一种采用60Co-γ射线诱变的酸性蛋白酶高产菌株选育方法
【专利摘要】本发明公开了一种采用60Co?γ射线诱变的酸性蛋白酶高产菌株选育方法，包括以下步骤：a）孢子悬浮液制备：取恒温培养箱内的平板孢子，震荡后用无菌蒸馏水稀释，即得孢子悬浮液并备用；b）60Co?γ射线诱变：将孢子悬浮液置于0.5～2.0 KGy的辐照台面上，处理5?10min后取出做分离培养，吸取60Co?γ射线照射后的样品稀释，计算菌落数；c）菌株筛选：以得到的菌株为基础，挑选其中HC值大于平均值的变异菌株作为初筛菌株，以备复筛；c2)取步骤c1)得到的菌株，加入1 mL 2%的硫代硫酸钠作为解毒剂，选育出酸性蛋白酶酶活力提高值最大的为高产菌株。
【专利说明】
一种采用60C〇- γ射线诱变的酸性蛋白酶高产菌株选育方法
技术领域
[0001] 本发明属于菌株选育的技术领域，尤其是涉及一种采用eoco-γ射线诱变的酸性 蛋白酶高产菌株选育方法。
【背景技术】
[0002] 从自然界筛选得到的野生菌，一般其酸性蛋白酶产量都比较低，并不能直接用于 工业化的发酵生产，所以必须对野生菌进行选育以提高其酸性蛋白酶产量是工业化生产很 关键的一环节。工业上生产酸性蛋白酶的高产菌株大多数都是通过诱变后改变基因组列而 筛选得到的突变株。实验室采用常规诱变方法，以产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株为出发菌获 得耐高温酸性蛋白酶生产菌株。或者采用黑曲霉为出发菌株，经原生质体紫外诱变，得到了 产酸性蛋白酶优良菌株。采用单因素和正交实验，对其液态发酵的培养基成分进行了优化， 得到最佳培养基组成。
[0003] 工业级酸性蛋白酶制剂的生产市通过微生物菌种经液体通风发酵，成熟发酵醪， 再经硫酸铵盐析，板框压滤，气流(沸腾)干燥，粉碎，化验，包装等工序，便制成工业级粉剂 酸性蛋白酶。最初生产的微生物酸性蛋白酶只有工业级的，主要用于皮毛软化。食品级酸性 蛋白酶制剂的生产是成熟发酵醪进入絮凝罐，加入絮凝剂絮凝沉淀，再用板框压滤机压滤， 滤饼经干燥后可作饲料酶添加剂，滤清液用超滤膜浓缩，经化验合格，加入防腐剂、稳定剂 便成为成品浓缩酸性蛋白酶制剂。
[0004] 诱变育种的主要步骤分为出发菌株的诱变处理和突变株的筛选两大部分。出发菌 株的诱变处理包括出发菌株的选择、诱变剂的选择和诱变剂量的确定。在出发菌株的选择 上尽量选择经多次自发或诱变突变且每次诱变都有较好效果的菌株作为出发菌株，诱变剂 的选择原则是使用方便并行之有效，并选择既能扩大变异幅度，又能促进正突变的剂量。突 变体的筛选主要通过科学的初筛和复筛方法来选择正突变株。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对上述问题，提供一种采用6〇c〇-y射线诱变的酸性蛋白酶高 产菌株选育方法。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案： 一种采用6〇c〇-y射线诱变的酸性蛋白酶高产菌株选育方法，包括以下步骤： a) 孢子悬浮液制备:取恒温培养箱内40°C下培养5 d的平板孢子，用无菌蒸馏水洗脱平 板孢子，置于无菌并盛有玻璃珠的三角瓶中，在250~300 r/min的震荡装置上震荡2~5 h， 使孢子活化和分散，孢子分散率在90%以上，在光学显微镜下观察孢子并计数，然后用无菌 蒸馏水稀释孢子悬浮液至115个/mL，即得孢子悬浮液并备用； b) 60C〇-y射线诱变:洗脱麦芽汁琼脂平板培养基上的孢子，制备稀释成孢子浓度为 个/mL的孢子悬浮液，分装2 mL注入无菌试管，置于0.5~2.0 KGy的福照台面上，处理 5-10min后取出做分离培养，吸取60C〇-y射线照射后的样品稀释、涂布于0.4%的干酪素培 养基上，放置于30°C~50°C培养箱内倒置培养36~72 h，计算每皿菌落数； c)菌株筛选： cl)以步骤b中得到的菌株为基础，挑选其中HC值大于平均值的变异菌株作为初筛菌 株，以备复筛;HC值=透明圈直径/菌落直径； c2)取步骤cl)得到的菌株，加入1 mL 2 %的硫代硫酸钠作为解毒剂，培养基中30°C 培养2d，然后利用福林酚法检测中性蛋白酶酶活力，选育出酸性蛋白酶酶活力提高值最大 的为高产菌株。
[0007] 作为优选，所述的步骤a)中的培养箱为恒温电热培养箱，震荡装置为恒温培养摇 床，震荡速度为300r/min，震荡时间为6h。
[0008] 作为优选，所述的步骤b)中的干酪素培养基为分离培养基，在PDA培养基为内加入 〇.4%干酪素，放置于30°C培养箱内倒置培养72 h。
[0009] 作为优选，所述步骤b)中的选取菌体致死率大约在60 %~95 %之间的诱变剂量来 观察其正突变率，且选择正突变率在致死率为70%~80%时最大的剂量。
[0010] 与现有的技术相比，本发明的优点在于:60C〇-Y射线是一种广泛应用于诱变剂， 能显著影响组织或者细胞的生长发育，高剂量的eoco-γ射线可以使细胞染色体断裂和DNA 伤害，蛋白质和酶活性的丧失，碳水化合物和光合色素合成的下降，但伤害程度和60C〇-y 射线的辐射剂量呈呈正相关，相对低的剂量用于菌株的诱变育种是一种新的育种手段。
【附图说明】
[0011]以下结合附图和本发明的实施方式来作进一步详细说明 图1是本发明提供的60CO- γ射线诱变致死率曲线； 图2是本发明提供的60C〇- γ射线照射剂量对突变率的影响。
【具体实施方式】
[0012]本实施例中采用60CO- γ射线诱变的酸性蛋白酶高产菌株选育方法，包括以下步 骤： a) 孢子悬浮液制备:取恒温培养箱内40°C下培养5 d的平板孢子，用无菌蒸馏水洗脱平 板孢子，置于无菌并盛有玻璃珠的三角瓶中，在250~300 r/min的震荡装置上震荡2~5 h， 使孢子活化和分散，要求孢子分散率在90%以上，在光学显微镜下观察孢子并计数，然后用 无菌蒸馏水稀释孢子悬浮液至115个/mL，即得孢子悬浮液并备用； b) 60C〇-y射线诱变:洗脱麦芽汁琼脂平板培养基上的孢子，制备稀释成孢子浓度为 10$个/mL的孢子悬浮液，分装2 mL注入无菌试管，根据剂量要求，置盛有菌体悬液的试管 于一定剂量(〇.5、1.0、1.5和2.0 KGy)的辐照台面上，处理5-10min后取出马上做分离培养， 吸取60C〇- γ射线照射后的样品稀释、涂布于0.4%的TOA培养基上，放置于30°C~50°C培养 箱内倒置培养36~72 h，计算每皿菌落数，绘制致死曲线;PDA培养基为分离培养基，其中加 入0.4%干酪素； c) 菌株筛选： cl)首先进行平板初筛:取菌悬液10 mL置于9 mL的培养皿中，置于磁力搅拌器 上，然后取0.2 mL直接涂布在干酪素筛选培养基上初筛，35°C避光恒温培养2~4 d，挑选 出HC值大且生长较快的菌株，接入分离培养基斜面保存备用。（HC值=透明圈直径/菌落 直径）； c2)然后进行摇瓶复筛:取5 mL孢子洗脱液与一定浓度诱变剂混匀，处理一定时间， 加入1 mL 2 %的硫代硫酸钠作为解毒剂，培养基中30°C培养2d，然后利用福林酚法检测 中性蛋白酶酶活力，选育出酸性蛋白酶酶活力明显提高的菌株； 本实施例所述的步骤a)中培养箱为DHP-9272型恒温电热培养箱，震荡装置为ZHWY-1112B恒温培养摇床，震荡速度为300r/min，震荡时间为6h。
[0013] 如图1所示，X轴为60C〇-y照射剂量(KGy)，Y轴为菌体致死率(％)，实验结果表明， 随着60C〇- γ照射剂量的增加，菌体致死率逐渐升高，在辐射剂量为0.5 KGy时致死率达到 了78.5%，1.0 KGy剂量照射时，致死率达到87.6%，按照诱变剂量选择的一般原则，选取菌体 致死率大约在60 %~95 %之间的诱变剂量来观察其正突变率，且正突变率在致死率为70% ~80%时最大，故60C〇-γ照射选取0.5 KGy的剂量为适宜剂量;如图2所示，X轴为60C〇-γ照 射剂量(KGy)，Y轴为菌体突变率(％)，曲线Α为正突变率，曲线Β为负突变率;菌体在60C〇-y 不同剂量照射下，正负突变率均先逐渐升高，然后缓慢降低，正突变率在0.5 KGy下为最大 47%，且在此剂量下正负突变率差值也达到了最大，这也同样证明0.5 KGy为最适合的诱变 剂量。
【主权项】
1. 一种采用60CO- γ射线诱变的酸性蛋白酶高产菌株选育方法，其特征在于:包括以下 步骤： a) 孢子悬浮液制备:取恒温培养箱内40°C下培养5 d的平板孢子，用无菌蒸馏水洗脱平 板孢子，置于无菌并盛有玻璃珠的三角瓶中，在250~300 r/min的震荡装置上震荡2~5 h， 使孢子活化和分散，孢子分散率在90%以上，在光学显微镜下观察孢子并计数，然后用无菌 蒸馏水稀释孢子悬浮液至115个/mL，即得孢子悬浮液并备用； b) 60C〇-y射线诱变:洗脱麦芽汁琼脂平板培养基上的孢子，制备稀释成孢子浓度为 个/mL的孢子悬浮液，分装2 mL注入无菌试管，置于0.5~2.0 KGy的辐照台面上，处理 5-10min后取出做分离培养，吸取60C〇-y射线照射后的样品稀释、涂布于0.4%的干酪素培 养基上，放置于30°C~50°C培养箱内倒置培养36~72 h，计算每皿菌落数； c) 菌株筛选： cl)以步骤b中得到的菌株为基础，挑选其中HC值大于平均值的变异菌株作为初筛菌 株，以备复筛;HC值=透明圈直径/菌落直径； c2)取步骤cl)得到的菌株，加入1 mL 2 %的硫代硫酸钠作为解毒剂，培养基中30°C 培养2d，然后利用福林酚法检测中性蛋白酶酶活力，选育出酸性蛋白酶酶活力提高值最大 的为高产菌株。2. 如权利要求1所述的一种采用60C〇-y射线诱变的酸性蛋白酶高产菌株选育方法，其 特征在于:所述的步骤a)中的培养箱为恒温电热培养箱，震荡装置为恒温培养摇床，震荡速 度为300r/min，震荡时间为6h。3. -种采用60C〇- γ射线诱变的酸性蛋白酶高产菌株选育方法，其特征在于:所述的步 骤b)中的干酪素培养基为分离培养基，在FOA培养基为内加入0.4%干酪素，放置于30 °C培养 箱内倒置培养72 h。4. 一种采用60C〇- γ射线诱变的酸性蛋白酶高产菌株选育方法，其特征在于:所述步骤 b)中的选取菌体致死率大约在60 %~95 %之间的诱变剂量来观察其正突变率，且选择正突 变率在致死率为70%~80%时最大的剂量。
【文档编号】C12N1/02GK105950607SQ201610351279
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】何荣军, 王茜, 孙培龙
【申请人】浙江工业大学