半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组装双链dna的方法

文档序号:10589101阅读:597来源:国知局
半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组装双链dna的方法
【专利摘要】本发明涉及一种半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组装双链DNA的方法,包括以下步骤:将预合成的双链DNA分成多个DNA片段;用DNA片段设计核苷酸;以核苷酸作为引物,在引物的两端分别加上序列,合成核苷酸序列;用含有生物素标记的引物进行第一轮扩增,获得第一轮PCR产物;用至少一种重组酶重组第一轮PCR产物,得到PCR混合物;纯化PCR混合物;纯化后的PCR混合物进行第二轮PCR,将核苷酸片段进行拼接,获得拼接后的PCR产物;用设计的首尾引物,对PCR产物进行第三轮PCR扩增,获得双链DNA片段。采用本方法进行的核苷酸池合成以及双链DNA合成与组装,成本低,一次合成的通量高。
【专利说明】
半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组装双链DNA的方法
技术领域
[0001]本发明属于分子生物领域,尤其是DNA合成技术领域,具体涉及一种半导体芯片高 通量合成核苷酸池及其组装双链DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 合成生物学是二十一世纪新兴的一门交叉学科,合成生物学运用工程学的研究思 路去设计、改造基因,生物元件,生物途径,甚至是整个基因组,在生物,医药,环保,能源和 农业等领域有着广泛的应用前景。主要包括:双链DNA的合成,调控元件的合成,操纵子合 成,基因合成等;其中基因合成是合成生物学的主要组成部分,是合成生物学的基础和骨 架。基因合成是指在体外人工合成双链DNA分子的技术,与寡核苷酸合成单链DNA不同,基因 合成合成的是双链DNA分子。基因合成是获取目的基因的手段之一,相对于从已有生物中获 取基因来说,基因合成无需模板,不受基因来源限制,可以合成自然界中极难获得或者不存 在的基因。
[0003] 基因合成具有以下优点:基因合成所需的合成周期短,合成序列100%正确;具有 更大的灵活性,可以对基因的酶切位点和基因序列进行修改,方便后续实验;通过基因合成 合成的基因可以进行密码子优化,使其在各种生物表达体系中都能得到良好表达。基因合 成已经广泛应用于克隆人鼠抗体或重组抗体,合成不同的基因突变株、SNP、或其它突变株, 合成DNA疫苗以及大量合成用于微芯片的cDNA等。
[0004] 早期的基因合成通过连接酶介导法和FokI法等,将寡核苷酸组装成具有功能的基 因。然而,早期的合成技术通常只能合成小于lkb的DNA片段。20世纪90年代,通过连接酶链 式反应法和PCR法的结合使用,科学家们合成了2.1kb的恶性疟原虫基因 pfsub-Ι。进入21世 纪以后,以PCR为基础的基因合成方法得到了进一步的演变与发展,先后诞生了连接酶拼接 法与重叠延伸PCR法和以PCR为基础的两步DNA合成方法,BioBrick?法,BglBrick法等技术 来合成较长的基因,基因合成技术和组装手段得到了长足的发展。然而这些方法要么仍然 无法有效解决大片段,元件库,基因组的合成等,要么无法实现无痕组装(BioBrick?和 BglBrick),而且受酶切位点序列限制。
[0005] Gibson等温组装法(Gibson isothermal assembly)是目前使用的最为广泛的基 因合成方法,这种方法在恒温条件下使用一步组装技术来组装基因,即利用5'核酸外切酶, DNA聚合酶及连接酶的特性在体外将具有重叠区的多个DNA片段组装起来,达到基因合成的 目的。该方法既可以组装较小的基因,也可以组装较大的基因片段,因此应用广泛,但是该 方法在合成高GC含量,高度重复的正向或者反向重复序列时,具有明显的局限性。更重要的 是在组装大片段,生物途径合成,或者组装基因组时,因为对引物的需求量巨大,传统的引 物合成方法因为无法一次性高通量合成组装大片段,元件库,生物途径或者基因组所需要 的大量引物,耗时耗力,而且传统的化学合成方法合成引物成本高昂。
[0006] 进入21世纪以来,随着生命科学的发展和下一代测序技术的进步,包括人类,水稻 等越来越多的物种的基因组已经测序完成,利用已经得到的基因组序列研究具有重要意义 的生物途径,生物元件库等,成为一项重要的研究课题。研究者对基因合成的需求也因此越 来越大,传统的基因合成和组装方法面临越来越大的困难和挑战,难以满足市场和科研对 基因合成的需求。为了提高基因合成通量并降低成本,有必要开发下一代的DNA合成和组装 技术。
[0007] 生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一,是融微电子 学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术,目前已经商业化的有各 种动物的表达谱芯片,捕获芯片,miRNA芯片等。生物芯片具有高通量,微型化和自动化等特 点,生物芯片的出现为大规模高通量低成本的新一代DNA合成和组装提供了可能。
[0008] 现在需要一种方法将半导体芯片合成技术和DNA大片段组装技术融合在一起,利 用电化学半导体芯片和DNA大片段组装技术成功开发了下一代DNA合成平台。此平台应该具 有如下特点:1.合成成本低,通过芯片技术合成的基因比传统的以PCR为基础的基因合成成 本低90%以上;2.高通量,DNA芯片技术具有高通量的特点,可以一次性同时合成上百万条 引物,每条引物长度可达200nt,用于后续的实验。

【发明内容】

[0009] 为解决上述技术问题,本发明提供了一种半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组 装双链DNA的方法,该方法利用半导体芯片技术,使用带有生物素标记的flank序列进行第 一轮扩增,使半导体芯片所合成的核苷酸大量增加,然后进行第二轮PCR拼接引物,再使用 设计的首尾引物进行第三轮PCR扩增,达到双链DNA合成的目的;采用本方法进行的核苷酸 池合成以及双链DNA合成与组装,成本低,一次合成的通量高,可以应用于代谢通路,生物途 径,生物元件库或者基因组的组装。
[0010] 为达到上述目的,本发明的技术方案如下:
[0011] -种半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组装双链DNA的方法,以半导体芯片合 成核苷酸池,用合成的核苷酸池组装成双链DNA,包括以下步骤:
[0012] (1)将预合成的双链DNA分成多个DNA片段;
[0013] ⑵用⑴中获得的DNA片段设计核苷酸;
[0014] (3)以(2)中的核苷酸作为引物,在引物的两端分别加上序列,合成核苷酸序列;
[0015] (4)用含有生物素标记的引物进行第一轮扩增,获得第一轮PCR产物;
[0016] (5)用至少一种重组酶重组(4)中获得的第一轮PCR产物,得到PCR混合物;
[0017] (6)纯化(5)中的PCR混合物;
[0018] (7)用(6)中纯化后的PCR混合物进行第二轮PCR,将核苷酸片段进行拼接,获得拼 接后的PCR产物;
[0019] (8)用设计的首尾引物,对(7)中的PCR产物进行第三轮PCR扩增,获得双链DNA片 段。
[0020] 本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,包括以下步骤:
[0021] (1)将预合成的双链0嫩分段成多个0嫩片段,0嫩片段的长度为200-100(^?;
[0022] (2)用(1)中获得的DNA片段设计核苷酸,每条核苷酸的长度为30-90nt;
[0023] (3)以(2)中的核苷酸为引物,在引物的两端分别加上20nt的flank序列和酶切序 列,合成总长度为80-200nt的核苷酸序列;
[0024] (4)用含有生物素标记的引物进行第一轮扩增,获得第一轮PCR产物;
[0025] (5)用II型限制性内切酶酶切(4)中获得的第一轮PCR产物,获得PCR混合物;
[0026] (6)用磁珠纯化(5)中酶切后的PCR混合物;
[0027] (7)用(6)中纯化后的PCR混合物进行第二轮PCR,将核苷酸片段进行拼接,获得拼 接后的PCR产物;
[0028] (8)用设计的首尾引物进行第三轮PCR扩增,获得双链DNA片段。
[0029]本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,(1)中所述的DNA片段的序列为:
[0031] 本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,(3)中所述的酶切序列为Type II或者 Type IIs限制性内切酶,所述Type II限制性内切酶包括:EcoRI、BamhI、HindIII,所述Type IIs限制性内切酶包括:?〇1^1^1¥1、88 &1、8&81、88111131,所述酶切序列应用在半导体芯片高 通量合成核苷酸池中。
[0032] 本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,(4)中所述的含有生物素标记的引物 为:
[0033] ATATAGATGCCGTCCTAGCG和AAGTATCTTTCCTGTGCCCA。
[0034]本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,(5)中所述II型限制性内切酶为Type Π 或者Type IIs限制性内切酶,Type II限制性内切酶包括:EcoRI、BamhI、HindIII,所述 Type IIs限制性内切酶包括:?〇1^1^1¥1、88&1、8匕81、88111131,所述11型限制性内切酶应用在 以半导体芯片高通量合成核苷酸池为原料组装双链DNA。
[0035] 本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,(8)中所述的首引物为:
[0036] GGATCCAGAGCAGAGGAGCCAGCTGTGGGCACCAGTGGCCTCATCTTCCGAGAA;
[0037] 所述尾引物为:CTCGAGTGGGGGGCCAG。
[0038]本发明的有益效果是:
[0039] 其一、通过本发明方法进行的核苷酸池合成以及双链DNA合成与组装,成本低,一 次合成的通量高,可以应用于代谢通路,生物途径,生物元件库或者基因组的组装。
[0040] 其二、本发明的方法相对于现在技术,通过该方法每次可以合成上百万条核苷酸, 达到了高通量的要求,并且单个碱基的价格可以低到〇.〇1元/nt,成本较低。
【附图说明】
[0041] 为了更清楚地说明本发明实施例技术中的技术方案,下面将对实施例技术描述中 所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实 施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图 获得其他的附图。
[0042]图1本发明的方法的流程图。
【具体实施方式】
[0043]下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例,都属于本发明保护的范围。
[0044] 实施例1
[0045] 如图1所示,本实施例中公开了一种半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组装双 链DNA的方法,以半导体芯片高通量合成核苷酸池,用合成的核苷酸池组装成双链DNA,具体 包括以下步骤:
[0046] (1)将预合成的双链DNA分段成多个DNA片段,DNA片段的长度为200-1000bp。
[0047] (2)用(1)中获得的DNA片段设计核苷酸,每条核苷酸的长度为30-90nt。
[0048] (3)以(2)中设计核苷酸为引物,在引物的两端分别加上20nt的flank序列和酶切 序列,合成总长度为80_200nt的核苷酸序列;其中,上述的酶切序列为Type II或者Type IIs限制性内切酶,Type II限制性内切酶包括:EcoRI、BamhI、HindIII,Type IIs限制性内 切酶包括小〇1^、厶1¥1、88&1、8匕81、88111131,7?6 11限制性内切酶和了7?6 118限制性内切酶应 用在半导体芯片高通量合成核苷酸池中。
[0049] (4)用含有生物素标记的引物进行第一轮扩增,获得第一轮PCR产物。
[0050] (5)用II型限制性内切酶酶切(4)中获得的第一轮PCR产物,获得PCR混合物。
[0051 ] 上述的II型限制性内切酶为Type II限制性内切酶或者Type IIs限制性内切酶, Type II限制性内切酶包括:EcoRI、BamhI、HindIII,Type IIs限制性内切酶包括:FokI、 AlwI、BsaI、BbsI、BsmbI,Type II限制性内切酶和Type IIs限制性内切酶应用在以半导体 芯片高通量合成核苷酸池为原料组装双链DNA。
[0052 ] (6)用磁珠纯化(5)中酶切后的PCR混合物。
[0053] (7)用(6)中纯化后的PCR混合物进行第二轮PCR,将核苷酸片段进行拼接,获得拼 接后的PCR产物。
[0054] (8)用设计的首尾引物进行第三轮PCR扩增,获得双链DNA片段。
[0055] 实施例2
[0056]在实施例2中以实施例1中的方法来组装双链DNA,即通过半导体芯片高通量合成 核苷酸池后,然后再进行双链DNA组装。
[0057] 具体的:
[0058] (1)预合成的双链DNA的序列(414bp):
[0060] (2)以(1)中的DNA序列设计的引物如表1中所示。
[0061] 表1引物表
[0064] (3)在上述设计的引物两端分别加上20nt的flank序列和酶切识别位点序列,本实 例以Type IIs限制性内切酶Bsal为例,酶切的正向识别序列为GGTCTCA,酶切的反向识别序 列为 AGAGACC;其中,5 ' 端的f lank 序列20nt,序列为:TGGTGATAGGTAAGGATGGC,3 ' 端的f lank 序列 20nt,序列为:CGGCTCAGTATTGCGATTAC。
[0065]在本实施例中,合成了总长度71_115nt的核苷酸序列,合成的核苷酸序列如下:
[0087] (4)将步骤(3)所设计的核苷酸序列通过半导体芯片来制备。
[0088] (5)用含有生物素标记的引物 ATATAGATGCCGTCCTAGCG 和 AAGTATCTTTCCTGTGCCCA 扩 增半导体芯片制备的核苷酸池,进行第一轮PCR扩增,获得第一轮PCR产物。
[0089] 第一轮PCR扩增的反应体系如表2中所示,第一轮PCR扩增的反应条件如表3中所 不。
[0090] 表2第一轮PCR扩增的反应体系表
[0092]表3第一轮PCR扩增的反应条件表
[0095] (6)用Bsa頂每切步骤(5)所获得的第一轮PCR产物,获得PCR混合物。
[0096] (7)用磁珠纯化酶切后的第一轮PCR混合物。
[0097] (8)用纯化后的PCR混合物进行第二轮PCR,将各段核苷酸拼接起来;进行第二轮 PCR扩增的反应体系如表4中所示,进行第二轮PCR扩增的反应条件如表5中所示。
[0098]表4第二轮PCR扩增的反应体系表
[0100]表5第二轮PCR扩增的反应条件表
[0102] (9)用设计的首引物:GGATCCAGAGCAGAGGAGCCAGCTGTGGGCACCAGTGGCCTCATCTTCCGA GAA和尾引物CTCGAGTGGGGGGCCAG进行第三轮PCR扩增,获得目的双链DNA。
[0103]在本实施例中,进行第三轮PCR扩增的反应体系如表6中所示,进行第三轮PCR扩增 的反应条件如表7中所示。
[0104]表6第三轮PCR扩增的反应体系表

[0106]表7第三轮PCR扩增的反应条件表
[0108] 如无特别说明,本发明中的所有技术和科学术语均按本发明所涉及的行业普通技 术人员普遍理解的正常含义。
[0109] 文中的"序列"代表着聚合物中单体的排列顺序,比如核苷酸在多核甘酸序列中的 排列顺序,此处所说的"核苷酸序列""核酸"或者"多核苷酸"指的是单链或者双链中的脱氧 核糖核苷酸,核苷酸序列是由自然的核苷酸A,T,C,G,U或者其他合成的自然碱基的类似物 组成,本发明中,腺嘌呤缩写为A,鸟嘌呤缩写为G,胞嘧啶缩写为C,胸腺嘧啶缩写为T,尿嘧 啶缩写为U。多核酸序列可以是单链或者双链,若无特别说明,核苷酸也包括了较长的核苷 酸或较短的核苷酸,比如寡核苷酸。
[0110] 文中采用传统的标记方法来描述多核苷酸序列,单链和左端为5'端,双链的左端 为正链5'端。
[0111] 本发明的方法利用半导体芯片技术,使用带有生物素标记的flank序列进行第一 轮扩增,使半导体芯片所合成的核苷酸大量增加,然后进行第二轮PCR拼接引物,再使用设 计的首尾引物进行第三轮PCR扩增,达到双链DNA合成的目的;采用本方法进行的核苷酸池 合成以及双链DNA合成与组装,成本低,一次合成的通量高,可以应用于代谢通路,生物途 径,生物元件库或者基因组的组装。
[0112] 对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。 对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的 一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明 将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一 致的最宽的范围。
【主权项】
1. 一种半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组装双链DNA的方法,以半导体芯片合成 核苷酸池,用合成的核苷酸池组装成双链DNA,其特征在于,包括以下步骤: (1) 将预合成的双链DNA分成多个DNA片段; (2) 用(1)中获得的DNA片段设计核苷酸; (3) 以(2)中的核苷酸作为引物,在引物的两端分别加上序列,合成核苷酸序列; (4) 用含有生物素标记的引物进行第一轮扩增,获得第一轮PCR产物; (5) 用至少一种重组酶重组(4)中获得的第一轮PCR产物,得到PCR混合物; (6) 纯化(5)中的PCR混合物; (7) 用(6)中纯化后的PCR混合物进行第二轮PCR,将核苷酸片段进行拼接,获得拼接后 的PCR产物; (8) 用设计的首尾引物,对(7)中的PCR产物进行第三轮PCR扩增,获得双链DNA片段。2. 根据权利要求1所述的半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组装双链DNA的方法,其 特征在于,包括以下步骤: (1) 将预合成的双链DNA分段成多个DNA片段,DNA片段的长度为200-1000bp; (2) 用(1)中获得的DNA片段设计核苷酸,每条核苷酸的长度为30-90nt; (3) 以(2)中的核苷酸为引物,在引物的两端分别加上20nt的flank序列和酶切序列,合 成总长度为80-200nt的核苷酸序列; (4) 用含有生物素标记的引物进行第一轮扩增,获得第一轮PCR产物; (5) 用II型限制性内切酶酶切(4)中获得的第一轮PCR产物,获得PCR混合物; (6) 用磁珠纯化(5)中酶切后的PCR混合物; (7) 用(6)中纯化后的PCR混合物进行第二轮PCR,将核苷酸片段进行拼接,获得拼接后 的PCR产物; (8) 用设计的首尾引物进行第三轮PCR扩增,获得双链DNA片段。3. 根据权利要求2所述的半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组装双链DNA的方法,其 特征在于,(1)中所述的DNA片段的序列为: GGATCCAGAGCAGAGGAGCCAGCTGTGGGCACCAGTGGCCTCATCTTCCGAGAAGACTTGGACTGGCCTCCAG GCAGCCCACAAGAGCCTCTGTGCCTGGTGGCACTGGGCGGGGACAGCAATGGCAGCAGCTCCCCCCTGCGGGTGGTG GGGGCTCTAAGCGCCTATGAGCAGGCCTTCCTGGGGGCCGTGCAGAGGGCCCGCTGGGGCCCCCGAGACCTGGCCAC CTTCGGGGTCTGCAACACCGGTGACAGGCAGGCTGCCTTGCCCTCTCTACGGCGGCTGGGGGCCTGGCTGCGGGACC CTGGGGGGCAGCGCCTGGTGGTCCTACACCTGGAGGAAGTGACCTGGGAGCCAACACCCTCGCTGAGGTTCCAGGAG CCCCCGCCTGGAGGAGCTGGCCCCCCACTCGAGo4. 根据权利要求2所述的半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组装双链DNA的方法,其 特征在于,(3)中所述的酶切序列为Type II或者Type IIs限制性内切酶,所述Type II限制 性内切酶包括:EcoRI、BamhI、HindIII,所述Type IIs限制性内切酶包括:FokI、AlwI、BsaI、 BbsI、BsmbI,所述酶切序列应用在半导体芯片高通量合成核苷酸池中。5. 根据权利要求4所述的半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组装双链DNA的方法,其 特征在于,(4)中所述的含有生物素标记的引物为:ATATAGATGCCGTCCTAGCG和 AAGTATCTTTCCTGTGCCCA。6. 根据权利要求2所述的半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组装双链DNA的方法,其 特征在于,(5)中所述II型限制性内切酶为Type II或者Type IIs限制性内切酶,Type II限 制性内切酶包括:EcoRI、BamhI、HindIII,所述Type IIs限制性内切酶包括:FokI、AlwI、 BsaI、BbsI、BsmbI,所述II型限制性内切酶应用在以半导体芯片高通量合成核苷酸池为原 料组装双链DNA。7.根据权利要求2所述的半导体芯片高通量合成核苷酸池及其组装双链DNA的方法,其 特征在于, (8)中首引物为: GGATCCAGAGCAGAGGAGCCAGCTGTGGGCACCAGTGGCCTCATCTTCCGAGAA; 尾引物为:CTCGAGTGGGGGGCCAG 〇
【文档编号】C12N15/10GK105950609SQ201610272253
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】齐金才, 钟云鹏, 刁文, 刁文一, 柳伟强, 陈文柱, 杨平
【申请人】苏州泓迅生物科技有限公司
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