酿酒酵母内乙酰辅酶a综合利用的双调控策略的制作方法

文档序号:10589136阅读:1248来源:国知局
酿酒酵母内乙酰辅酶a综合利用的双调控策略的制作方法
【专利摘要】酿酒酵母内乙酰辅酶A综合利用的双调控策略。本发明提供线粒体内乙酰辅酶A代谢调控方法,并建立了细胞质和线粒体双调控的策略。本发明成功将以上策略用于类异戊二烯中的关键合成单体异戊二烯的生物合成中。
【专利说明】
酿酒酵母内乙酰辅酶A综合利用的双调控策略
技术领域
[0001] 本发明属于代谢工程领域,具体涉及一种酿酒酵母内乙酰辅酶A综合利用的双调 控策略。
【背景技术】
[0002] 酿酒酵母是第一个进行全基因组测序的真核微生物,由于其遗传操作简便、基因 其遗传操作简便、基因表达调控机理清楚且高密度发酵技术成熟,被视为理想的细胞工厂, 广泛应用于生物基产品生产和技术研究。
[0003] 乙酰辅酶A的是酿酒酵母中的关键代谢产物,可作为前体物进行类异戊二烯、聚酮 化合物、脂类、聚羟基脂肪酸酯、丁醇等重要天然代谢产物的生物合成。在酿酒酵母中,乙酰 辅酶A主要分布于细胞质和线粒体中。由于MVA和脂肪酸等途径存在于细胞质中,为方便操 作,目前研究主要集中于细胞质中的调控。当前酿酒酵母中提高类异戊二烯产量的最常用 策略主要集中于MVA途径的代谢工程调控:1)提高前体物IPP和DMAPP的供应量,如过表达 MVA途径中的限速酶tHMGl;2)过表达固醇生物合成的全局转录因子upc2-l;3)抑制竞争性 代谢支路,例如,在类胡萝卜素合成途径中,通过添加麦角固醇生物合成抑制剂或将角鲨烯 合成酶基因的启动子换成甲硫氨酸启动子,对竞争路径进行下调。
[0004] 由于肉毒碱穿梭系统和合成机制的缺乏,故很难实现亚细胞结构间的乙酰辅酶A 转运和转化,这就造成了相当线粒体内乙酰辅酶A的浪费。线粒体作为独立的亚细胞结构, 在其中进行代谢调控具有很大的优势:1)线粒体中有TCA、氨基酸、脂肪酸等中心代谢途径, 且其环境中pH较高,氧气浓度较低,有更多的氧化还原力,其环境对辅酶铁硫簇较为有利; 2)线粒体体积较小,能增加底物浓度,提高反应速率和产量;3)可以消除反馈调节及代谢流 到竞争途径的转化。因此如何利用线粒体内的乙酰辅酶A并对细胞质和线粒体两个亚细胞 结构进行协同调控对于酿酒酵母中类异戊二烯、脂类等代谢产物的生物合成具有重要意 义。

【发明内容】

[0005] 本发明为了克服现有技术的至少一个不足,提供一种提高酿酒酵母内乙酰辅酶A 的综合利用的调控策略,实现提高酿酒酵母内乙酰辅酶A的综合利用能力的发明目的。
[0006] 为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
[0007] 本发明提供一种酿酒酵母内线粒体内乙酰辅酶A利用的调控策略,将MVA途径的7 个基因定位到线粒体中实现线粒体内乙酰辅酶A的利用。
[0008] 作为本发明的一种实施方式,基因在线粒体内的定位方法为,在基因的前端引入 氨基酸序列SEQ ID N0:1,其中SEQ ID NO: 1的前25个氨基酸为细胞色素 c氧化酶IV亚基的 前导肽序列,第25和26位氨基酸为蛋白酶识别位点LQ。在前导肽的作用下,基因可以定位到 线粒体中,之后在螯合剂感应的蛋白酶作用下,蛋白序列LQ之间的肽键会发生断裂,生成成 熟蛋白多肽。
[0009] 编码氨基酸序列SEQ ID NO: 1的碱基序列为SEQ ID NO:2。
[0010] 本发明还提供了一种酿酒酵母内细胞质和线粒体内乙酰辅酶A利用的双调控策 略,将通过以上方法构建的线粒体代谢工程菌株和细胞质工程菌进行杂交,构建双倍体菌 株,该菌株可以实现细胞质跟线粒体调控策略的结合,提高细胞内乙酰辅酶A的综合利用 率。
[0011] 其中线粒体工程菌将MVA途径的7个基因定位到线粒体中实现线粒体内乙酰辅酶A 的利用。
[0012] 作为本发明的一种实施方式,所述细胞质工程菌采用酿酒酵母内细胞质内乙酰辅 酶A利用的调控策略,即推-拉-阻策略,实现细胞质内乙酰辅酶A到异戊二烯的合成。推即过 表达细胞质代谢途径中的限速酶,拉是过表达目的途径的催化酶,阻是弱化竞争途径中的 关键酶的表达量或者酶活。
[0013] 进一步,作为本发明的一种实施方式,线粒体工程菌和细胞质工程菌选择具有不 同交配型的野生菌作为基础菌株。如BY4741(交配型a)(ATCC201388)、BY4742(交配型a型) (ATCC201389)等。
[0014] 进一步,线粒体工程菌和细胞质工程菌两者具有不同的影响缺陷型,然后将其进 行杂交,在含有双营养缺陷培养基的平板上进行筛选。
[0015] 本发明的有益效果:
[0016]通过引入细胞色素 c氧化酶IV亚基的前导肽,成功地将基因定位到线粒体内,建立 了线粒体内乙酰辅酶A代谢调控的方法。建立了细胞质的推-拉-阻代谢调控策略。最后通过 菌株杂交的方式,建立了细胞质和线粒体双调控的策略。在具体实施实例中,成功将以上策 略用于类异戊二烯中的关键合成单体异戊二烯的生物合成中。此发明为代谢工程改造酿酒 酵母生产异戊二烯的工业化奠定了基础。此外,以上策略也为酿酒酵母内其他高附加值的 化学产品的生物合成提供了新的技术方法。
[0017] 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂,下文特举较佳实施例, 并配合附图,作详细说明如下。
【附图说明】
[0018] 图1为双调控策略的示意图。
[0019] 图2为实施例1中PUG35-MLS26图谱。
[0020] 图3为实施例1中MLS26的线粒体定位能力的验证图。
[0021 ]图4A为实施例2中MVA途径在线粒体内定位的基因表达盒结构。
[0022]图4B为实施例2中MVA途径在线粒体内定位基础组装工具图。
[0023] 图5为实施例2中MVA在线粒体定位后的基因型鉴定图。
【具体实施方式】
[0024] 图1为双调控策略的示意图。下面通过实施例对其进行详细描述。
[0025] 实施例1基因在线粒体中的定位方法及鉴定
[0026] 选用具有较强荧光度的EGFP基因(EGFP为GFP根据白色念球菌偏好型优化后,通过 2个位点的改变增加了荧光强度基因序列)单拷贝质粒PUG35(GenBank:AF298787.1)作为报 告载体。在线粒体定位序列的表征中,在EGFP的ATG前端引入细胞色素 c氧化酶IV亚基的前 导肽序列的碱基序列为SEQ ID勵:2,构建?呢35-]\0^26质粒,?1^35-]\0^26图谱如图2所示。 即以酿酒酵母BY4742基因组为模板,利用BamHI-MLS26-Fl及HindIII-MLS26-Rl为引物(弓丨 物的具体序列见附表1),扩增出MLS26序列,与PUG35质粒一起用BamHI和Hindlll双酶切后, 连接。将HJG35及重组质粒PUG35-MLS26分别转入BY4742,用SD-MET-URA双缺陷培养基平板 筛选并培养后,用共聚焦荧光显微镜鉴定荧光蛋白的定位。结果如图3所示,融合有MLS26序 列的荧光蛋白定位与线粒体荧光染料定位一致,该结果表明可以通过融合MLS26序列将基 因成功定位到线粒体中。
[0027]实施例2乙酰辅酶A的线粒体调控
[0028]为验证线粒体代谢调控策略的实用性,以MVA途径为例,对异戊二烯的生物合成进 行了探究。在基因于线粒体的定位实验中,基因表达盒由启动子-定位序列-基因-抗原标 记-终止子组成(图4A),为了实现MVA途径的快速整合型组装,如图4B所示,构建了 pURMI-21-MLS(SEQIDN0:3)及pUMRI-22-MLS两个载体(SEQIDN0:3)。质粒构建方法为体外同源 同组法(即无缝克隆法),采用NovoRec?PCR-步定向克隆试剂盒。构建过程为:首先以P MG35-MLS26 为模板,MLS26-BamHI-F2&MLS26-BamHI-R2,MLS26-BamHI-F3&MLS26-BamHI-R2,MLS26-EcoRI-F2&MLS26-EcoRI-R2,MLS26-EcoRI-F3&MLS26-EcoRI-R3 为引物对,扩增出 MLS26-BamHI-2/3及MLS26-EcoRI-2/3片段;然后采用Dpnl酶将PCR产物中残留的模板降解 掉,清洗备用;利用同源重组的方法,将MLS26-BamHI-2和MLS26-BamHI-3片段分别重组到的 线性化的 pURMI-22 及 pURMI-21 的 BamHI 酶切位点处,构建 pURMI-22-MLS(B)及 pURMI-21-MLS (B);利用同源重组的方法,将MLS26-EcoRI-2和MLS26-EcoRI-3片段分别重组到的线性化的 pURMI-22 及 pURMI-21 的 EcoRI 酶切位点处,构建 pURMI-22-MLS(B)-MLS(E)及 pURMI-21-MLS (B) -MLS(E),即pURMI-22-MLS和pURMI-21-MLS,具体引物可见表 1。
[0029] 表1引物序列
[0030]
[0031] 在 MVA 途径于线粒体的组装中,构建了 PUMRI-21-MLS-A LPP1-HMGS-ERG10、PUMRI- 21-MLS-Δ DPPl-PMK-tHMGl-2、PUMRI-22-MLS-Δ H0-tHMGl-ERG12和PUMRI-22-MLS-Δ GAL80-MVD1-IDI1四个重组质粒。以上基因序列均来源于酿酒酵母BY4741(GenBank: JRIS00000000.1)。以pUMRI-21-MLS-ERG10-HMGS 为例,HMGS 和 ERG10 分别用 HMGS-F1&HMGS-R1和ERG10-F1&ERG10-R1为引物,以酿酒酵母基因组为模板,进行PCR扩增,然后插入到 pUMRI-21-MLS的相应酶切位点,生成质粒pUMRI-21-MLS-HMGS-ERGlO。以LPPl-UpFl&LPPl-UpR 1为引物,扩增得到LPP1 -UP同源臂,以LPP1-DF1 &LPP 1 -DR 1为引物,扩增得到LPP1 -Do wn 同源臂,然后用生成的LPP1 -UP同源臂和LPP1 -Down同源臂为模板,LPP1 -UpR 1 and LPP1 -DF1 为引物,通过重叠衍生PCR的方法扩增出LPP1同源臂,通过同源重组的方法整合到pUMRI-21-MLS-HMGS-ERG10的Sf i I位点,生成质粒pUMRI-21-MLS-Δ LPP1-HMGS-ERG10。同理,其它 的三个重组质粒均按以上方法构建,涉及引物如表2所示。
[0032] 表 2
[0033]

[0035] 来源于银白杨的异戊二稀合酶(ispS)基因序列来自Gene Bank数据库(Gene Bank:AB198180),密码子优化后的序列为(SEQ ID N0:5),其序列不含有信号肽,由上海生 工公司化学合成。为将ISPS定位到线粒体中,构建了 pESC-URA-2MISPS质粒:以pUMRI-21-MLS为模板,MLS-F4及MLS-R4为引物,扩增出MLS26-PGAL1-PGAL10-MLS26片段,然后插入到 pESC-URA 载体(GenBank: AF063585 · 2)的 BamHI 和 Not 頂每切位点处,生成 pESC-URA-2MISPS。
[0036] 将以上四个重组质粒卩1]]\?1-21-]\11^-&1^?1-腿6541^10、?1]]\?1-21-]\11^-&〇??1-PMK-tHMGl-2、PUMRI-22-MLS- Δ H0-tHMGl-ERG12和PUMRI-22-MLS- Δ GAL80-MVD1-IDI1 依次 用Sf i I酶切线性化,通过电转的方式转入BY4742,实现MVA途径在线粒体的基因整合,最后 菌株的基因型经PCR验证,结果如图5所示,所有的PCR扩增DNA片段大小均与理论值一致,最 后检测目的产物异戊二烯的产量提高了 4倍。通过好氧发酵后异戊二烯产量达到108mg/L。
[0037] 实施例3细胞质的推-拉-阻策略及细胞质&线粒体的双调控策略的建立
[0038] 为了综合利用工程菌酿酒酵母中的乙酰辅酶A,同样以异戊二烯的生物合成为例, 首先,对细胞质自身的MVA途径进行调控,建立了推-拉-组的结合策略。然后,将以上方法进 行了组合,建立了细胞质和线粒体的双调控策略。
[0039] 1)推策略的建立-过表达HMGR
[0040]用真菌基因组提取试剂盒提取酿酒酵母BY4741的基因组DNA,利用引物tHMGlF3 (CCCGGATCCAAAAATGGACCAATTGGTGAAAACTGAAG)/tHMGlR (CCCGTCGACTTAGGATTTAATGCAGGTGACG)从BY4741 基因组DNA上扩增了 HMG1 基因的催化区段 tHMGl。反应程序为:98 °C变性10s,55 °C退火5s,72°C延伸2分钟,30个循环,72 °C延伸5分钟。 BamHI+SalI酶切后克隆到pMRI-11 (SEQ ID N0: 6)载体上,形成pMRI-11-tHMGl。通过在 tHMGl基因内部选用内切酶Bglll对载体线性化后电转酿酒酵母BY4741,涂布于含有G418 的Yro平板上,待3天长出菌落后,接种于YH)培养液,1天后提取基因组,进行基因型验证,通 过培养,气相分析产量提高了一倍,达到〇.〇9mg · Γ1。
[0041 ] 2)拉策略-ISPS过表达
[0042]以克隆好的i spS基因作为模板,利用高保真DNA聚合酶(TAKARA,上海)以上游引物 P5(AAATATGCGGCCGCAAAAAATGTGTTCTGTTAGCACT)和下游弓| 物 P6 (GGAAGATCTTTAACGTTCAAACGGCAGG)作为引物进行 PCR扩增。反应程序为:98 °C 变性 10 s,5 5 °C 退火5s,72°C延伸2分钟,30个循环,72°C延伸5分钟。所得的DNA与质粒pESC-URA-ispS分别 用No 11和Bgl II双酶切,通过T4DNA连接酶进行连接,转入制备好的大肠杆菌化转感受态,然 后加入LB培养基37度复苏1小时,离心后均匀涂布在含有氨苄抗性的LB平板上。挑取若干单 菌落,用质粒提取试剂盒提取质粒,通过per或双酶切的方式筛选出阳性克隆。其阳性质粒 命名为pESC-URA-ispS-ispS。将pESC-URA-ispS-ispS通过电转的方式转化入过程1菌株,涂 布在营养缺陷型的培养基SD-URA-上。挑取形态大小正确的菌株,接种于3ml SD-URA-培养 液中,1天后转接l〇〇ul于装有5ml新的SG-URA-培养基的密闭小瓶中,厌氧发酵,2天后,通过 气相检测异戊二烯的产量,其产量达到〇.2mg · Γ1。
[0043] 3)阻策略-ERG20的下调
[0044] 为了削弱这些竞争性代谢途径代谢流,我们采用了启动子替换的方式,将弱启动 子pBTSl和pHXTl整合到ERG20基因的启动子位点,用同源重组的方法替换掉ERG20基因自身 的启动子区段,其方法如下:
[0045]制备ERG20启动子替换的同源臂
[0046]上游同源臂克隆片段为ERG20启动子上游区段,其序列如下:
[0047]
ACAGTGTGAGGTATTCTAAGC,其克隆方法为以酿酒酵母BY4741基因组作为模板,引物P9
CCTCACACTG)作为引物,利用Pr imer Star高保真聚合酶进行PCR,反应程序为:98 °C变性 10s,55°C退火5s,72°C延伸1分钟,32个循环,72°C延伸5分钟。
[0048]下游同源臂克隆片段为ERG20编码区段的前lOOObp,其序列如下:
[0049]
其克隆方法为以酿酒酵母B Y 4 7 4 1基因组作为模板,P 1 1
作为引物,利用Primer Star高保真聚合酶进行PCR,反应程序为:98°C变性10s,55°C退火 5s,72 °C延伸1分钟,32个循环,72 °C延伸5分钟。
[0050] 上下游同源臂的拼接:上述上下游per片段具有20个碱基左右的同源序列,故可以 通过over lap PCR的方法进行拼接。其步骤为:以上述PCR的两个片段作为模板,P11
CCTCACACTG)作为引物,利用Primer Star高保真聚合酶进行PCR,反应程序为:98°C变性 10s,55 °C退火5s,72 °C延伸2分钟,32个循环,72 °C延伸5分钟。所得PCR片段通过凝胶电泳的 方法进行验证,通过割胶回收或者PCR清洗的方法获取较纯的融合PCR片段。
[0051 ] 将上述融合PCR片段与之前构建好的质粒PMRI-28(SEQ ID N0:7WPPMRI-29(SEQ ID觀:8)分别用化丨1〇4以1^)和3^1〇41^1^)进行分步双酶切0〇丨1酶切体系为:26111 DNA+3ul buffer+lul酶,37度酶切3h; Sf iI酶切体系同上,50度酶切3h;(注:单步酶切后要 用per清洗试剂盒清洗过后进行下步反应)。用PCR清洗试剂盒清洗过后,用T4DNA连接酶进 行连接(体系:20ul = 8ul酶切质粒+9ul酶切PCR产物+2ul反应缓冲液+lul T4DNA连接酶,混 匀后,放置在22度金属浴中反应20-30分钟)然后转化入大肠杆菌感受态,涂布于含有卡纳 的LB平板上。按照上述同样的方法进行菌株的验证,挑选出阳性克隆并提取质粒。
[0052] 将PMRI-28-ERG20和PMRI-29-ERG20用Sail酶进行单酶切,酶切体系为:43ul质粒+ 5ul buffer+2ul酶,37度酶切3h。然后进行PCR清洗,最后浓缩到20ul。取10ul感受态转化入 50ul过程2的电转感受态中,750V电压电击(1mm电转杯),添加 lmlYNB培养液复苏lh,然后涂 布在含有G418的YH)平板上。最后的阳性克隆厌氧发酵2天后进行气相检测。检测条件为:柱 子为HP-FFAP,载气为氮气,柱温设为80度,检测器与进样口分别为180度。用密封型取样器 顶空取样800ul进行分析,最后检测异戊二烯产量分别达到4. Omg/L和9. Smg/LJ)双调控 [0053]以异戊二烯的生物合成作为应用实例,对细胞质和线粒体的乙酰辅酶A进行双调 控。以HJG23 (GenBank: AF298783 · 1)为模板,以Hi s3-Fl (CGTTTTAAGAGCTTGGTGAGC)和出83-R1 (CGCCTCGTTCAGAATGACA)为引物进行PCR,将PCR片段转入实例2的菌株,将Hi s 3标记补齐; 同时,以pESC-LEU(GenBank:AF063849. 1)为模板,以 markerF
PCR片段转入实例3的菌株,将Leu标记补齐,同时将调解因子GAL80P敲除;然后将两个工程 菌株进行杂交涂布在SD-HIS-LEU双营养缺陷平板上进行筛选,长出来的菌株即为杂交菌 株,最后将杂交菌株好氧发酵,检测异戊二烯的生物量达到246mg/L。
[0054] 本发明所述的PCR,米用takara公司(大连)的PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Code No. :R010A)试剂盒,按照其操作说明进行操作。
[0055] 本发明所述的无缝克隆米用Seamless Cloning and Assembly Kit(Invitrogen) 无缝克隆试剂盒,并按其操作说明进行操作。
[0056]本发明中所用的引物,合成的DNA序列均由上海生物工程有限公司提供。
[0057]本发明中所述的酶切如无特别说明,均按照Takara公司所购买的限制性内切酶操 作说明进行操作;所述的回收如无特别说明均按照Axygen公司凝胶回收试剂盒或者PCR清 洗试剂盒进行操作;所述的连接如无特别说明,均采用Fermentas公司的T4DNA连接酶进行 连接;所述大肠杆菌转化如无特别说明,其宿主菌都为DH5a,转化方法均采用热击法进行。 [0058]虽然本发明已由较佳实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟知此技 艺者,在不脱离本发明的精神和范围内,可作些许的更动与润饰,因此本发明的保护范围当 视权利要求书所要求保护的范围为准。

















【主权项】
1. 酿酒酵母内线粒体内乙酰辅酶A利用的调控策略,其特征在于,将MVA途径的7个基因 定位到线粒体中实现线粒体内乙酰辅酶A的利用。2. 根据权利要求1所述的酿酒酵母内线粒体内乙酰辅酶A利用的调控策略,其特征在 于,其中所述基因在线粒体内定位的方法为:在基因的前端引入氨基酸序列SEQ ID N0:1, 其中SEQ ID NO: 1的前25个氨基酸为细胞色素 c氧化酶IV亚基的前导肽序列,第25和26位氨 基酸为蛋白酶识别位点LQ。3. 根据权利要求2所述的酿酒酵母内线粒体内乙酰辅酶A利用的调控策略,其特征在 于,在前导肽的作用下,基因可以定位到线粒体中,之后在螯合剂感应的蛋白酶作用下,蛋 白序列LQ之间的肽键会发生断裂,生成成熟蛋白多肽。4. 根据权利要求2所述的酿酒酵母内线粒体内乙酰辅酶A利用的调控策略,其特征在 于,编码氨基酸序列SEQ ID NO: 1的碱基序列为SEQ ID NO:2。5. 酿酒酵母内细胞质和线粒体内乙酰辅酶A利用的双调控策略,其特征在于,首先分别 构建线粒体代谢工程菌株和细胞质工程菌,然后通过杂交的方式构建双倍体菌株,该菌株 实现细胞质跟线粒体调控策略的结合,提高细胞内乙酰辅酶A的综合利用率; 其中线粒体工程菌将MVA途径的7个基因定位到线粒体中实现线粒体内乙酰辅酶A的利 用。6. 根据权利要求5所述酿酒酵母内细胞质和线粒体内乙酰辅酶A利用的双调控策略,其 特征在于,所述细胞质工程菌过表达细胞质代谢途径中的限速酶,过表达目的途径的催化 酶,弱化竞争途径中的关键酶的表达量或者酶活。7. 根据权利要求5所述酿酒酵母内细胞质和线粒体内乙酰辅酶A利用的双调控策略,其 特征在于,线粒体工程菌和细胞质工程菌选择具有不同交配型的野生菌作为基础菌株。8. 根据权利要求5所述酿酒酵母内细胞质和线粒体内乙酰辅酶A利用的双调控策略,其 特征在于,线粒体工程菌和细胞质工程菌两者具有不同的影响缺陷型,然后将其进行杂交, 在含有双营养缺陷培养基的平板上进行筛选。
【文档编号】C12N15/04GK105950648SQ201610321188
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】于洪巍, 王凡, 吕小妹, 谢文平, 叶丽丹
【申请人】浙江大学
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