热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用
【专利摘要】本发明提供了热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用，本发明使用易错PCR 方法对野生型葡萄糖氧化酶基因进行突变，再通过高通量筛选方法将正突变检出。经上述突变文库构建、筛选方法，获得3个热稳定性显著提高的葡萄糖氧化酶突变体，热稳定性比野生型提高1?3 倍，具有良好的市场应用前景和工业价值。
【专利说明】
热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程和酶工程领域，具体内容涉及热稳定性提高的葡萄糖氧化酶 突变体及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,E.C. 1.1.3.4，G0D)有氧条件下能专一性地催化 β-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶是目前主要的工具酶之一，被广泛应用 于在食品工业、畜牧养殖和医疗检测等领域。葡萄糖氧化酶作为公认的安全抗氧剂应用于 食品加工工艺中，在医疗产业中，葡萄糖氧化酶可以用于血糖测定等方向，作为一种饲料添 加剂，葡萄糖氧化酶可以改善动物肠道环境，促进动物生长。随着葡萄糖氧化酶越来越多的 被应用于各个领域，工业上尤其是饲料工业对其现有性能有了越来越高的要求，如在常温 下较长时间保持酶活力不下降，对热和极端pH条件具有耐受性，对消化酶具有耐受性。其中 酶的热稳定性对于葡萄糖氧化酶的应用非常关键，在酶的制备过程中和极端反应条件下 (高温），耐热性强的酶有着比较大的优势。
[0003] 易错PCR(error-prone PCR)技术是一种在DNA序列中制造随机突变的方法，其基 本原理是在PCR扩增目的基因时，通过改变传统PCR过程的反应条件(如提高酶离子浓度，改 变体系中4种dNTP的浓度等），使用较低保真度的Taq酶，从而以一定频率随机引入错误碱 基，从而形成序列不同的突变体库。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用，本发明 提供的葡萄糖氧化酶突变体热稳定性有了显著的提升。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
[0006] 本发明提供了 一种热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-2，所述的葡萄糖 氧化酶突变体G0D-H-2的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，所述的突变体G0D-H-2序列由氨 基酸序列为SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第143位氨基酸由丙氨酸变为脯氨酸、第461位 氨基酸由苯丙氨酸变为异亮氨酸获得。
[0007] 本发明提供了所述的葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-2的葡萄糖氧化酶编码基因。
[0008] 本发明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
[0009] 本发明提供了 一种热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-5，所述的葡萄糖 氧化酶突变体G0D-H-5的氨基酸序列如SEQ ID勵:7所示，所述的突变体600-!1-5序列由氨 基酸序列为SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第29位氨基酸由异亮氨酸变为亮氨酸、第143位 氨基酸由丙氨酸变为脯氨酸、第390位氨基酸由甘氨酸变为精氨酸、第461位氨基酸由苯丙 氨酸变为异亮氨酸获得。
[0010] 本发明提供了所述的葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-5的葡萄糖氧化酶编码基因。
[0011] 本发明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
[0012] 本发明提供了 一种热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-6，所述的葡萄糖 氧化酶突变体G0D-H-6的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示，所述的突变体G0D-H-6序列由氨 基酸序列为SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第143位氨基酸由丙氨酸变为脯氨酸、第241位 氨基酸由脯氨酸变为天门冬氨酸、第359位氨基酸由苏氨酸变为丝氨酸、第461位氨基酸由 苯丙氨酸变为异亮氨酸获得。
[0013] 本发明提供了所述的葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-6的葡萄糖氧化酶编码基因。
[0014] 本发明提供了含有所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。
[0015] 本发明提供了葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-2、G0D-H-5和G0D-H-6在用于制备动物 饲料添加剂中的应用。
[0016] 本发明的优点和技术效果是:本发明的目的是采用定向进化技术对来源于黑曲霉 (Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶进行蛋白质工程改造，为达到上述发明目的，本发明 使用易错PCR方法对葡萄糖氧化酶基因进行突变，再通过高通量筛选方法将正突变检出，得 到热稳定性提高的突变体，相比野生型葡萄糖氧化酶GOD-1，本发明的6个突变体G0D-H-1、 600-!1-2、600-!1-3、600-!1-4、600-!1-5、600-!1-6热稳定性明显提高，在80°(：处理3111丨11后，残余 酶活分别提高了 1.3、1.6、1.9、2.1、2.5、2.3倍。本发明提供的突变体具有良好的市场应用 前景和工业价值
【附图说明】
[0017]图1是葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-1与野生型氨基酸序列比对图；
[0018] 图2是葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-2与野生型氨基酸序列比对图；
[0019] 图3是葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-3与野生型氨基酸序列比对图；
[0020] 图4是葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-4与野生型氨基酸序列比对图；
[0021 ]图5是葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-5与野生型氨基酸序列比对图；
[0022] 图6是葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-6与野生型氨基酸序列比对图；
[0023] 图 7为葡萄糖氧化酶突变体 G0D-H-1、G0D-H-2、G0D-H-3、G0D-H-4、G0D-H-5、G0D-H-6在不同温度下的残余酶活。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
[0025] 本发明用到了分子生物学领域使用的常规技术和方法。实施例仅是用于解释本发 明，不限制本发明的保护范围。
[0026] 实施例1:易错PCR(err〇r-pr〇ne PCR)方法构建葡萄糖氧化酶G0D-1突变文库
[0027] 来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶基因 G0D-1由589个氨基酸构 成(如SEQ ID N0:1所示），采用全基因合成的方法合成了该葡萄糖氧化酶基因 G0D-1(如SEQ ID N0:2所示），合成的基因两端还带有EcoR I和Not I酶切位点。以合成的该基因为模板扩 增葡萄糖氧化酶G0D-1基因，使用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)随机引入 突变。
[0028] 所用引物为：5' -GCGCGAATTCCGCTGCGGCCCTGCCACACTAC-3' (SEQ ID No：9),
[0029] 57-TAAAGCGGCCGCTCACTGCATGGAAGCATAATCTTCCAAGATAGCATCC-3 7(SEQ ID No： 10)〇
[0030]下划线处分别为EcoR I和Not頂每切位点。
[0031] 反应条件为:94°C预变性10min，94°C变性60s，58°C退火60s和72°C延伸2min，共30 个循环，回收目的基因片段。
[0032] 将目的片段用EcoR I和Not I双酶切消化后，与经过相同酶切的pET 21a( + )载体 (氨苄抗性基因）用Ligase进行连接反应。将连接好的片段转化至大肠杆菌BL21-DE3,涂布 含有氨苄青霉素的LB平板，37°C倒置培养，待平板上出现转化子后，挑取单克隆至96孔板， 每孔中含有150uL LB培养基(含有ImM IPTG，50ng/mL氨苄青霉素），30°C220rpm震荡培养 12h，将孔板置于-20°C，反复冻融破壁，获得含有葡萄糖氧化酶的粗酶液。分别取出5ul裂解 液至两块新的96孔板，其中一块于80°C处理3min，两块96孔板都加入含有邻联茴香胺甲醇 缓冲液、葡萄糖缓冲液、辣根过氧化物酶溶液的显色液，37 °C反应3min后加入100uL2M硫酸 终止反应，根据显色反应测定残余酶活。
[0033]取残余活性比野生型G0D-1高的菌株到新的96孔培养板中，进行重复筛选。筛选到 2个突变体，分别为G0D-H-1和G0D-H-2，残余活性是野生型对照的1-3倍，对这两个突变体进 行DNA测序。
[0034] 测序结果显示，如图1和图2所示，本轮易错PCR获得了一个含K122N和G492E的两点 突变的突变体G0D-H-1，其氨基酸序列为SEQ ID N0:3,一个含A143P和F461I的两点突变的 突变体G0D-H-2,其氨基酸序列为SEQ ID N0:4。
[0035] G0D-H-1:该酶的第122位的赖氨酸K变为天冬酰胺N(AAG变为AAC)，第492位的甘氨 酸G变为谷氨酸E(GGG变为GAG)。
[0036] G0D-H-2:该酶的第143位的丙氨酸A变为脯氨酸P(GCC变为CCC)，第461位的苯丙氨 酸F变为异亮氨酸I(TTC变为ATC)。
[0037]实施例2:第二轮易错PCR突变文库的构建和筛选突变文库的构建 [0038]将第一轮易错PCR方法筛选到的耐热性提高的两个突变体G0D-H01和G0D-H02分别 提取质粒作第二轮易错PCR的模板，突变文库的构建过程，使用的引物，PCR反应条件，同实 施例1。
[0039]通过第二轮易错PCR，同样获得了大量的突变体基因片段。将构建得到的突变体转 入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，筛选耐热性正突变时以G0D-H-1和G0D-H-2为对照，其余操 作与实施例2相同，取残余活性比突变型G0D-H-1和G0D-H-2高的菌株到新的96孔培养板中， 进行重复筛选。
[0040] 本轮筛选共获得4个突变体，分别命名为G0D-H-3、G0D-H-4，G0D-H-5和G0D-H-6。其 中G0D-H-3和G0D-H-4是以G0D-H01为模板获得的突变体，其热稳定性高于G0D-H01，G0D-H-5 和G0D-H-6是以G0D-H02为模板获得的突变体，其热稳定性高于G0D-H02,挑取突变体菌株送 测序公司测序。
[0041 ] 测序结果显示，如图3、图4、图5和图6所示，本轮易错PCR获得一个含D70Q、K122N和 G492E的三点突变的突变体G0D-H-3,其氨基酸序列为SEQ ID N0:5。一个含K122N、Q263P、 R341S和G492E的四点突变的突变体G0D-H-4,其氨基酸序列为SEQ ID N0:6。一个含I29L、 A143P、G390R和F461I的四点突变的突变体G0D-H-5，其氨基酸序列为SEQIDN0:7。一个含 A143P、P241D、T359S和F4611的四点突变的突变体G0D-H-6，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 8。
[0042] G0D-H-3:该酶的第70位天冬氨酸D变为谷氨酸Q(DNA序列由GAC变为GAA)，第122位 的赖氨酸K变为天冬酰胺N(AAG变为AAC)，第492位的甘氨酸G变为谷氨酸E(GGG变为GAG)。 [0043] G0D-H-4:该酶的第122位的赖氨酸K变为天冬酰胺N(AAG变为AAC)，第263为的谷氨 酰胺Q变为脯氨酸P(CAG变为CCG)，第341位的精氨酸R变为丝氨酸S(CGC变为AGC)，第492位 的甘氨酸G变为谷氨酸E(GGG变为GAG)。
[0044] G0D-H-5:该酶的第29位的异亮氨酸I变为亮氨酸L(AUC变为CUC)，第143位的丙氨 酸A变为脯氨酸P(GCC变为CCC)，第390位的甘氨酸G变为精氨酸R(GGC变为CGC)，第461位的 苯丙氨酸F变为异亮氨酸I(TTC变为ATC)。
[0045] G0D-H-6:该酶的第143位的丙氨酸A变为脯氨酸P(GCC变为CCC)，第241位的脯氨酸 P变为天门冬氨酸D(CCC变为GAC)，第359位的苏氨酸T变为丝氨酸S(ACC变为UCC)，第461位 的苯丙氨酸F变为异亮氨酸I(TTC变为ATC)。
[0046] 实施例3:毕赤酵母工程菌株的构建
[0047] 使用实施例1中所述引物，以实施例1和实施例2所获得的突变体作为模板进行PCR 扩增，PCR反应条件与实施例1相同。
[0048] 将扩增得到的实施例1及实施例2所述葡萄糖氧化酶突变体基因片段，以及野生型 基因片段，通过EcoR I和Not I位点与表达载体pPIC9K相连接，构建表达载体?？1091(-600-1、pPIC9K-G0D-H-1、pPIC9K-G0D-H-2、pPIC9K-G0D-H-3、pPIC9K-G0D-H-4、pPIC9K-G0D-H-5 和PPIC9K-G0D-H-6。将表达载体转入大肠杆菌DH5a感受态，挑取转化子后大量提取质粒。
[0049] 将以上表达质粒用Sail进行线性化，线性化片段用片段纯化试剂盒（TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purifibation Kit)纯化收集后，通过电转化方法转化毕赤酵母 GS115，涂布MD平板。将在MD平板上生长出的菌落涂布到浓度依次逐渐升高（lmg/mL，2mg/ mL，4mg/mL，8mg/mL)的遗传霉素的YH)平板上筛选多拷贝的阳性转化子，得到毕赤酵母重组 菌株。
[0050] 将7个基因的转化子分别命名为毕赤酵母600-1(?丨吐丨3口38如^8 600-1)、600-H_l(Pichia pastoris G0D-H-1)、毕赤酵母G0D-H_2(Pichia pastoris G0D-H-2)、毕赤酵 母G0D-H_3(Pichia pastoris G0D-H-3)、毕赤酵母G0D-H_4(Pichia pastoris G0D-H-4)、 毕赤酵母G0D-H_5(Pichia pastoris G0D-H-5)和毕赤酵母G0D-H_6(Pichia pastoris G0D-H-6)，分别挑取每个基因的转化子转接于BMGY培养基中，30°C，220rpm振荡培养18h后， 离心获得菌体，将适量菌体转入BMMY培养基中，使菌体浓度达到0D600 = 1，30°C，220rpm继 续振荡培养，每24h添加培养体积1 %的甲醇。诱导表达4d后，将培养液离心获得上清，将上 清液进行葡萄糖氧化酶活力测定和热稳定性测定。
[0051 ]实施例4:突变体和野生型表达产物酶活力及热稳定性的测定 [0052]酶活力测定方法：
[0053] 取邻联茴香胺缓冲液2.5mL(0 . lmLl %邻联茴香胺甲醇储备液加入到12mL 0.1M pH6.0磷酸缓冲液配成），18%葡萄糖溶液0.3mL，0.03 %过氧化物酶溶液0. lmL，加入到比色 管中37°C保温5min，再加入0. lmL葡萄糖氧化酶酶液(空白管加入0. lmL蒸馏水），反应3min 后，加入2M硫酸2mL，混匀以终止反应。以标准空白样为空白对照，在540nm波长处测定空白 (A〇)和试样溶液(心)的吸光值。得出Δ A=Ai-Ao
[0054]试样酶活力计算：
[0055] X=( AAXnX3)/(11.3XtX0.1)
[0056] T一测定时间，min
[0057] 0.1-样品体积，mL
[0058] 11.3-消光系数
[0059] N-稀释倍数 [0060] 3-反应液体积，mL
[00611酶活单位与定义:在pH5.5、37°C的条件下，每分钟能把1. Ownol的β-D-葡萄糖氧化 成葡萄糖酸和H202的酶量为一个单位。
[0062]将实施例3所述发酵上清液用pH 6.0的磷酸缓冲液稀释至约20U/mL，在80°C条件 下处理3min后，测定残余酶活，以未处理样品的酶活为100%，计算相对酶活。结果如图7所 示，野生型葡萄糖氧化酶在80°C条件下处理3min，酶活仅剩23%，而突变体600-!1-1、6(?-!!- 2、600-!1-3、600-!1-4,600-!1-5和600-!1-6同样在80°(：条件下处理3111丨11仍能保持30-60%的酶 活。其耐热性分别与野生型基因相比，分别提高了 1.3、1.6、2.2、2.1、2.7、2.3倍。
[0063] 由此可见，突变后的葡萄糖氧化酶的耐热性与野生型相比有了较大提高，更加有 利于其在工业中的应用。
[0064] 实施例5:葡萄糖氧化酶的养殖应用实验
[0065] 5.1实验设计
[0066]白羽肉鸡苗购自某种禽厂，共分为8栋鸡舍，每一鸡舍20000只鸡，其中1、2、3、4为 对照组，5、6、7、8为实验组，实验组在基础日粮中添加0.2U/g本发明提供的葡萄糖氧化酶 G0D-H-5,实验为期40天。
[0067] 5.2生产性能测定
[0068] 分别实验开始第2、40天对各组鸡空腹称重，记录初始重和末重。饲养过程中，观察 记录各组鸡的健康状况，并记录每周每笼采食量，统计实验期内的成活率、料重比及计算欧 洲指数。实验结果：
[0069] 表1对照组生产性能数据
[0071 ]表2实验组生产性能数据
[0073] 与对照组相比，实验组的均重有所增加，成活率也有所增加，而料重比有所下降， 经过计算欧洲指数上升了 2.9 %，表明在日粮中添加了葡萄糖氧化酶G0D-H-5使养殖效益有 所增加。
[0074] 本实施例5为了便于体现本发明所述的葡萄糖氧化酶的应用，并不限于肉鸡的应 用，因为所述的葡萄糖氧化酶可以添加到基础日粮中，可以用于其他畜禽类的饲喂。通常可 以在猪、兔和奶牛等养殖过程中在其配合饲料中添加。
[0075] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实 施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施 例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替 换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
【主权项】
1. 一种热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-2,其特征在于:所述的葡萄糖氧化 酶突变体G0D-H-2的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，所述的突变体G0D-H-2序列由氨基酸 序列为SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第143位氨基酸由丙氨酸变为脯氨酸、第461位氨基 酸由苯丙氨酸变为异亮氨酸获得。2. 权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-2的葡萄糖氧化酶编码基因。3. 含有权利要求2所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。4. 一种热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-5，其特征在于:所述的葡萄糖氧化 酶突变体G0D-H-5的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示，所述的突变体G0D-H-5序列由氨基酸 序列为SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第29位氨基酸由异亮氨酸变为亮氨酸、第143位氨基 酸由丙氨酸变为脯氨酸、第390位氨基酸由甘氨酸变为精氨酸、第461位氨基酸由苯丙氨酸 变为异亮氨酸获得。5. 权利要求4所述的葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-5的葡萄糖氧化酶编码基因。6. 含有权利要求5所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。7. -种热稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-6，其特征在于:所述的葡萄糖氧化 酶突变体G0D-H-6的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示，所述的突变体G0D-H-6序列由氨基酸 序列为SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第143位氨基酸由丙氨酸变为脯氨酸、第241位氨基 酸由脯氨酸变为天门冬氨酸、第359位氨基酸由苏氨酸变为丝氨酸、第461位氨基酸由苯丙 氨酸变为异亮氨酸获得。8. 权利要求7所述的葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-6的葡萄糖氧化酶编码基因。9. 含有权利要求8所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组菌株。10. 葡萄糖氧化酶突变体G0D-H-2、G0D-H-5和G0D-H-6在用于制备动物饲料添加剂中的 应用。
【文档编号】C12N15/53GK105950577SQ201610528932
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】肖志壮, 张稳, 李俊安, 赵志强, 武传菊
【申请人】青岛红樱桃生物技术有限公司