一种荧光定量PCR检测miR-100含量的引物及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种荧光定量PCR检测miR?100含量的引物及检测方法，利用荧光定量PCR检测样品中miR?100含量，本发明方法能够快速准确的检测样品中miR?100的含量，由于胃癌患者的发病都伴随着miR?100在病变组织以及血清中含量的显著上调，因此，快速有效的miR?100检测对于胃癌患者的监测是具有重要的意义的。
【专利说明】
一种荧光定量PCR检测m i R-100含量的引物及检测方法 (一)
技术领域
[0001] 本发明涉及miR-100的检测，特别涉及荧光定量PCR检测引物。 (二)
【背景技术】
[0002] 胃癌是一种消化系统常见的恶性肿瘤，发病率高，在我国，致死率居各种恶性肿瘤 之首，胃癌标志物的发现及应用对于提高胃癌的早期诊断率有着重大的意义。MicroRNAs (miRNAs)是最近被发现的一类非编码小RNA，研究表明，多数癌症的发生都与miRNA的异常 调控有关，miRNA的含量发生了明显的变化，其中，本实验室发现，胃癌患者的发病都伴随着 miR-100在病变组织以及血清中含量的显著上调，因此，在胃癌患者的治疗过程中，对miR-100含量的监控变得非常重要，急需建立一种快速准确的miR-100检测方法。 (三)
【发明内容】
[0003] 本发明目的是提供一种荧光定量PCR检测miR-100含量的引物及检测方法。
[0004] 本发明采用的技术方案是：
[0005] 本发明提供一种荧光定量PCR检测miR-100含量的引物，所述引物包括miR-100反 转录引物及miR-100荧光定量PCR引物F和引物R;
[0006] 所述miR-100的核苷酸序列为5' -AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'，
[0007] 所述miR-100反转录引物的核苷酸序列为：
[0008] 5 '-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACCACAAGT-3 '，
[0009] 所述miR-100荧光定量PCR引物F的核苷酸序列为：
[0010] 5，-CGCCGAACCCGTAGATCCG-3，，
[0011 ]所述miR-100荧光定量PCR引物R的核苷酸序列为：
[0012] 5 '-TGCAGGGTCCGAGGTCACTG-3 '。
[0013] 本发明还提供一种利用所述荧光定量PCR检测miR-100含量的引物检测miR-100含 量的方法，所述方法为：
[0014] (1)提取待测样品中的miRNA，利用miRNA反转录试剂(AB公司）及miR-100反转录引 物将提取的miRNA通过PCR反应反转录成cDNA;所述反转录PCR的反应程序为：16°C反应30分 钟，42 °C反应30分钟，最后85 °C反应5分钟；
[0015] (2)以反转录产物cDNA为模板，利用荧光定量PCR试剂(AB公司）及miR-100荧光定 量PCR引物进行PCR反应;所述荧光定量PCR的反应程序为:95 °C反应10分钟后，进行50个循 环的95 °C 5秒，60 °C 1分钟。
[0016] (3)采用绝对定量的方法，将步骤（1)中待测样品改为含miR-100标准品的混合液 进行反转录及焚光定量PCR反应，根据含miR-100标准品的混合液中miR-100标准品的浓度 对应的起飞CT值，得到miR-100含量与荧光定量PCR反应CT值之间的线性关系，绘制成浓度 与CT值之间的标准曲线;根据待测样品CT值，即可检测出miR-100的含量。
[0017] 本发明所述待测样品包括:细胞、组织或血清。
[0018] 采用总RNA提取试剂提取待测样品中的miRNA，如果是组织，加入少量液氮研磨后 加入Trizol进行裂解，如果是贴壁细胞或者血清，则直接用Trizol进行消化裂解，裂解后， 12000rpm离心五分钟，弃沉淀，后加入氯仿震荡混匀静置15分钟，4°C离心15min，取水相至 新的离心管中，加入异丙醇混匀，放置5-10分钟，离心，弃上清，RNA即沉于管底，加入50yL的 水溶解RNA样品，55-60°C放置5分钟后进行下一步反应。
[0019] 本发明的有益效果主要体现在:本方法与现有的检测方法相比，由于是miR-100 含量的特异性检测实验，那么miR-100的特异性反转录与定量PCR的引物最为关键，以前的 miRNA的引物全部依赖美国Invitrogen公司的进口，不仅价格昂贵(单对引物价格超2000人 民币），且由于从国外进口，货期长(时间不少于一个月），因此进行miRNA含量的检测十分的 不便，本发明针对该实验最为关键的miR-100的特异性反转录与定量PCR的引物入手，经过 对miRNA茎环结构的实验及分析，成功的得到了miR-100的特异性反转录与定量PCR的引物 序列，后续实验验证了该引物的可靠性，且货期短（国内合成1到2天），价格便宜（几十人民 币），该发明为miRNA的研究提供了便利。
[0020] 本发明提供一种荧光定量PCR检测miR-100含量的引物，利用荧光定量PCR检测样 品中miR-100含量，本发明方法能够快速准确的检测样品中miR-100的含量，由于胃癌患者 的发病都伴随着miR-100在病变组织以及血清中含量的显著上调，因此，快速有效的miR-100检测对于胃癌患者的监测是具有重要的意义的。 (四）
【附图说明】
[0021] 图1为筛选验证miR-100引物是否可用的定量PCR溶解曲线。
[0022] 图2为标准曲线。
[0023]图3利用本发明引物检测胃癌组织与正常组织中miR-100含量的结果图。
[0024]图4利用本发明引物检测胃癌患者血清与正常血清中miR-100含量的结果图。
[0025] 图 5 为miRNA 茎环。 (五)
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0027] 实施例1:
[0028] 根据实验室对miRNA茎环（图5)的测序，结合miRNA的转录机制，设计出了miRNA的 反转录及定量PCR引物。
[0029]反转录引物：
[0030] GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACXXXXXXX
[0031] XXXXXXX表示将miR-100成熟序列最后7个碱基反向互补得到的序列。
[0032] 定量PCR正向引物:CGCCGXXXXXXXXXXXXX
[0033] XXXXXXXXXXXXX表示miR-100成熟序列的前13个碱基序列。
[0034] 定量PCR反向引物：TGCAGGGTCCGAGGTCACTG
[0035]利用该引物设计规则，可以设计出任何一条miRNA的引物。
[0036] miR-100引物的验证
[0037] (1)将miR-100 标准品用 DEPC 水配制成10-3、10-2、10-\ 10°、101、102、103μΜ 的 mi-100 标准品溶液，利用miRNA反转录试剂(AB公司）及miR-100反转录引物将提取的miRNA通过PCR 反应反转录成cDNA;所述反转录PCR的反应程序为：16 °C反应30分钟，42 °C反应30分钟，最后 85 °C反应5分钟；
[0038] (2)以反转录产物cDNA为模板，利用荧光定量PCR试剂(AB公司）及miR-100荧光定 量PCR引物进行PCR反应;所述荧光定量PCR的反应程序为:95 °C反应10分钟后，进行50个循 环的95 °C 5秒，60 °C 1分钟。
[0039]结果见图1所示，PCR溶解曲线很单一，说明引物特异性好，可以有效的检测miR-1〇〇含量。
[0040] 实施例2标准曲线
[0041 ] (1)将miR-100 标准品用 DEPC 水配制成10-3、10-2、10-\ 10°、101、102、103μΜ 的 mi-100 标准品溶液，利用miRNA反转录试剂(AB公司）及miR-100反转录引物将提取的miRNA通过PCR 反应反转录成cDNA;所述反转录PCR的反应程序为：16 °C反应30分钟，42 °C反应30分钟，最后 85 °C反应5分钟；
[0042] (2)以反转录产物cDNA为模板，利用荧光定量PCR试剂(AB公司）及miR-100荧光定 量PCR引物进行PCR反应;所述荧光定量PCR的反应程序为:95 °C反应10分钟后，进行50个循 环的95 °C 5秒，60 °C 1分钟。根据含mi R-100标准品溶液中mi R-100标准品的浓度对应的起飞 CT值，得到miR-100含量与荧光定量PCR反应CT值之间的线性关系，绘制成浓度与CT值之间 的标准曲线，结果见图2所示。
[0043] CT = 3.259 Xlgx+33.777，x 为miR-100 标准品溶液中 miR-100 含量。
[0044] 所述miR-100的核苷酸序列为5' -AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'，
[0045] 所述miR-100反转录引物的核苷酸序列为：
[0046] 5 '-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACCACAAGT-3 '，
[0047]所述miR-100荧光定量PCR引物F的核苷酸序列为：
[0048] 5，-CGCCGAACCCGTAGATCCG-3，，
[0049] 所述miR-100荧光定量PCR引物R的核苷酸序列为：
[0050] 5 '-TGCAGGGTCCGAGGTCACTG-3 '。
[0051]实施例3待测样品的检测方法：
[0052]待测样品：胃癌患者胃组织，胃癌患者血清的获取完全符合医学或者伦理的要求， 都是在医院中获取的，是得到了病人的同意的。
[0053] (1)提取待测样品中的miRNA，利用miRNA反转录试剂(AB公司）及miR-100反转录 引物将提取的miRNA通过PCR反应反转录成cDNA，以包含引物的miRNA反转录试剂(AB公司） 为对照;所述反转录PCR的反应程序为：16°C反应30分钟，42°C反应30分钟，最后85°C反应5 分钟；
[0054] (2)以反转录产物cDNA为模板，利用荧光定量PCR试剂(AB公司）及miR-100荧光定 量PCR引物进行PCR反应，以包含引物的荧光定量PCR试剂(AB公司）为对照；所述荧光定量 PCR的反应程序为:95 °C反应10分钟后，进行50个循环的95 °C 5秒，60 °C 1分钟。
[0055] (3)依据实施例2制作的标准曲线；根据待测样品CT值，即可检测出miR-100的含 量，结果见图3和图4。
[0056] 采用总RNA提取试剂提取待测样品中的miRNA，如果是组织，加入少量液氮研磨后 加入Trizol进行裂解，如果是贴壁细胞或者血清，则直接用Trizol进行消化裂解，裂解后， 12000rpm离心五分钟，弃沉淀，后加入氯仿震荡混匀静置15分钟，4°C离心15min，取水相至 新的离心管中，加入异丙醇混匀，放置5-10分钟，离心，弃上清，RNA即沉于管底，加入50yL的 水溶解RNA样品，55-60°C放置5分钟后进行下一步反应。
[0057] 图3是胃癌患者胃组织中miR-100含量> 100fM的共57例，miR-100含量< 100fM的 共8例，非胃癌患者组织中miR-100含量>100fM的有11例，miR-100含量<100fM的有55例。 特异性为83.8% (57/68)，敏感性为86.4% (57/66)。以0. lfM为临界值，血清中miR-100含量 超过O.lfM或者胃组织中超过100fM，可以有效地鉴别胃癌患者与正常人。
[0058] 图4是胃癌患者血清中miR-100含量>0.1fM的共24例，miR-100含量<0.1fM的共5 例，非胃癌患者血清中miR-100含量>0. lfM没有，全部小于0. lfMJiR-100作为诊断指标的 特异性为100%(24/24)，敏感性为82.8%(24/29)。后面的这些结论是用本发明的引物做出 来的结果，与现有的方法相比，仅仅是引物的区别，而该引物通过溶解曲线的验证，能够特 异有效的检测出miR-100的表达量，说明该引物的可靠性，至于这些结论，都是因为miR-100 这条miRNA在癌症患者与正常人中是差异表达的，不论是用购买的进口引物还是本发明的 引物，得到的结论应该都是一致的。
[0059] 以O.lfM为临界值，血清中miR-100含量超过O.lfM或者胃组织中超过100fM，可以 有效地鉴别胃癌患者与正常人。
【主权项】
1. 一种荧光定量PCR检测miR-100含量的引物，其特征在于所述引物包括miR-100反转 录引物及miR-100荧光定量PCR引物F和引物R; 所述miR-100的核苷酸序列为5 ' -AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3 '， 所述miR-100反转录引物的核苷酸序列为： 5 '-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACCA CAAGT-3，， 所述miR-100荧光定量PCR引物F的核苷酸序列为： 5，-CGCCGAACCCGTAGATCCG-3，， 所述miR-100荧光定量PCR引物R的核苷酸序列为： 5 '-TGCAGGGTCCGAGGTCACTG-3 '。2. -种利用权利要求1所述荧光定量PCR检测miR-100含量的引物检测miR-100含量的 方法，其特征在于所述方法为： (1) 提取待测样品中的miRNA，利用miRNA反转录试剂及miR-100反转录引物将提取的 miRNA通过PCR反应反转录成cDNA;所述反转录PCR的反应程序为：16 °C反应30分钟，42 °C反 应30分钟，最后85 °C反应5分钟； (2) 以反转录产物cDNA为模板，利用荧光定量PCR试剂及miR-100荧光定量PCR引物进行 PCR反应;所述荧光定量PCR的反应程序为:95°C反应10分钟后，进行50个循环的95 °C 5秒，60 °C1分钟。 (3) 采用绝对定量的方法，将步骤（1)中待测样品改为用DEPC水配制的miR-100标准品 溶液进行反转录及焚光定量PCR反应，根据含miR-100标准品的混合液中miR-100标准品的 浓度对应的起飞CT值，得到miR-100含量与荧光定量PCR反应CT值之间的线性关系，绘制成 浓度与CT值之间的标准曲线;根据待测样品CT值，即可检测出miR-100的含量。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述待测样品包括:细胞、组织或血清。
【文档编号】C12Q1/68GK105950708SQ201610195171
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】章晓波, 龚燚, 杨耿, 王雨濛
【申请人】浙江大学