一种制备蛋白质UGTCs4的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备蛋白质UGTCs4的方法，蛋白质UGTCs4具有藏红花酸糖基转移酶活性。本发明所提供的方法包括如下步骤：培养工程菌，得到所述蛋白质UGTCs4；所述工程菌为将重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌；所述重组表达载体为将所述蛋白质UGTCs4的编码基因插入表达载体得到的重组质粒。实验证明，利用本发明所提供的方法制备的蛋白质UGTCs4可顺序糖基化藏红花酸形成藏红花素苷5和藏红花素苷3，对生产藏红花素苷5和/或藏红花素苷3、制备具有藏红花酸糖基转移酶功能的产品或催化藏红花酸发生糖基化均具有重要应用价值。
【专利说明】
一种制备蛋白质UGTCs4的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备蛋白质UGTCs4的方法。
【背景技术】
[0002] 藏红花又叫番红花、西红花，为多年生的鸾尾科植物番红花(Crocus sativus L.) 的干燥柱头，是我国的一种名贵中药。藏红花总苷是从藏红花中提取的色素类化合物，其主 要成分为藏红花素(crocus)、藏红花酸(crocetin)及其衍生物，其中藏红花素是藏红花酸 与不同糖结合而成的一系列酯苷，是藏红花的主要活性成分之一，具有抗血小板聚集、抗血 栓形成、抗心肌缺血、抗癌等多种药理作用，而且几乎无毒副作用。现有研究表明，藏红花酸 糖基转移酶具有糖基化藏红花酸形成藏红花素的功能，如2004年Morgan等从藏红花花柱中 分离发现UGTCs2基因（GeneID :AY36026)，其原核表达的粗蛋白具有糖基化藏红花酸形成藏 红花素的功能，因此将UGTCs2基因注释为藏红花酸糖基转移酶的编码基因；再如2012年Mai Nagatoshi从栀子细胞中分离发现UGT75L6基因（GeneID :AB555731 )和UGT94E5基因 (GenelD: 555739)，UGT75L6基因原核表达的蛋白粗提物具有顺序糖基化藏红花酸形成藏红 花素苷5、藏红花素苷3和藏红花素苷4的功能，UGT94E5基因原核表达的蛋白粗提物具有糖 基化藏红花素苷5形成藏红花素苷2和藏红花素苷1的功能，因此，将UGT75L6基因和UGT94E5 基因也均注释为藏红花酸糖基转移酶的编码基因。但截至目前，仍无法获得高纯度的藏红 花酸糖基转移酶。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是如何制备具有藏红花酸糖基转移酶活性的蛋白质。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备蛋白质UGTCS4的方法，所述蛋 白质UGTCs4具有藏红花酸糖基转移酶活性。
[0005] 本发明所提供的制备蛋白质UGTCs4的方法，可包括如下步骤:培养工程菌，得到所 述蛋白质UGTCs4;所述工程菌为将重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌;所述重组表达 载体为将所述蛋白质UGTCs4的编码基因插入表达载体得到的重组质粒；
[0006] 所述蛋白质UGTCs4可为如下al)或a2)或a3)或a4):
[0007] al)氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白质；
[0008] a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0009] a3)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；
[0010] a4)将al)或a2)或a3)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有藏红花酸糖基转移酶活性的蛋白质。
[0011] 其中，序列表中序列2可由459个氨基酸残基组成;序列表中序列4可由492个氨基 酸残基组成。
[0012] 为了使al)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所不的蛋白质的氣基末端或 羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0013] 表1、标签的序列
[0015] 上述a4)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为 不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0016] 上述a4)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0017] 上述a4)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1或序列表中序列3所示的 DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突 变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0018] 上述方法中，所述蛋白质UGTCS4的编码基因具体可为如下bl)或b2)或b3)或b4)所 不的DNA分子：
[0019] bl)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0020] b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
[0021] b3)与bl)或b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1 中所述蛋白质UGTCs4的DNA分子；
[0022] b4)在严格条件下与bl)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋 白质UGTCs4的DNA分子。
[0023] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0024]其中，序列表中序列1由1377个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表 中序列2所示的氨基酸序列;序列表中序列3由1476个核苷酸组成，序列表中序列3的核苷酸 编码序列表中序列4所示的氨基酸序列。
[0025] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码所述蛋白质UGTCs4的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有 与本发明分离得到的所述蛋白质UGTCs4的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要 编码所述蛋白质UGTCs4,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0026] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本发 明的编码序列表的序列2或序列表的序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列 具有75%或更高，或80%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核 苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之 间的同一性可以用百分比（％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0027] 上述方法中，所述重组表达载体可为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列 1所示的DNA分子得到的重组质粒。
[0028] 所述表达载体可为载体pET_28a( + )。
[0029]上述方法中，所述重组表达载体具体可为在载体pET_28a( + )的Nde I识别位点和 Sal I识别位点之间插入序列表的序列1所示的DNA分子得到的重组质粒pET28a-UGTCs4。重 组质粒pET28a-UGTCs4表达序列表的序列4所示的蛋白质。
[0030]上述方法中，所述宿主菌可为大肠杆菌。
[0031] 所述大肠杆菌可为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
[0032]上述方法中，所述"培养工程菌"的过程中，进行IPTG诱导。
[0033] 上述方法中，所述"IPTG诱导"的方法如下：当培养体系的0D6_m值为0.3~0.4时， 加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μΜ~600μΜ(如50μΜ、100μΜ、200μΜ、300μΜ、400μΜ、 500μΜ、600μΜ、50μΜ~100μΜ、50μΜ~200μΜ、50μΜ~300μΜ、50μΜ~400μΜ、50μΜ~500μΜ、50μΜ ~600μΜ、100μΜ~200μΜ、100μΜ~300μΜ、100μΜ~400μΜ、100μΜ~500μΜ、100μΜ~600μΜ、200μ Μ~300μΜ、200μΜ~400μΜ、200μΜ~500μΜ、200μΜ~600μΜ、300μΜ~400μΜ、300μΜ~500μΜ、300 μΜ~600μΜ、400μΜ~500μΜ、400μΜ~600μΜ或500μΜ~600μΜ)。
[0034] 所述"加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μΜ~600μΜ"指的是所述IPTG在培 养体系中的初始浓度。
[0035] 上述方法中，所述"培养工程菌"可包括如下步骤：
[0036] (1)在18 °C~20 °C (如18 °C或20 °C)条件下进行培养，直至培养体系的0D6Q(U直为 0.3 ~0.4;
[0037] (2)完成步骤（1)后，加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μΜ~600μΜ，18 °C~ 20°(：(如18°(：或20°(：)培养611~1811(如611、811、1011、1211、1411、1611、1811、611~811、611~1011、611~ 12h、6h~14h、6h~16h、6h~18h、8h~10h、8h~12h、8h~14h、8h~16h、8h~18h、10h~12h、 10h~14h、10h~16h、10h~18h、12h~14h、12h~16h、12h~18h、14h~16h、14h~18hSl6h ~18h) 〇
[0038] 所述步骤(1)中，所述培养可为振荡培养。所述振荡培养的转速具体可为lOOrpm~ 140rpm，更具体可为120rpm。
[0039] 所述步骤(2)中，所述培养可为振荡培养。所述振荡培养的转速具体可为lOOrpm~ 140rpm，更具体可为120rpm。
[0040]所述步骤(2)中，所述"加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μΜ~600μΜ"中的 浓度指的是所述IPTG在培养体系中的初始浓度。
[0041] 上述方法中，所述"培养工程菌"还可包括步骤(3):完成所述步骤(2)后，离心收集 菌体。离心参数可为5000rpm离心10min。
[0042] 上述方法中，所述"培养工程菌"还可包括步骤(4):取所述步骤(3)得到的菌体，对 所述菌体进行破碎，然后离心收集上清液（该上清液即为含有蛋白质UGTCs4的粗蛋白溶 液）。离心参数可为4°C、13000rpm离心30min。
[0043] 上述方法中，所述"培养工程菌"还可包括步骤(5):取所述步骤(4)得到的上清液， 进行镍柱亲和层析纯化，得到过柱后溶液(即为蛋白质UGTCs4溶液）。
[0044] 所述步骤(5)中，所述镍柱亲和层析纯化具体包括先用裂解缓冲液平衡镍柱，然后 上样所述步骤(4)得到的上清液，再依次用含20mmo 1 /L咪唑的洗涤缓冲液、含80mmo 1/L咪挫 的洗涤缓冲液和含100mm〇l/L咪唑的洗涤缓冲液冲洗镍柱，最后用含250mmol/L咪唑的洗涤 缓冲液冲洗镍柱。
[0045] 所述裂解缓冲液可为含300mmol/L NaCl和10mmol/L咪唑的pH7.4、100mmol/L Tris-HCl缓冲液。
[0046] 所述洗涤缓冲液可为含300mmol/L NaCl的pH7.4、100mmol/L Tris-HCl缓冲液。
[0047] 上述方法中，所述"培养工程菌"还可包括步骤(6):在4 °C条件下，将所述步骤(5) 得到的过柱后溶液进行透析除盐。
[0048] 上述方法中，在进行所述步骤（1)之前，还可进行如下步骤(A):将所述重组菌单克 隆接种到5mL液体培养基中，35 °C ~39 °C (如35 °C ~37 °C、37 °C ~39 °C、35 °C、37 °C 或39 °C )、 lOOrpm ~140rpm(如 lOOrpm ~120rpm、120rpm ~140rpm、lOOrpm、120rpm 或 140rpm)振荡培养 lOh~14h(如lOh~12h、12h~14h、10h、12h或14h)，得到种子液;将所述种子液接种到液体 培养基，接种量为1: 1〇〇(体积比）。
[0049] 上述任一所述液体培养基可为含50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基。
[0050]利用上述任一所述方法制备得到的蛋白质UGTCs4也属于本发明的保护范围。
[0051] 利用上述任一所述方法制备得到的蛋白质UGTCs4的应用也属于本发明的保护范 围，所述蛋白质UGTCs4的应用为如下cl)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6):
[0052] cl)作为藏红花酸糖基转移酶的应用；
[0053] c2)在制备具有藏红花酸糖基转移酶功能的产品中的应用。
[0054] c3)在催化藏红花酸发生糖基化中的应用；
[0055] c4)在制备用于催化藏红花酸发生糖基化的产品中的应用。
[0056] c5)在生产藏红花素苷5和/或藏红花素苷3中的应用；
[0057] c6)在制备用于生产藏红花素苷5和/或藏红花素苷3的产品中的应用。
[0058] 上述应用中，所述"生产藏红花素苷5和/或藏红花素苷3"是以藏红花酸作为底物。 [0059]实验证明，利用本发明所提供的制备蛋白质UGTCs4的方法可制备蛋白质UGTCs4， 蛋白质UGTCs4具有藏红花酸糖基转移酶活性，可顺序糖基化藏红花酸形成藏红花素苷5和 藏红花素苷3。本发明所提供的制备蛋白质UGTCs4的方法对生产藏红花素苷5和/或藏红花 素苷3、制备具有藏红花酸糖基转移酶功能的产品或催化藏红花酸发生糖基化均具有重要 应用价值。
【附图说明】
[0060] 图1为UGTCs4基因的PCR扩增产物。
[0061 ]图2为不同浓度IPTG对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响。
[0062] 图3为不同诱导时间对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响。
[0063] 图4为不同菌体浓度对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响。
[0064] 图5为不同诱导温度对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响。
[0065] 图6为不同诱导温度和诱导时间对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响。
[0066]图7为利用镍柱纯化藏红花酸糖基转移酶溶液的SDS-PAGE结果。
[0067]图8为实施例2步骤二中1的实验结果。
[0068]图9为实施例2步骤二中2的实验结果。
[0069]图10为实施例2步骤二中3的实验结果。
[0070]图11为实施例2步骤二中4的实验结果。
[0071]图12为藏红花酸的质谱图。
[0072]图13为藏红花素苷5的质谱图。
【具体实施方式】
[0073]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0074] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0075] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0076] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0077] 载体pET28a( + )为invitrogen公司产品；大肠杆菌BL21(DE3)为天根生化科技（北 京)有限公司产品；镍柱为美国GE公司产品，产品目录号为04003272-EEJTT为Amersco公司 产品，产品目录号为〇28UUDPG(UDP-Glucose)为sigma公司产品，产品目录号为U4625。藏红 花酸为Chromedex公司产品，产品目录号为ASB00003885-010<X18反相柱(4.6mmX250mm)为 日本GL Sciences Inc产品。高效液相色谱仪和二极管阵列检测器为日本岛津公司产品。超 声破碎仪为宁波新芝生物科技有限公司产品。
[0078]下述实施例中的藏红花悬浮细胞为参考陈书安，王晓东等，藏红花细胞悬浮培养 体系的建立及优化.生物技术通报2010. (07): 157-160.中的方法制备。
[0079] LB液体培养基:将lg NaCl、0.5g酵母提取物和lg胰蛋白胨溶于100mL去离子水，调 节pH值为7.0。
[0080]上样缓冲液为含2% (质量体积比）SDS、10% (体积百分比）甘油和1 % (体积百分 比）β-巯基乙醇的pH6.8、50mM Tris-HCl缓冲液。
[0081 ]裂解缓冲液为含300mmol/L NaCl和 10mmol/L咪唑的pH7.4、100mmol/L Tris-HCl 缓冲液。
[0082]洗涤缓冲液为含300mmol/L NaCl的pH7.4、100mmol/L Tris-HCl缓冲液。
[0083]将序列表的序列2所不的蛋白质命名为蛋白质UGTCs4,其编码基因如序列表的序 列1所示。
[0084]实施例1、重组藏红花酸糖基转移酶的制备 [0085] 一、重组质粒的构建
[0086] 1、采用Trizol法提取藏红花悬浮细胞的总RNA，将该总RNA用逆转录酶反转录出第 一链 cDNA。
[0087] 2、人工合成引物FI: 5 ' -CCATATGGAGCAGAAAGATGAGAACGGAA-3 '（下划线为限制性内 切酶Nde I识别序列）和R1:5 ' -CGTCGACTTTACAACAATGATCAATGAACTCCT-3 '（下划线为限制性 内切酶Sal I识别序列）。
[0088] 3、以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的F1和R1为引物进行PCR扩增，得到约 1388bp的PCR扩增产物。用1 %琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1 (M为DNA Marker，泳道1 为PCR扩增产物，箭头所指为目标PCR扩增产物）。
[0089] 反应程序：94°C5min; 94°C30s，68°C30s，72Γ lmin 30s，共35个循环；72Γ 10min。
[0090] 4、用限制性内切酶Nde I和Sal I双酶切步骤3中得到的PCR扩增产物，回收约 1386bp的片段。
[0091] 5、用限制性内切酶Nde I和Sal I双酶切载体pET28a( + )，回收约5350bp的载体骨 架。
[0092] 6、将步骤4得到的片段与步骤5得到的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a-UGTCs4。
[0093] 根据测序结果，对重组质粒pET28a-UGTCs4进行结构描述如下：将载体pET28a( + ) 的Ndel识别序列和Sail识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表中序列1所示 的DNA分子。重组质粒pET28a-UGTCs4中，序列表的序列1所示的DNA分子与载体骨架上的 His-tag标签（由6个组氨酸残基组成）的编码序列融合，形成序列表的序列3所示的融合基 因，表达序列表的序列4所不的具有His_tag标签的蛋白质UGTCs4，具有His_tag标签的蛋白 质UGTCs4即为重组藏红花酸糖基转移酶。序列表的序列4所示的蛋白质的预期分子量为 54.8KD〇
[0094] 二、重组藏红花酸糖基转移酶的表达的最佳条件的摸索
[0095] 1、不同浓度IPTG对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响
[0096] ①将步骤一构建的重组质粒pET28a_UGTCs4导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重 组菌，将该重组菌命名为R〇setta(DE3)-pET28a-UGTCs4。
[0097] ②将R〇setta(DE3)-pET28a-UGTCs4的单克隆接种于5mL含50yg/mL卡那霉素的LB 液体培养基，37 °C、120rpm振荡培养12h，得到培养菌液1。取培养菌液1 0.3mL，以1:100 (体 积比)接种于30mL含50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37°C、180rpm振荡培养至OD600值0.3 ~0.4,得到培养菌液2。
[0098]③完成步骤②后，取培养菌液2,离心，获得IPTG诱导前的菌体。
[0099]④完成步骤②后，向培养菌液2中加入IPTG得到诱导体系，IPTG在诱导体系中的浓 度为 5(^]?、10(^]\1、20(^]\1、30(^]\1、40(^]\1、50(^]\1、60(^]\1或70(^]\1，然后37°(：、120邝111振荡培养 2.5h，离心收集菌体，获得IPTG诱导后的菌体。
[0100]⑤分别取IPTG诱导前的菌体和IPTG诱导后的菌体，加入LB液体培养基至0D6QQ值调 整至一致，25°C、9000rpm离心lmin，弃上清，收集菌体。
[0101]⑥取步骤⑤得到的菌体，加入上样缓冲液，沸水浴煮沸13min;然后25°C、9000rpm 离心1 Omin，收集上清液进行SDS-PAGE。
[0102] 实验结果见图2(M为蛋白marker，1为IPTG诱导前的菌体，2为50μΜ IPTG诱导后的 菌体，3为100μΜ IPTG诱导后的菌体，4为200μΜ IPTG诱导后的菌体，5为300μΜ IPTG诱导后 的菌体，6为400μΜ IPTG诱导后的菌体，7为500μΜ IPTG诱导后的菌体，8为600μΜ IPTG诱导 后的菌体，9为700μΜ IPTG诱导后的菌体，箭头所指为目标蛋白）。结果表明，重组藏红花酸 糖基转移酶的表达的最佳IPTG诱导浓度为50μΜ~600μΜ;当IPTG诱导浓度为700μΜ时，重组 藏红花酸糖基转移酶的表达有一定程度的抑制。
[0103] 2、不同IPTG诱导时间对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响
[0104]①同步骤1中的①。
[0105] ②同步骤1中的②。
[0106] ③同步骤1中的③。
[0107] ④完成步骤②后，完成步骤②后，向培养菌液2中加入IPTG得到诱导体系，IPTG在 诱导体系中的浓度为200μΜ，然后37°C、120rpm振荡培养，培养时间为30min、lh、1.5h、2h、 2.5h、3h或4h，离心收集菌体，获得IPTG诱导后的菌体。
[0108] ⑤同步骤1中的⑤。
[0109] ⑥同步骤1中的⑥。
[0110] 实验结果见图3(M为蛋白marker，l为IPTG诱导前的菌体，2为IPTG诱导30min后的 菌体，3为IPTG诱导lh后的菌体，4为IPTG诱导1.5h后的菌体，5为IPTG诱导2h后的菌体，6为 IPTG诱导2.5h后的菌体，7为IPTG诱导3h后的菌体，8为IPTG诱导4h后的菌体，箭头所指为目 标蛋白）。结果表明，重组藏红花酸糖基转移酶的表达的最佳IPTG诱导时间为30min~4h。
[0111] 3、不同菌体浓度对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响 [0112]①同步骤1中的①。
[0113] ②将R〇setta(DE3)-pET28a-UGTCs4的单克隆接种于5mL含50yg/mL卡那霉素的LB 液体培养基，37 °C、120rpm振荡培养12h，得到培养菌液1。取培养菌液1 0.3mL，以1:100 (体 积比)接种于30mL含50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37°C、180rpm振荡培养，得到培养菌 液2，培养菌液2 的 0D6(x)值为0.32、0.41、0.54、0.63或 0.76。
[0114] ③同步骤1中的③。
[0115] ④完成步骤②后，向培养菌液2中加入IPTG得到诱导体系，IPTG在诱导体系中的浓 度为200μΜ，然后37°C、120rpm振荡培养2.5h，离心收集菌体，获得IPTG诱导后的菌体。
[0116] ⑤同步骤1中的⑤。
[0117] ⑥同步骤1中的⑥。
[0118] 实验结果见图4(M为蛋白marker，1为IPTG诱导前的菌体，2为OD600值为0.32的培养 菌液2IPTG诱导后的菌体，3为OD600值为0.41的培养菌液2IPTG诱导后的菌体，4为0D 6QQ值为 0.54的培养菌液2IPTG诱导后的菌体，5为0D6QQ值为0.63的培养菌液2IPTG诱导后的菌体，6 为〇D_值为0.76的培养菌液2IPTG诱导后的菌体，箭头所指为目标蛋白）。结果表明，重组藏 红花酸糖基转移酶的表达的最佳菌体浓度的OD600值为0.3~0.8。
[0119] 4、不同诱导温度对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响
[0120] (1)诱导温度28°C对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响
[0121] ①同步骤1中的①。
[0122] ②将R〇setta(DE3)-pET28a-UGTCs4的单克隆接种于5mL含50yg/mL卡那霉素的LB 液体培养基，37 °C、120rpm振荡培养12h，得到培养菌液1。取培养菌液1 0.3mL，以1:100 (体 积比)接种于30mL含50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基，28°C、120rpm振荡培养至0D6Q()值0.3 ~0.4,得到培养菌液2。
[0123] ③同步骤1中的③。
[0124] ④完成步骤②后，向培养菌液2中加入IPTG得到诱导体系，IPTG在诱导体系中的浓 度为200μΜ，然后28°C、120rpm振荡培养，培养时间为311、411、511、611、711、811或911，离心收集菌 体，获得IPTG诱导后的菌体。
[0125] ⑤同步骤1中的⑤。
[0126] ⑥同步骤1中的⑥。
[0127] 实验结果见图5(M为蛋白质低分子量marker，1为IPTG诱导前的菌体，2为IPTG诱导 3h后的菌体，3为IPTG诱导4h后的菌体，4为IPTG诱导5h后的菌体，5为IPTG诱导6h后的菌体， 6为IPTG诱导7h后的菌体，7为IPTG诱导8h后的菌体，8为IPTG诱导9h后的菌体，箭头所指为 目标蛋白）。结果表明，重组藏红花酸糖基转移酶主要存在于包涵体，可见重组藏红花酸糖 基转移酶的表达的温度不可为28°C。
[0128] (2)诱导温度37°C对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响
[0129] 按照步骤（1)的方法，将28°C替换为37°C，其它步骤均不变，结果重组藏红花酸糖 基转移酶也主要存在于包涵体，可见重组藏红花酸糖基转移酶的表达的温度不可为37°C。
[0130] (3)诱导温度18°C对重组藏红花酸糖基转移酶的表达的影响
[0131] ①同步骤1中的①。
[0132] ②将R〇setta(DE3)-pET28a-UGTCs4的单克隆接种于5mL含50yg/mL卡那霉素的LB 液体培养基，37 °C、120rpm振荡培养12h，得到培养菌液1。取培养菌液1 0.3mL，以1:100 (体 积比)接种于30mL含50yg/mL卡那霉素 LB液体培养基，18°C、120rpm振荡培养至0D6QQ值0.3~ 0.4,得到培养菌液2。
[0133] ③同步骤1中的③。
[0134] ④完成步骤②后，向培养菌液2中加入IPTG得到诱导体系，IPTG在诱导体系中的浓 度为200μΜ，然后18°C、120rpm振荡培养，培养时间为611、811、1011、1211、1411、1611或1811，离心收 集菌体，获得IPTG诱导后的菌体。
[0135] ⑤同步骤1中的⑤。
[0136] ⑥同步骤1中的⑥。
[0137] 实验结果见图6(M为蛋白marker，1为IPTG诱导前的菌体，2为IPTG诱导6h后的菌 体，3为IPTG诱导8h后的菌体，4为IPTG诱导10h后的菌体，5为IPTG诱导12h后的菌体，6为 IPTG诱导14h后的菌体，7为IPTG诱导16h后的菌体，8为IPTG诱导18h后的菌体，箭头所指为 目标蛋白）。结果表明，18°C、IPTG诱导6h~18h可诱导重组藏红花酸糖基转移酶的表达。
[0138] 三、重组藏红花酸糖基转移酶的表达与纯化
[0139] ①将重组质粒pET28a_UGTCs4导入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌，将该重组 菌命名为 R〇setta(DE3)-pET28a-UGTCs4〇
[0140] ②将R〇setta(DE3)-pET28a-UGTCs4的单克隆接种于5mL含50yg/mL卡那霉素的LB 液体培养基，37 °C、120rpm振荡培养12h，得到培养菌液1。取培养菌液1 0.3mL，以1:100 (体 积比)接种于30mL含50yg/mL卡那霉素 LB液体培养基，18°C、120rpm振荡培养至0D6QQ值0.3~ 0.4,得到培养菌液2。
[0141] ③完成步骤②后，取培养菌液2，5000rpm离心10min，收集菌体，获得IPTG诱导前的 菌体。
[0142] ④完成步骤②后，向培养菌液2中加入IPTG得到诱导体系，IPTG在诱导体系中的浓 度为200μΜ，然后18°C、120rpm振荡培养16h，5000rpm离心10min，收集菌体，获得IPTG诱导后 的菌体。
[0143] ⑤取IPTG诱导后的菌体，用裂解缓冲液洗涤一次。
[0144] ⑥取完成步骤⑤的菌体，以1:10(体积比）加入裂解缓冲液，放入-20°C冻存，得到 冻存菌液。
[0145] ⑦取完成步骤⑥的冻存菌液，迅速解冻后，置冰上在超声破碎仪上超声破碎(超声 波功率100W，循环程序为:破碎6s，停4s，共120个循环），然后4°C、13000rpm离心30min，收集 上清液，命名为IPTG诱导后的菌体破碎上清液。
[0146] 按照⑤至⑦的步骤，将IPTG诱导后的菌体替换为IPTG诱导前的菌体，得到IPTG诱 导前的菌体破碎上清液。
[0147] ⑧先用5~10个柱体积的裂解缓冲液平衡镍柱(流速为lmL/min)，然后上样步骤⑦ 得到的IPTG诱导后的菌体破碎上清液(流速为lmL/min)，再依次用5个柱体积的含20mmo 1 /L 咪唑的洗涤缓冲液、5个柱体积的含80mmol/L咪唑的洗涤缓冲液和5个柱体积的含lOOmmol/ L咪唑的洗涤缓冲液冲洗镍柱，以去除大多数的杂蛋白，最后用5个柱体积的含250mmol/L咪 唑的洗涤缓冲液冲洗镍柱并收集过柱后溶液，即为重组藏红花酸糖基转移酶溶液。
[0148] 将IPTG诱导后的菌体破碎上清液、IPTG诱导前的菌体破碎上清液和步骤⑧中各洗 脱步骤的洗脱收集液进行SDS-PAGE。
[0149] 实验结果见图7(M为蛋白质分子量Marker，1为IPTG诱导前的菌体破碎上清液，2为 IPTG诱导后的菌体破碎上清液，3为含20mmol/L咪唑的洗涤缓冲液进行洗脱的洗脱收集液， 4为含80mmo 1 /L咪唑的洗涤缓冲液进行洗脱的洗脱收集液，5为含1 OOmmo 1 /L咪唑的洗涤缓 冲液进行洗脱的洗脱收集液，6为含250mmol/L咪唑的洗涤缓冲液进行洗脱的洗脱收集液）。 结果表明，重组藏红花酸糖基转移酶溶液显示单一分子量条带，对应分子量为54.8KDa，与 预期分子量一致。
[0150] 步骤⑦得到的IPTG诱导后的菌体破碎上清液中重组藏红花酸糖基转移酶的含量 为0.03ygAiL，步骤⑧得到的重组藏红花酸糖基转移酶溶液中重组藏红花酸糖基转移酶的 含量为2.13yg/yL。步骤⑦得到的IPTG诱导后的菌体破碎上清液中重组藏红花酸糖基转移 酶的含量的计算方法为:检测液相体系的总蛋白含量，然后通过对蛋白电泳中的各个条带 进行灰度扫描计算重组藏红花酸糖基转移酶在总蛋白中所占的比例，计算得到重组藏红花 酸糖基转移酶的含量。步骤⑧得到的重组藏红花酸糖基转移酶溶液中重组藏红花酸糖基转 移酶的含量是根据Bradford方法进行测定的。
[0151] 实施例2、利用HPLC检测不同反应条件下重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶 活性
[0152] -、透析
[0153] 在4°C条件下，将实施例1获得的重组藏红花酸糖基转移酶溶液进行透析除盐，再 置换入pH7.5、5mM Tris-HCl缓冲液中，最后利用分子量为30MW的超滤管进行超滤浓缩蛋 白，获得纯度为98%的重组藏红花酸糖基转移酶的蛋白样品。将该蛋白样品进行N端25个氨 基酸残基的测序，结果表明，该蛋白N端25个氨基酸的序列如序列表中序列4自N端起第1至 25位所示。
[0154] 二、利用HPLC检测不同反应条件下重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性
[0155] 1、不同反应时间对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性的影响
[0156] (1)制备200yL重组藏红花酸糖基转移酶体外酶促反应体系，该体系溶剂为pH7.5、 50mM Tris-HCl缓冲液，溶质为ImM DTT、5mM UDPG(UDP-Glucose)、50yM MgCl2、10yM藏红花 酸和16yg步骤一获得的重组藏红花酸糖基转移酶。
[0157] (2)将步骤（1)制备的体系置于37°C条件下，然后分别反应0min、30min、lh、1.5h、 2h、2.5h、3h或4h。
[0158] (3)完成步骤(2)后，加入400yL色谱级甲醇终止反应，然后13000rpm离心1 Omin，收 集上清并经0.45μπι的有机滤膜过滤，得到重组藏红花酸糖基转移酶的体外酶促反应的待测 样品。
[0159] (4)取步骤(3)得到的重组藏红花酸糖基转移酶的体外酶促反应的待测样品和藏 红花酸标准品溶液（用甲醇溶解藏红花酸至其浓度为1〇μΜ)，进行HPLC-MS的检测。使用配有 C18反相柱(4.6mmX 150mm)的高效液相色谱仪和紫外可见检测器进行HPLC检测。流动相由 甲醇(A)和水(B)组成，流速为lmL/min，使用以下梯度洗脱条件:在0~20min内，流动相中甲 醇的体积百分含量由20%匀速增至50%，水的体积百分含量由80%匀速降至50%，进行线 性梯度洗脱;在20~50min内，流动相中甲醇的体积百分含量由50%匀速增至70%，水的体 积百分含量由50%匀速降至30%，进行线性梯度洗脱;在50~55min内，用由甲醇和水按照 7:3的体积比混合得到的流动相1进行洗脱;在55~60min内，用甲醇进行洗脱;在60~65min 内，流动相中甲醇的体积百分含量由100%匀速降至20%，水的体积百分含量由0%匀速升 至80%，进行线性梯度洗脱;在65~70min内，用由甲醇和水按照2:8的体积比混合得到的流 动相2进行洗脱。检测波长为440nm。同时定量分析藏红花酸标准品溶液（甲醇溶解藏红花酸 至其浓度为1〇μΜ)。质谱检测条件为:质谱扫描范围100-2000(m/z);载气:高纯氮气，载气流 速:40arb，辅助气流速:2arb，反吹气流速：larb，毛细管温度：275°C，毛细管电压：100V，喷 雾电压:3.2V。实验重复三次，每次重复设10个三角瓶。
[0160]重组藏红花酸糖基转移酶的体外酶促反应的待测样品HPLC检测的实验结果见图8 (CK为藏红花酸标准品，横坐标为保留时间），在该色谱条件下，藏红花酸的保留时间为 35min，藏红花素苷5的保留时间为25min。藏红花酸的高分辨质谱实验结果见图12,藏红花 素苷5的高分辨质谱实验结果见图13。结果表明，反应时间对重组藏红花酸糖基转移酶的糖 基转移酶活性影响较为显著，随着反应时间的延长，藏红花酸浓度和藏红花素苷3逐渐减 少，藏红花素苷5逐渐增加。因此，重组藏红花酸糖基转移酶具有顺序糖基化藏红花酸形成 藏红花素苷3和藏红花素苷5的功能，实施例1制备的重组藏红花酸糖基转移酶具有以藏红 花酸为底物的糖基转移酶活性。
[0161 ] 2、不同pH值对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性的影响
[0162] (1)制备200yL重组藏红花酸糖基转移酶体外酶促反应体系，该体系溶剂为pH6.8、 50mM Tris-HCl缓冲液、pH7.5、50mM Tris-HCl缓冲液、pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液或 pH8.8、50mM Tris-HCl缓冲液，溶质为ImM DTT、5mM UDPG(UDP-Glucose)、50yM MgCl2、10yM 藏红花酸和16yg步骤一获得的重组藏红花酸糖基转移酶。
[0163] (2)将步骤(1)制备的体系置于37°C条件下，反应30min。
[0164] (3)同步骤 1 中（3)。
[0165] (4)同步骤 1 中（4)。
[0166] 重组藏红花酸糖基转移酶的体外酶促反应的待测样品HPLC检测的实验结果见图9 (CK为藏红花酸标准品，横坐标为保留时间），在该色谱条件下，藏红花酸的保留时间为 35min。结果表明，不同pH值对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性影响较为显著， pH值为7.5时，重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性最高。
[0167] 3、不同金属离子对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性的影响
[0168] (1)制备200yL重组藏红花酸糖基转移酶体外酶促反应体系，该体系溶剂为pH7.5、 50mM Tris-HCl缓冲液，溶质为ImM DTT、5mM UDPG(UDP-Glucose)、50yM氯化盐、ΙΟμΜ藏红花 酸和16yg步骤一获得的重组藏红花酸糖基转移酶。氯化盐为MgCl 2、CaCl2、MnCl2、CuCl2、 NaCl或ZnCl2。
[0169] (2)将步骤(1)制备的体系置于37°C条件下，反应30min。
[0170] (3)同步骤 1 中（3)。
[0171] (4)同步骤 1 中（4)。
[0172] 重组藏红花酸糖基转移酶的体外酶促反应的待测样品HPLC检测的实验结果见图 10(CK为藏红花酸标准品，横坐标为保留时间）在该色谱条件下，藏红花酸的保留时间为 35min。结果表明，不同金属离子对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性影响较为显 著:Cu2+(以〇!(：1 2形式加入）、Zn2+(以ZnCl2形式加入)或Mn2+(以血(：1 2形式加入)对重组藏红 花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性有明显的抑制作用;Mg2+(以MgCl 2形式加入）、Ca2+(以Ca Cl2形式加入)或Na+(以NaCl形式加入)对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性有明 显的促进作用，可促使重组藏红花酸糖基转移酶顺序糖基化藏红花酸形成藏红花素苷3和 藏红花素苷5。
[0173] 4、不同底物浓度对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性的影响
[0174] (1)制备200yL重组藏红花酸糖基转移酶体外酶促反应体系，该体系溶剂为pH7.5、 50mM Tris-HCl缓冲液，溶质为ImM DTT、5mM UDPG(UDP-Glucose)、50yM MgCh、藏红花酸和 16yg步骤一获得的重组藏红花酸糖基转移酶。藏红花酸在该体系中的浓度为10μΜ、20μΜ、30 μΜ、40μΜ、5 ΟμΜ或 6 ΟμΜ。
[0175] (2)将步骤(1)制备的体系置于37°C条件下，反应30min。
[0176] (3)同步骤 1 中（3)。
[0177] (4)同步骤 1 中（4)。
[0178] 重组藏红花酸糖基转移酶的体外酶促反应的待测样品HPLC检测的实验结果见图 11(CK为藏红花酸标准品，横坐标为保留时间）在该色谱条件下，藏红花酸的保留时间为 35min。结果表明，不同底物浓度对重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性影响较为显 著:底物浓度为1〇μΜ时，重组藏红花酸糖基转移酶的糖基转移酶活性最高;随着底物浓度的 增加，藏红花素苷3不断积累，藏红花素苷5不断减少。
【主权项】
1. 一种制备蛋白质UGTCS4的方法，包括如下步骤：培养工程菌，得到所述蛋白质 UGTCs4;所述工程菌为将重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌;所述重组表达载体为将 所述蛋白质UGTCs4的编码基因插入表达载体得到的重组质粒； 所述蛋白质UGTCs4为如下al)或a2)或a3)或a4): al)氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白质； a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质； a3)氣基酸序列是序列表中序列4所不的蛋白质； a4)将al)或a2)或a3)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的具有藏红花酸糖基转移酶活性的蛋白质。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述蛋白质UGTCs4的编码基因为如下bl)或 b2)或b3)或b4)所示的DNA分子： bl)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子； b2)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子； b3)与bl)或b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1中所 述蛋白质UGTCs4的DNA分子； b4)在严格条件下与bl)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质 UGTCs4 的 DNA 分子。3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述重组表达载体为在表达载体的多克 隆位点插入序列表的序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述宿主菌为大肠杆菌。5. 如权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于:所述"培养工程菌"的过程中，进行 IPTG诱导。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述IPTG诱导的方法如下：当培养体系的 OD6QOnm值为0.3~0.4时，加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μΜ~600μΜ。7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于:所述"培养工程菌"包括如下步骤： (1) 在18°C~20°C条件下进行培养，直至培养体系的OD6(X)nm值为0.3~0.4; (2) 完成步骤（1)后，加入IPTG并使其在培养体系中的浓度为50μΜ~600μΜ，18°C~20 °C 培养6h~18h。8. 权利要求1至7任一所述方法制备得到的蛋白质UGTCs4。9. 权利要求8所述的蛋白质UGTCs4的应用，为如下cl)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6): cl)作为藏红花酸糖基转移酶的应用； c2)在制备具有藏红花酸糖基转移酶功能的产品中的应用。 c3)在催化藏红花酸发生糖基化中的应用； c4)在制备用于催化藏红花酸发生糖基化的产品中的应用。 c5)在生产藏红花素苷5和/或藏红花素苷3中的应用； c6)在制备用于生产藏红花素苷5和/或藏红花素苷3的产品中的应用。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于:所述生产藏红花素苷5和/或藏红花素苷3是 以藏红花酸作为底物的。
【文档编号】C12N15/54GK105950580SQ201610355947
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】赖成霞, 王玮, 石必显, 李春平, 刘忠山, 李金枫
【申请人】新疆农业科学院经济作物研究所