %吐温-20，TBST)中，室温下水平摇床孵育1小时。一抗孵 育：5 % (mg/mL)BSA-TBST稀释小鼠抗人CD47和TAZ单抗1:2000，购自美国Santa公司；4°C水 平摇床孵育过夜。次日，洗膜:TBST洗3次，每次10分钟。滴加辣根过氧化酶标记的二抗到膜 孵育lh，化学发光显色。
[0095]胶片用扫描仪扫描为大于300DPI的TIF格式图片，使用Quantity One分析软件 (Bio-Rad公司）进行灰度分析，图2为蛋白印迹技术检测CD47和TAZ蛋白在乳腺癌患者和正 常乳腺组织中表达水平，即western blotting灰度结果图，两者在乳腺癌组织中表达灰度 均值分别为1.96和2.88，而正常乳腺组织分别为0.11和0.10; CD47和TAZ蛋白在乳腺癌组织 中表达为正常乳腺组织的17.36和29.65倍，表明⑶47和TAZ蛋白两者均在乳腺癌组织中高 表达。
[0096] 效果例二⑶47和TAZ乳腺癌干细胞中特异高表达。
[0097] 同样来自上述100例乳腺癌患者新鲜肿瘤组织，经消化获得的肿瘤单细胞悬液使 用含20ng/ml重组人表皮生长因子、20ng/ml重组人成纤维生长因子、10ng/ml人胰岛素和1 X无血清培养添加物B27的DMEM/F12( 1:1)培养基进行培养，具体方法详见Piscitelli E等 2015年在《分子生物学方法》杂志中发表的《成乳腺球的乳腺癌干细胞的培养与特征》，即 Piscitelli E et al.Culture and characterization of mammary cancer stem cells in mammospheres .Methods Mol Biol .2015; 1235:243-62.获得的乳腺癌干细胞经流式细 胞仪检测⑶44+⑶24-率为69.45 %，通过流式细胞仪分选获得⑶44+⑶24-的乳腺癌干细胞。 乳腺癌细胞和正常乳腺细胞分别来源新鲜肿瘤组织和正常乳腺组织，通过含10%胎牛血清 的DMEM(高糖)培养基培养获得。
[0098] 采用荧光定量PCR检测⑶47和TAZ基因在乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞中表达水平 (具体方法见效果例一），图3中结果显示两者在乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞中表达均值分 别为正常乳腺细胞的112.09与159.76，23.89与45.66倍;表明CD47和TAZ基因在乳腺癌干细 胞中表达比乳腺癌细胞更高。
[0099]通过蛋白印迹技术检测CD47和TAZ蛋白在乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞中表达水平 并测定灰度(具体方法见效果例一），图4中结果显示两者在乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞中 表达灰度均值分别为2.44与3.3，1.56与1.88，而正常乳腺细胞分别为0.09和0.08; CD47和 TAZ蛋白在乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞中表达为正常乳腺细胞的26.32与42.74倍，16.79和 24.38倍，表明CD47和TAZ蛋白两者均在乳腺癌干细胞和乳腺癌细胞中高表达，而在乳腺癌 干细胞中表达高于乳腺癌细胞。
[0100]效果例三⑶47和TAZ过表达乳腺癌细胞更强的增殖和转移能力 [0101] 将人CD47和TAZ基因片段设计含EcoR I/Hind III引物，通过PCR分别从人外周血 中扩增获得，pET-llc载体EcoR I/Hind III双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将CD47和TAZ PCR产物分别与酶切后的pET-llc于4°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感 受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定;PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合 CD47和TAZ大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中， 37°C培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的 重组质粒放置-80°C超低温冰箱中长期保存;所述⑶47和TAZ大小分别为887bp和1208bp;
[0102] 将CD47和TAZ的目的DNA片段和GV358载体Pst I/Pst I双酶切后，在T4DNA连接酶 作用下，将两者于37°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后 进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；
[0103] 取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养 皿6X 106个细胞数接种于培养皿中，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜;第二天转染前移去 培养液，换5ml Opti-MEM培养液;取9yg包装混合液和3yg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，取36μ1 lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置 5min;混合质粒溶液和1 ipofectamine 2000稀释液，置室温20min;混合液缓慢滴加至293T 细胞的培养液中，混匀，于37 °C、5 % C02细胞培养箱中培养;培养6h后弃去含有转染混和物 的培养基，加入1 〇ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃； 缓慢加入含10 %血清的细胞培养基20ml，于37°C、含5 % C02培养箱内继续培养72h。
[0104] 根据细胞状态，收集转染后48h的293T细胞上清液;于4°C，4000g离心10min，除去 细胞碎片；以〇.45μπι滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清 液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为 2h，离心温度控制在4°C;离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒 保存液，轻轻反复吹打重悬;经充分溶解后，高速离心lOOOOrpm，离心5min后，取上清荧光法 测定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分装，保存于-80 °C超低温冰箱，即制备成了 CD47和TAZ 两种慢病毒。
[0105] 以3X106细胞/ml乳腺癌细胞MCF-7加入到六孔培养板，每孔为2ml RPMI 1640培 养基(含10%胎牛血清），于37°C、含5%⑶2培养箱内培养过夜。第6天将20μ1 lE+7TU/ml重 组⑶47和TAZ慢病毒分别加入到的六孔培养板中，体系为lml，混匀，37°C、5%⑶2的培养箱 中孵育8-12个小时后，更换完全培养液RPMI 1640 2ml;当MCF-7生长融合达到90%时，将 MCF-7细胞转移到75cm2培养瓶，补充完全培养液RPMI 1640到10ml培养体系进行扩增培养。 在通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书（美国Invitrogen公司）检测，培养到第10代的 MCF-7细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了⑶47和TAZ病毒转染MCF-7细胞其表达目的基 因分别高于未转染的MCF-7为289.9和320.87倍。⑶47-MCF7淋巴为⑶47慢病毒转染的MCF-7 细胞，TAZ-MCF7为TAZ慢病毒转染的MCF-7细胞。
[0106] CD47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF-7细胞以5X107/L密度接种于96孔板，每组设6个复 孔。各组于实验结束前4h加入5g/L的ΜΤΤ 20μ1，培养4h弃去培养液，各孔加入150μ1二甲基 亚砜(DMS0)，室温振荡15min，酶标仪于波长490nm处测吸光度(Α)值表示细胞活性。以上实 验重复3次。图5中MTT法检测乳腺癌细胞增殖活性曲线，CD47-MCF7和TAZ-MCF7两者增殖速 率明显高于MCF-7，并具有统计学意义(P<0.01)，表明高表达⑶47和TAZ促进了乳腺癌细胞 增殖生长。
[0107] 采用24孔板Transwell小室进行。小室孔径8μηι，上室用100μ1 Matrigel胶包被后 紫外线照射211。0)47-10^7、了42-10^7和10^-7细胞以1\106/1111的密度接种于6孔板，2411后， 各组分别吸取2001细胞接种于上层小室并置于24孔板中，下室加含10%胎牛血清的 RMPI1640培养液培养24h。棉签擦掉上室面的Matrigel胶和细胞，甲醇固定10min，结晶紫染 色后高倍镜下随机计数5个视野中的细胞数，实验重复3次。侵袭抑制率（％ ) = ( 1-实验组侵 袭细胞的数量/对照组侵袭细胞的数量）X 100%。
[0108] 表1高表达⑶47和TAZ对乳腺癌细胞MCF-7侵袭迀移能力的作用
[0110] 从表1中可以看到高表达⑶47和TAZ的乳腺癌细胞MCF-7具有很强侵袭迀移能力， 显著高于MCF-7细胞。
[0111] 效果例四⑶47和TAZ过表达乳腺癌细胞具有肿瘤干细胞特性
[0112] 效果例三中制备的1 X 106CD47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF-7细胞，进行流式抗体染色 检测分析，实验组分别为20yL鼠抗人CD24-FITC和20yL鼠抗人CD44-PE;同型对照组为20yL mlgGl-FITC和20yL mlgGl-PE;放置4°C冰箱染色30分钟后用PBS洗涤3次，然后在FACS Calibur仪器(美国BD公司）上机检测和分析。
[0113] 图6为效果例三中制备的CD47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF-7细胞流式细胞检测，三者细 胞的CD44+CD24-百分比分别为42 · 00 %、70 · 54% 和 13 · 62% ; CD47-MCF7和TAZ-MCF7乳腺癌 干细胞表型CD44+CD24-百分比明显高于MCF-7细胞，表明高表达CD47和TAZ的MCF-7具有乳 腺癌干细胞表型。
[0114] 45 只 8周 SCID 裸鼠腹部侧翼皮下注射 lO^lO^lO'H^PHy^OMT-MCFTJAZ-MCF? 和MCF-7细胞，体积为100μΙ，每个注射剂量3只裸鼠，连续饲养30天并观察成瘤情况，具体见 表2。
[0115]表2接种乳腺癌细胞裸鼠体内成瘤情况
[0117] 注为未成瘤，+、++和+++不同的成瘤程度，肿瘤大小越大。
[0118] 从表2中可以看到CD47-MCF7和TAZ-MCF7接种了 100个在第7天既成瘤了，而MCF-7 在106数量级才成瘤和104数量级在第14天成瘤;表明极少数CD47-MCF7和TAZ-MCF7在体内可 成瘤，具有肿瘤干细胞特性。
[0119] 实施例一双特异性嵌合抗原受体基因修饰的Τ淋巴细胞的制备
[0120] 将人IFNy-信号肽-scFv(CD47)-CD8a铰链区-CD28-CD137-CD3G胞内区，以及scFv (TAZ)-IgD铰链区-TET2通过Furin切割位点和连接序列的基因片段构成。
[0121] 将人IFNy-信号肽-scFv(CD47)-CD8a铰链区-CD28-CD137-CD3G胞内区，以及scFv (TAZ)-IgD铰链区-TET2通过Furin切割位点和连接序列（Linker)连接在一起，形成重组基 因序列，基因序列通过化学合成获得，形成完整的双特异性嵌合抗原受体基因的cDNA，即 Di-CAR;Di-CAR慢病毒载体构建和包装方法与效果例三所述的方法一样，获得Di-CAR慢病 毒取上清荧光法测定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分装，保存于-80°C超低温冰箱，即制 备成Di-CAR慢病毒。
[0122] 采集乳腺癌患者患者50ml(与其签署知情同意书），加入等量lXroS稀释，沿离心 管管壁轻轻叠加于淋巴细胞分离液上，形成明显界面，室温下2000rpm离心20min，吸取界面 层的PBMC，用1 xroS(pH值为7.4)洗涤两次。苔盘兰计数后，用VIV0-15无血清培养基重悬并 稀释到3 X 106细胞/ml，并补充50ng/ml IL-Ια、500IU/ml IL-2和5 %自体血清，取10ml加入 到鼠抗人⑶3 (0KT3)包被的75cm2培养瓶中，于37 °C、含5 % C02培养箱培养到第3天;第3天离 心收获T淋巴细胞，并通过苔盼兰计数。
[0123] 第3天收获的T淋巴细胞用无血清培养基重悬为5-10 X106细胞/ml，取6ml加入到 0KT3包被的75cm2培养瓶中，并加入100μΙ lE+7TU/ml重组Di-CAR慢病毒，体系为6ml，混匀， 37 °C、5 %⑶:^的培养箱中孵育8-12个小时后，更换无血清培养基10ml，所述完全培养液优选 含50ng/ml IL-la、500IU/ml IL-2和5%自体血清；当T淋巴细胞生长密度达到10X106细 胞/ml时，转入新的75cm2培养瓶中生长，并补充完全无血清培养液到50ml培养体系；于37 °C、含5%C0 2培养箱内培养到第14天，期间根据T淋巴细胞密度和培养基颜色变化补充含 50011]/111111^-2和5%自体血清新鲜完全无血清培养液，转移到21^培养袋中生长；
[0124] 图7为Di-CAR慢病毒转染T淋巴细胞后经培养后的表达水平。通过荧光定量PCR技 术检测培养到第14天的T淋巴细胞，转染了Di-CAR病毒载体的T淋巴细胞其表达Di-CAR基因 高于未转染的T淋巴细胞为125.6倍。
[0125] 实施例二双特异性嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞蛋白印迹和流式细胞检 测
[0126] 取实施例一制备的晚期乳腺癌患者和正常健康人来源第14天培养获得的T淋巴细 胞各1 X 106,通过超声破碎后进行western blotting蛋白印迹分析，所述方法见效果例一。
[0127] 图8为蛋白印迹技术检测Di-CAR融合蛋白在Di-CAR慢病毒转染乳腺癌患者来源的 T淋巴细胞，以及Di-CAR融合蛋白大肠杆菌中表达水平（阳性对照），即western blotting结 果图，在两例患者中均出现两条带，其中一条为CD47-CAR，约为479氨基酸残基，分子量约 53kD;另一条为TAZ-CAR，约417氨基酸残基，分子量约为46kD。第1条带为Di-CAR慢病毒转染 乳腺癌T淋巴细胞，第2条带为Di-CAR融合蛋白大肠杆菌中表达，条带分子量约为99kD，即 CD47-CAR和TAZ-CAR分子量之和。
[0128] 取实施例一制备的乳腺癌患者来源第14天培养获得的IX 106T淋巴细胞，进行流 式抗体染色检测分析。Τ淋巴细胞第一组分别为20yL鼠抗人CD3-FITC、20yL鼠抗人CD4-PE和 20yL鼠抗人CD8-PerCP;第二组分别为20yL鼠抗人FoxP3-FITC、20yL鼠抗人CD4-PE和20yL鼠 抗人CD25-PerCP;同型对照组为20yL mIgGl-FITC、20yL mlgGl-PE和20yL mlgGl-PerCP;放 置4°C冰箱染色30分钟后用roS洗涤3次，然后在FACS Calibur仪器(美国BD公司）上机检测 和分析。
[0129]图9为实施例一制备的乳腺癌患者Di-CAR慢病毒转染T淋巴细胞流式细胞检测，该 Τ淋巴细胞CD3和CD8阳性率为91.09 %，CD4+CD25+FoxP3+阳性率为2.71 %。
[0130] 实施例三
[0131 ]双特异性嵌合抗原受体基因修饰的Τ淋巴细胞体外杀瘤试验
[0132] 分别以乳腺癌细胞系MCF-7和效果例二中制备的CD44+CD24-的乳腺癌干细胞 (Breast stem cells，BSC)为靶细胞，以实施例二中制备的Di-CAR慢病毒转染Τ淋巴细胞作 为效应细胞，按效靶比40:1、20:1、10:1、5:1和2.5:1分别加入96孔培养板中，然后置于37 °C、5 % C02条件下培养4h，均设3个复孔。采用LDH细胞毒实验法测定T淋巴活性:吸取上清液 50yL，置于96孔板中，加入LDH基液50yL，室温避光30min，加入50yL终止液终止反应，490nm 波长处测吸光度(0D)值。按下列公式分别计算PC-3和MCF-7细胞的杀伤率:杀伤率=(实验 组0D值-效应细胞自然释放组0D值-靶细胞自然释放组0D值)/(靶细胞最大释放组0D值-靶 细胞自然释放组0D值）X 100 %。
[0133] 图10为乳腺癌患者来源Di-CAR慢病毒转染T淋巴细胞(Di-CAR-T)对MCF-7和BSC的 杀伤活性，随着效靶比提高，细胞毒性活性也不断提高，Di-CAR慢病毒转染乳腺癌患者T淋 巴细胞杀伤MCF-7和BSC杀伤毒性显著高于未转染的T淋巴细胞，p值为0.016，而且Di-CAR-T 杀伤MCF-7和BSC相比较无差异。
[0134] 实施例五
[0135] 双特异性嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞体内杀瘤实验中的作用
[0136] 取效果例四中使用⑶47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF7建立的裸鼠模型，上述三种细胞接 种建立的乳腺癌裸鼠模型进行分组，A组为实施例一制备的Di-CAR慢病毒转染乳腺癌患者T 淋巴细胞治疗组;B组为实施例一制备的未转染的乳腺癌患者T淋巴细胞治疗组;C组为生理 盐水安慰剂组。A组在Di-CAR慢病毒转染乳腺癌患者T淋巴细胞培养到第14天和第16天尾静 脉注射2 X104细胞/克，B组C组在未转染乳腺癌患者T淋巴细胞培养到第14天和第16天尾静 脉注射2X10 4细胞/克，C组与A和B治疗组同时间，尾静脉注射同体积的生理盐水，各lmL。治 疗后分别于7d、14d、21d和28d拉颈处死，取乳腺癌SCID鼠模型肿瘤组织，计算鼠模型肿瘤大 小。
[0137] 图11 CD47-MCF7、TAZ-MCF7和MCF7的SCID鼠模型T淋巴细胞治疗完之后肿瘤大小 变化曲线，生理盐水组C和Di-CART细胞治疗组A、T淋巴细胞治疗组B相比，治疗组A和B中乳 腺癌肿瘤大小缩少，但治疗组A与治疗组B相比乳腺癌肿瘤大小缩少明显，p值分别为0.004， 其中抗⑶47-MCF7和TAZ-MCF7建立的鼠模型更为明显，而治疗组B杀伤该两种鼠模型效果十 分不明显，表明Di-CAR慢病毒转染乳腺癌患者T淋巴细胞对乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞均 可以引发了强大的杀瘤作用。
【主权项】
1. 一种靶向乳腺癌干细胞的双特异性嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方 法，其特征在于，靶向乳腺癌干细胞抗原CD47和TAZ胞外域，免疫产生特异性结合的单克隆 株，通过基因重组获得与两者特异结合的单链抗体，构建成含抗人CD47和TAZ的双特异嵌合 抗原受体基因 （double chimeric antigen receptor，Di_CAR)，重组到病毒载体上并转染 人T淋巴细胞，可特异结合表达人CD47和TAZ的乳腺癌干细胞； 所述双特异性嵌合抗原受体(Di-CAR)基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染T淋巴细 胞，再将T淋巴细胞培养到第14天，获得Di-CAR-T细胞;通过荧光定量PCR技术检测，转染了 Di-CAR病毒载体的T淋巴细胞其表达Di-CAR基因高于未转染的T淋巴细胞为50倍以上； 所获得的T淋巴细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达CD47和 TAZ的乳腺癌干细胞，同时激活第一信号和共刺激信号而引发抗肿瘤细胞毒性活性，体内体 外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性;其高表达其特异标志物CD3+/CD8+，阳性率高于90%以 上，而调节性T淋巴细胞⑶4+/⑶25+/Foxp3+阳性率低于5%以下。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将人IFN γ -信号肽-scFv(⑶47)-⑶8a铰链 区-CD28-CD 137-〇)3ζ胞内区，以及ScFv(TAZ)-IgD铰链区-TET2通过Furin切割位点和连接 序列连接在一起，形成重组基因序列，基因序列通过化学合成获得，形成完整的双特异性嵌 合抗原受体基因的cDNA，即D i -CAR; 所述的CD47和TAZ基因和蛋白质在乳腺癌组织中高表达，通过荧光定量PCR检测，与正 常乳腺组织相比，两者在乳腺癌组织中表达分别为89.00和134.55倍;蛋白印迹分析检测， 两者在乳腺癌组织中表达分别为正常乳腺组织的23.49和35.67倍。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的CD47和TAZ基因和蛋白质在乳腺 癌干细胞中高表达，体外培养获得的CD44+CD24-乳腺癌干细胞荧光定量PCR检测，与乳腺癌 细胞相比，两者在乳腺癌干细胞中表达分别为23.45和54.33倍;蛋白印迹分析检测，两者在 乳腺癌干细胞中表达分别为乳腺癌细胞的11.56和25.61倍。4. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，通过构建CD47和TAZ两个慢病毒 载体，分别包装后转染乳腺癌细胞，其高表达CD47和TAZ基因与蛋白；体外细胞增殖培养分 析，该两种CD47和TAZ病毒转染的乳腺癌细胞在第7天增殖倍数分别为未转染的乳腺癌细胞 增殖的9.44和12.56倍;Transwell细胞迀移实验中，该两种细胞发生了明显的迀移，而未转 染的乳腺癌细胞迀移不明显。5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，CD47和TAZ两个慢病毒转染的乳 腺癌细胞通过流式细胞仪检测，发现两者表达CD44+CD24-表型明显高于未转染的乳腺癌细 胞，即该两种乳腺癌细胞的CD44+CD24-阳性率分别为67.56%和78.90%，而未转染的乳腺 癌细胞仅为1.45 %; 裸鼠体内成瘤实验中，仅100个CD47和TAZ病毒转染的乳腺癌细胞接种时，在第7天就形 成肿瘤，而未转染的乳腺癌细胞接种106数量级时方形成肿瘤，表明高表达了CD47和TAZ的 乳腺癌细胞具有肿瘤干细胞的表型和特性。6. 根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述的双特异性嵌合抗原受体含 有CD47和TAZ嵌合抗原受体基因，包括CD47的单链抗体并链接了特异结合IL-6基因转录抑 制剂DNA修饰酶的基因片段，可抑制IL-6基因的表达;特异结合TAZ的单链抗体并串联了两 个共刺激分子胞内域和CD3G胞内信号区的基因片段;所述两个共刺激分子为CD28和CD137; 双特异性嵌合抗原受体基因之间链接了弗林蛋白酶切割位点，其在细胞内蛋白翻译后可产 生两个独立发挥功能的嵌合抗原受体。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于， 采集来源于乳腺癌患者自体外周血50-100ml，经淋巴细胞分离液分离纯化得到单个核 细胞后，用无血清培养基重悬并稀释到2-5 X IO6细胞/ml，并补充l-500ng/ml IL-Ια、10-2000IU/ml IL-2和5%自体血清，取IOml加入到鼠抗人CD3(OKT3)包被的75cm2培养瓶中，于 37°C、含5 % CO2培养箱培养到第3天;第3天离心收获T淋巴细胞，并通过苔盼兰计数； 第3天收获的T淋巴细胞用无血清培养基重悬为5-10 X IO6细胞/ml，取6ml加入到0KT3包 被的75cm2培养瓶中，并加入100μΙ 1E+7 TU/ml重组Di-CAR慢病毒，体系为6ml，混匀，37°C、 5%C02的培养箱中孵育8-12个小时后，更换无血清培养基10ml，所述完全培养液优选含1_ 500即/111111^-1€[、10-200011]/111111^-2和5%自体血清 ；当1'淋巴细胞生长密度达到10\106 细胞/ml时，转入新的75cm2培养瓶中生长，并补充完全无血清培养液到50ml培养体系；于37 °C、含5%C0 2培养箱内培养到第14天，期间根据T淋巴细胞密度和培养基颜色变化补充含 10-2000IU/ml IL-2和5%自体血清新鲜完全无血清培养液，或扩瓶到175cm2培养瓶中或转 移到1-3L培养袋中生长； 培养到第14天的T淋巴细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了Di-CAR病毒载体的T淋 巴细胞其表达Di-CAR基因高于未转染的T淋巴细胞为50倍以上；蛋白印迹技术检测其Di-CAR融合蛋白表达水平，可表达scFv(CD47)-CAR 53kDa和scFv(TAZ)-CAR 42kDa的融合蛋 白。8. -种靶向乳腺癌干细胞的双特异性嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的制备方 法，其特征在于， 将人IFN γ -信号肽-scFv(CD47)-CD8a铰链区-CD28-CD137-CD3G胞内区，以及scFv (TAZ)-IgD铰链区-TET2通过Furin切割位点和连接序列的基因片段构成。 将人IFN γ -信号肽-scFv(CD47)-CD8a铰链区-CD28-CD137-CD3G胞内区，以及scFv (TAZ)-IgD铰链区-TET2通过Furin切割位点和连接序列（Linker)连接在一起，形成重组基 因序列，基因序列通过化学合成获得，形成完整的双特异性嵌合抗原受体基因的cDNAJP Di-CAR 5Di-CAR慢病毒载体构建和包装方法与效果例三所述的方法一样，获得Di-CAR慢病 毒取上清荧光法测定滴度，病毒按照50μ1 2E+8 TU/ml分装，保存于-80°C超低温冰箱，即制 备成Di-CAR慢病毒； 采集乳腺癌患者患者50ml，加入等量IXPBS稀释，沿离心管管壁轻轻叠加于淋巴细胞 分离液上，形成明显界面，室温下2000rpm离心20min，吸取界面层的PBMC，用I XI3BS洗涤两 次；苔盘兰计数后，用VIV0-15无血清培养基重悬并稀释到3 X IO6细胞/ml，并补充50ng/ml IL-la、500IU/ml IL-2和5%自体血清，取IOml加入到鼠抗人CD3(0KT3)包被的75cm2培养瓶 中，于37°C、含5 % CO2培养箱培养到第3天;第3天离心收获T淋巴细胞，并通过苔盼兰计数； 第3天收获的T淋巴细胞用无血清培养基重悬为5-10 X IO6细胞/ml，取6ml加入到0KT3包 被的75cm2培养瓶中，并加入100μΙ 1E+7 TU/ml重组Di-CAR慢病毒，体系为6ml，混匀，37°C、 5%C02的培养箱中孵育8-12个小时后，更换无血清培养基10ml，所述完全培养液优选含 50ng/ml IL-la、500IU/ml IL-2和5%自体血清；当T淋巴细胞生长密度达到10父106细胞/ ml时，转入新的75cm2培养瓶中生长，并补充完全无血清培养液到50ml培养体系；于37°C、含 5. CO2培养箱内培养到第14天，期间根据T淋巴细胞密度和培养基颜色变化补充含500IU/ ml IL-2和5%自体血清新鲜完全无血清培养液，转移到2L培养袋中生长； 通过荧光定量PCR技术检测培养到第14天的T淋巴细胞，转染了Di-CAR病毒载体的T淋 巴细胞其表达Di-CAR基因高于未转染的T淋巴细胞为125.6倍； 其中，所述Di-CAR慢病毒载体构建和包装方法如下， 将人⑶47和TAZ基因片段设计含EcoR I/Hind III引物，通过PCR分别从人外周血中扩 增获得，ρΕΤ-llc载体EcoR I/Hind III双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将CD47和TAZ PCR 产物分别与酶切后的ρΕΤ-llc于4 °C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受 态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定;PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合 CD47和TAZ大小和序列后，将测序正确的菌液转接于IOml含相应抗生素的LB液体培养基中， 37°C培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的 重组质粒放置-80°C超低温冰箱中长期保存;所述⑶47和TAZ大小分别为887bp和1208bp; 将CD47和TAZ的目的DNA片段和GV358载体Pst I/Pst I双酶切后，在T4DNA连接酶作用 下，将两者于37°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行 阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定； 取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个IOcm的培养皿6 X IO6个细胞数接种于培养皿中，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜;第二天转染前移去培养 液，换5ml Opti-MEM培养液;取9yg包装混合液和3yg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM 中，轻轻混匀，取36μ1 lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置 5min;混合质粒溶液和I ipofectamine 2000稀释液，置室温20min;混合液缓慢滴加至293T 细胞的培养液中，混匀，于37 °C、5 % CO2细胞培养箱中培养;培养6h后弃去含有转染混和物 的培养基，加入I Oml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃； 缓慢加入含10 %血清的细胞培养基20ml，于37°C、含5 % CO2培养箱内继续培养72h; 根据细胞状态，收集转染后48h的293T细胞上清液;于4°C，4000g离心10min，除去细胞 碎片；以0.45μπι滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的 超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h， 离心温度控制在4°C;离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存 液，轻轻反复吹打重悬;经充分溶解后，高速离心lOOOOrpm，离心5min后，取上清荧光法测定 滴度，病毒按照50μ1 2E+8 TU/ml分装，保存于-80°C超低温冰箱，即制备成了CD47和TAZ两 种慢病毒； 所述Di-CAR慢病毒转染T淋巴细胞流式细胞检测，该T淋巴细胞CD3和CD8阳性率为 91 · 09 %，CD4+CD25+FoxP3+ 阳性率为2 · 71 %。9. 一种制备靶向乳腺癌干细胞的双特异性嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的试剂 盒，其特征在于，所述试剂盒包括： (1) 获得权利要求1-8任一项所述的稳定表达Di-CAR的病毒载体； (2) T淋巴细胞因子，包括IL-Ia和IL-2; (3) 0ΚΤ3包被75cm2培养瓶； (4) 淋巴细胞培养基，包括无血清培养基； (5) 淋巴细胞分离液； (6) 生理盐水； (7) 使用说明书； 其中，所述使用说明书包括权利要求1-8中任一项所述的方法。10.-种权利要求1-9中任一项所述靶向乳腺癌干细胞的双特异性嵌合抗原受体基因 修饰的T淋巴细胞的用途。
【文档编号】A61K35/17GK105950561SQ201610353118
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】王锦杰, 宋现让
【申请人】江苏杰晟生物科技有限公司