雄性不育基因OsGEN的应用及育性恢复的方法
【专利摘要】本发明涉及水稻育种技术领域，具体涉及一种雄性不育基因OsGEN的应用及育性恢复的方法；所述的雄性不育基因OsGEN的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用是：采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系统，敲除、改变或抑制OsGEN基因，使得常规水稻品种中的OsGEN基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。本发明还涉及一种恢复OsGEN基因缺失导致水稻雄性不育的方法，通过引物扩增OsGEN基因，使用遗传转化的手段转化突变体植株，能够使突变体恢复到野生型表型。本发明获得的水稻突变体营养生长阶段没有任何异常,但纯合体植株完全不育。如果应用于杂交育种中，可以免除母本去雄的工作，大大提高生产效率，降低人工成本，在农业生产上具有重要的应用。
【专利说明】
雄性不育基因 OsGEN的应用及育性恢复的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及的是一种生物工程技术领域的水稻株系创制的方法，具体是一种雄性 不育基因 OsGEN的应用及育性恢复的方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上主要的粮食作物之一，更是我国最重要的粮食作物。中国约有60% 以上的国人以稻米为主食，是世界上最大的稻米生产国和消费国。杂交水稻可以大幅度的 提高水稻产量，是解决粮食问题的重要方法。目前生产上使用的杂交水稻属于三系杂交水 稻，比常规水稻增产20%左右。但是三系法杂交水稻种子优势表现复杂，受恢复系和保持系 的限制。因此，科学家们一直在筛选和培育新的不育系，为远缘杂交和杂交优势的利用奠定 基础。其中，利用分子生物学手段阻断雄性配子体的发育，制造雄性不育系是杂交育种的重 要手段。
[0003] 雄性不育在自然界中普遍存在，水稻雄性配子体成熟于水稻花药中，雄性配子体 的成熟包括复杂的生物学过程。首先，造孢细胞增殖发育形成花粉母细胞，花粉母细胞经过 减数分裂形成四分体，随后包裹在四分体周围的胼胝质降解，释放出小孢子，单核小孢子经 过两次有丝分裂形成两个生殖核和一个营养核，同时小孢子表明形成外壁结构最终发育成 为成熟花粉。减数分裂过程是形成单倍体配子，进而保证在双受精过程中遗传物质恢复原 来倍性的前提。在减数分裂过程中，同源染色体进行联会、配对，保证同源染色体能够正确 的分配到子细胞中，并能正确形成单倍体配子。雄配子体发育过程受到多种因素的调节，其 中一个环节出错将会导致小孢子不能正常发育进而导致雄性不育。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种雄性不育基因 OsGEN的应用及育 恢复的方法，利用OsGEN基因及其蛋白参与调控水稻雄性生殖的特点，及其利用转基因技术 控制水稻雄性生殖发育，通过突变该蛋白序列或抑制该蛋白的表达产生新的水稻雄性不育 株系，在农业生产上具有十分重要的应用。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0006] 第一方面，本发明涉及一种水稻雄性不育基因 OsGEN的应用，所述雄性不育基因 OsGEN编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述的应用具体是，采用常规方法或基于 CRISPR/Cas9系统，敲除、改变或抑制OsGEN基因，使得常规水稻品种中的OsGEN基因表达水 平降低，进而获得水稻雄性不育株系。
[0007] 优选地，所述常规方法包括常规的基因工程方法、射线照射等。
[0008] 第二方面，本发明涉及一种水稻雄性不育株系创制的方法，包括如下步骤:选择常 规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述处理为，采用常规方法或基于 CRISPR/Cas9系统，使得水稻中编码如SEQ ID No. 1所示氨基酸的核苷酸序列发生缺失，变 异或抑制，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的表达水平降低或活性丧失。
[0009]优选地，所述常规方法包括常规的基因工程方法、射线照射等。
[0010] 优选地，所述水稻品种为粳稻品种9522。
[0011] 优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0012] 优选地，所述水稻雄性不育株系创制的方法包括如下步骤:采用物理诱变的方法， 使常规水稻品种中如SEQ ID No.2所示核苷酸序列突变为SEQ ID No. 10,进而获得所述水 稻雄性不育株系，即osgen突变体。
[0013] 优选地，所述水稻雄性不育株系创制的方法包括如下步骤:采用物理诱变的方法， 使常规水稻品种中如SEQ ID No. 1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No. 11，进而获得所述水 稻雄性不育株系，即osgen突变体。
[0014] 优选地，所述基于CRISPR/Cas9系统具体包括:采用CRISPR/Cas9系统定点敲除的 方法，敲除OsGEN基因，抑制编码如SEQ ID No. 1所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达。
[0015] 更优选地，所述CRISPR/Cas9系统定点敲除的方法包括如下步骤：
[0016] a)合成单核苷酸序列引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
[0017] 0sGENCRISPRUP(SEQ ID No.3):TGTGTGAACATGGCAGACATTGAGTC
[0018] OsGENCRISPRLOff(SEQ ID No.4):AAACGACTCAATGTCTGCCATGTTCA
[0019] b)通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与载体片段(载体来自 百格公司，货号BGK03)进行连接反应，构建含有水稻OsGEN基因靶序列（如SEQ ID No. 13所 示）的0sGEN-BGK03质粒；
[0020] C)用含0SGEN-BGK03质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种；
[0021] d)通过将OsGEN基因的特异性引物扩增基因组片段进行测序，筛选突变植株。
[0022] 所述水稻OsGEN基因靶序列如下所示：
[0023] SEQ ID No.13:AACATGGCAGACATTGAGTC
[0024] 第三方面，本发明还涉及一种所述水稻雄性不育株系创制的方法获得的水稻雄性 不育株系在水稻制种中的用途，所述用途包括：以所述水稻雄性不育株系作为母本，进行杂 交育种。
[0025] 第四方面，本发明还涉及一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，包 括如下步骤:采用常规遗传手段将所述OsGEN基因，转入上述方法获得的水稻雄性不育株系 中，进而使得突变体恢复野生型表型。
[0026] 优选地，所述方法包括如下步骤：将含〇sGEN互补构建的根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得;其中OsGEN 互补构建含有序列如SEQ ID No.5所示的核苷酸。
[0027] 更优选地，所述方法具体包括如下步骤：
[0028] (a)从水稻9522基因组中用碱基序列如SEQ ID Νο·6和SEQ ID No.7、SEQ ID Νο·8 和SEQ ID No.9所示的引物扩增出OsGEN基因的5599bp的基因组序列片段(包含启动子序 列）；
[0029] (b)提供携带表达OsGEN互补构建载体的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105；
[0030] (c)将水稻雄性不育株系的细胞或组织或器官与步骤(b)中的农杆菌接触，从而使 编码如SEQ ID NO. 1所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；
[0031] (d)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织或器官，再生，获得恢复育性的水稻植 株。
[0032]本发明具有如下的有益效果:本发明通过控制水稻花粉发育基因 OsGEN及其编码 蛋白获得水稻雄性生殖发育的变异株，实现控制水稻生殖过程;本发明获得的水稻突变体 在营养期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，花粉败育，得到 完全不育的植株，在杂交水稻构建和农业生产上具有十分重要的应用。
【附图说明】
[0033]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0034] 图1为BGK03载体及OsGEN CRISPR的构建示意图；
[0035]图2为osgen突变体植株的形态学观察示意图；其中，图2A为野生型和osgen突变体 整株表型；图2B为野生型和osgen突变体穗形；图2C为野生型和osgen突变体小穗；图2D为野 生型和osgen突变体小花内部结构；图2E为野生型和osgen突变体雌蕊；图2F为野生型和 osgen突变体雄蕊；图2G为野生型成熟花粉I2/KI染色结果；图2H为osgen突变体I2/KI染色结 果；
[0036] 图3为OsGEN基因表达模式图；
[0037]图4为互补突变体得到野生型表型示意图；其中，图4A为野生型小花内部结构图； 图4B为osgen突变体小花内部结构图；图4C为osgen突变体恢复株系小花内部结构图；图4D 为野生型成熟花粉I2/KI染色结果；图4E为osgen突变体I2/KI染色结果；图4F为osgen突变体 恢复株系I 2/KI染色结果。
【具体实施方式】
[0038]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0039]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0040] 所述OsGEN基因为编码如SEQ ID No. 1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
[0041 ] 实施例1、水稻雄性不育株系创制的方法
[0042] 1.1通过物理诱变手段创制osgen水稻雄性不育株系
[0043] 本实施例中OsGEN基因的编码区序列如SEQ ID No.2所示。本实施例的osgen突变 材料是由常规粳稻品种武育粳7号(又名9522)经过常规的基因工程方法突变而得。
[0044]本领域人员知晓，还可以采用诸如射线照射等其他手段诱变水稻常规品种进行突 变，具体包括经过6()C〇 γ射线诱变获得osgen突变体，处理剂量为280Gy (参照方法：陈亮，储 黄伟，袁政，et al. 60C〇 γ -Ray射线诱变水稻突变体的分离和遗传学初步分析[J].厦门大 学学报：自然科学版，2006，（S1): 82-85)。对诱变的突变体回交三代，获得隐性核单基因控 制的稳定遗传的osgen突变体。将osgen突变体与9522回交，所有F1代的表型都与9522-致， 表现为可育。突变体与野生型杂交的F1代自交后产生的F2代群体中，可育与不育植株的分 离比约为3:1(可育：不育= 213:75，x2 = 0.1667，P>0.05)，表明这是一个由隐性单基因突变 导致的突变体不育的表型。
[0045] 1.2水稻雄性育性控制基因 OsGEN的克隆
[0046]利用发明人构建的包含育性控制蛋白基因 OsGEN(其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所 示)及其突变基因 osgen(其核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示)组成的、本领域内技术人员清 楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或posit ion cloning)群体，按分子标记定位 于1个小的基因组片段内。在此基础上，用常规方法分离包含该片段的基因组DNA克隆。经测 序和进一步的杂交鉴定确定其中一个含完整水稻雄性生殖发育控制蛋白OsGEN。
[0047] 经全核苷酸序列分析结果表明：水稻雄性育性OsGEN基因全长为3987bp(SEQ ID No.12,包含调控区和内含子）。经软件分析和cDNA克隆，其0RF如SEQ ID No.2所示，编码全 长为629个氨基酸的水稻雄性生殖发育控制蛋白，其序列如SEQ ID No. 1所示。
[0048] 1.3水稻雄性育性控制蛋白基因的点突变
[0049]本实施例的osgen突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号（又名9522)经过对OsGEN 基因的序列变异获得，经过对OsGEN突变基因 osgen的序列比较，水稻雄性生殖发育控制蛋 白的移码和提前终止会使得水稻雄性生殖器官不能正常发育，造成植株不育；本实施例 OsGEN突变基因是在编码区的2个碱基对缺失（其序列如SEQ ID No. 10所示），使SEQ ID No.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID No.11，从而引起水稻雄性生殖发育控制蛋白翻译的提 前终止和功能丧失。
[0050] 1.4通过CRISPR手段降低水稻品种中的OsGEN的表达水平
[0051 ] 为了对OsGEN蛋白进行应用，构建了 OsGEN基因 CRISPR的载体(载体来自百格公司， 货号BGK03)，并转化野生型9522植株，以降低OsGEN的表达，从而达到改变水稻育性的目的。 BGK03载体及OsGEN CRISPR的构建示意图如图1所示。
[0052]合成单核苷酸序列引物
[0053] OsGENCRISPRUP(其序列如SEQ ID No.3K*):TGTGTGAACATGGCAGACATTGAGTC
[0054] OsGENCRISPRLOW(其序列如SEQ ID No.4K*):AAACGACTCAATGTCTGCCATGTTCA
[0055] 通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与载体片段(载体来自百 格公司，货号BGK03)进行连接反应，构建含有水稻OsGEN基因靶序列0sGEN-BGK03质粒；
[0056] 将含有0sGEN-BGK03构建的农杆菌在含有Kan(50ygAU)的YEB平板上划线，获的单 菌落。挑单菌落接种到3ml含抗生素的YEB液体培养基中于28°C振荡培养过夜，第2天按1% 接种量转接入50ml含抗生素的YEB液体培养基中，200rpm继续振荡培养至OD600为0.6至0.8 左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养 基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。
[0057]本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻9522的幼胚愈伤。取授粉后12-15 天的9522未成熟种子经70%乙醇浸泡1分钟后，于NaCIO溶液中（与水1:3混合，加2-3滴吐温 20)消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和镊子挑出幼胚并接种月N6D2培 养基上诱导愈伤组织，在26±1°C、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤浸泡入 新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的 菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26 °C共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙 酰丁香酮，使用浓度为100μΜ』天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入含 有25mg/L Hyg的选择培养基上进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到含有50mg/L Hyg的选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上 培养一周左右，再移至分化培养基上分化（12小时光照/天）。再生的小苗在l/2MS〇H培养基 上生根壮苗，随后移入人工气候室营养液栽培。
[0058]阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。测序检测靶位点基因序列， 如果发生纯合突变则为有效的基因敲除植株。
[0059] 1.5 OsGEN蛋白活性丧失或表达水平降低导致水稻雄性发育异常
[0000] 对osgen突变体植株的形态学观察。如图2所示，osgen突变体与野生型相比营养生 长以及小穗，小花以及雌蕊的形态均无异常（图2A，2B，2C，2E)，野生型9522花药发育正常 (图2D，图2F)，而osgen突变型花药呈淡黄色且变小（图2D，图2F);野生型9522成熟花粉可被 I2/KI染色（图2G)，突变型osgen与野生型花药成熟期相对应的时期观察不到花粉粒，剖开 花药腔只能看到少数退化的小孢子残留物，更无法被I 2/KI染色（图2H)。
[0061] 1.6 OsGEN表达特征
[0062] 利用osgen突变株的来源亲本9522各个器官组织，提取RNA，进行反转录得到cDNA 第一链，利用荧光定量PCR的方法确定OsGEN基因的表达模式(如图3 )，发现OsGEN基因在水 稻雄性生殖发育时期有广泛表达，且在水稻雄性生殖发育时期Stage8b和Stage9有着显著 的表达;除此之外，营养发育过程中的幼嫩的茎和叶中也有表达，在根中表达极微弱。
[0063] 1.7 OsGEN基因在创制其他水稻品系雄性不育株系中的应用
[0064]将osgen突变体与籼稻品种9311或广陆矮4号水稻品系杂交，在F2代中具有籼型特 征的植株中均出现了雄性不育株系，符合3:1分离规律，进而证明OsGEN基因在其他水稻品 种中发生核苷酸序列变化时，同样可以产生雄性不育植株。
[0065] 实施例2 osgen突变体在水稻制种中的用途
[0066]将osgen突变体作为母本与三系或两系杂交组合中的不育亲本杂交，得到F1代。在 F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株，将该植株与原不育亲本对应的保持系杂 交。再次在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株与保持系杂交，经多代杂交筛 选后获得新的雄性不育系，适宜作为杂交组合中的母本。
[0067] 实施例3恢复osgen突变体雄性不育性状的方法
[0068]将编码OsGEN基因的基因组核苷酸序列转入突变体osgen植株，能够使突变体恢复 到野生型表型。具体为将含OsGEN互补构建的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中OsGEN互补构建含有序列如SEQ ID No. 5所示的核苷酸。
[0069] 从水稻9522基因组中用引物：
[0070] 0sGENHB-lF(其序列如SEQ ID N0.6所示）：AATCTAGAAATTGTTGGCTGAAACACGG (Xbal)
[0071] 0sGENHB-lR(其序列如SEQIDN0·7所示）：AACCATGGCTCTCTTCTTCCCCGGCGAC (Ncol)
[0072] 扩增1976bp OsGEN-L启动子片段，用内切酶Xbal和Ncol酶切后连接水稻的双元载 体 PCAMBIA1301;测序正确后，获得 pCAMBIA1301-0sGENpro 载体。
[0073] 从水稻9522基因组中用引物：
[0076] 扩增出OsGEN基因的3623bp的基因组序列片段。
[0077] 将上一步构建好的pCAMBIA1301-0sGENpro载体经过Nco頂每切，与扩增片段通过 Infusion体系连接;测序验证正确获得pCAMBIA1301-0sGEN载体，该载体通过电击导入根癌 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105，得到OsGEN互补根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105,使用遗传转化手段转化突变体osgen成熟胚愈伤，从而使编码如SEQ ID NO. 1所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上;再生，获得 水稻植株；以观察是否会使突变体恢复到野生型表型。获得To代互补植株（即osgen突变体 恢复株系），图4显示To代互补植株可以产生花粉，并被I 2/KI染色，即表现出野生型表型。 [0078]综上所述，本发明通过控制水稻雄性生殖发育相关基因 OsGEN及其编码蛋白获得 水稻雄性生殖发育异常的变异株，实现控制水稻雄性生殖发育和育性;本发明获得的水稻 突变体在营养生长时期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后，雄性生殖器官发育 异常、花粉败育引起植株不育，在农业生产上具有十分重要的应用。
[0079]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种水稻雄性不育基因 OsGEN的应用，其特征在于，所述雄性不育基因 OsGEN编码的 氨基酸序列如SEQ ID No.l所示，所述的应用具体是，采用常规方法或基于CRISPR/Cas9系 统，敲除、改变或抑制OsGEN基因，使得常规水稻品种中的OsGEN基因表达水平降低，进而获 得水稻雄性不育株系。2. -种水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，包括如下步骤:选择常规水稻品 种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述处理为，采用常规方法或基于CRISPR/ Cas9系统，使得水稻中编码如SEQ ID No. 1所示氨基酸的核苷酸序列发生缺失，变异或抑 制，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的表达水平降低或活性丧失。3. 如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述水稻品种为粳 稻品种9522。4. 如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述核苷酸序列如 SEQ ID No .2所示。5. 如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述基于CRISPR/ Cas9系统具体包括:采用CRISPR/Cas9系统定点敲除OsGEN基因，抑制编码如SEQ ID No. 1所 示氨基酸序列的核苷酸序列的表达。6. 如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9 系统定点敲除的方法包括如下步骤： a) 合成单核苷酸序列引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示； b) 通过退火反应使合成的单核苷酸序列形成二聚体结构，与载体片段进行连接反应， 构建含有水稻OsGEN基因靶序列的0sGEN-BGK03质粒;所述靶序列如SEQ ID No. 13所示； c) 用含0sGEN-BGK03质粒的根癌农杆菌侵染水稻品种； d) 通过将OsGEN基因的特异性引物扩增基因组片段进行测序，筛选突变植株。7. -种如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法获得的水稻雄性不育株系在 水稻制种中的用途，其特征在于，所述用途包括：以所述水稻雄性不育株系作为母本，进行 杂交育种。8. -种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤:采 用常规遗传手段将所述OsGEN基因，转入如权利要求2所述方法获得的水稻雄性不育株系 中，进而使得突变体恢复野生型表型。9. 如权利要求8所述的恢复雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：将含 OsGEN互补构建的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHAl05转入所述水稻雄性不 育株系，培育，即得;其中OsGEN互补构建含有序列如SEQ ID No.5所示的核苷酸。10. 如权利要求9所述的恢复雄性不育性状的方法，其特征在于，所述方法具体包括如 下步骤： (a) 从水稻9522基因组中用碱基序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和 SEQ ID No.9所示的引物扩增出OsGEN基因的基因组序列片段； (b) 提供携带表达OsGEN互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105； (c) 将水稻雄性不育株系的细胞、组织或器官与步骤(b)中的农杆菌接触，从而使编码 如SEQ ID No.l所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上； (d)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织或器官，再生，获得恢复育性的水稻植株。
【文档编号】C12Q1/68GK105950651SQ201610248513
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】张大兵, 梁婉琪, 汪冲, 袁政, 陈明姣, 罗治靖
【申请人】上海交通大学