二茂铁标记的磁性纳米复合物的制备及相关应用
【专利摘要】本发明公开了一种二茂铁标记的磁性纳米复合物的制备方法并用于检测miRNA，该方法包括以下步骤：1）在纳米金包覆的磁球（MB?AuNPs）表面固定生物素修饰的发夹型DNA探针；2）miRNA与发夹型DNA探针杂交将发夹型DNA探针打开，使探针中修饰生物素基团的一端远离磁球表面；3）通过生物素与亲和素的相互作用，在磁球表面衍生二茂铁覆盖的纳米金/亲和素复合物。将上述复合物收集到磁性电极表面，通过检测二茂铁的电化学信号测定miRNA的含量。该复合物合成方法简单，用于电化学测试响应强、检测灵敏度高，能快捷检测miRNA的含量，可广泛应用。
【专利说明】
二茂铁标记的磁性纳米复合物的制备及相关应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种二茂铁标记的磁性纳米复合物的制备新方法，该方法重点应用于电化学生物传感领域，该复合物可用于定量检测miRNA。【背景技术】
[0002]二茂铁标记的磁性纳米复合物具有如下特性:易于磁性分离、表面便于化学修饰、 导电性好、电化学信号强。因此，该复合物在电化学分析方面具有一定的应用潜力。
[0003]本工艺选择将直径为40.5 nm、带正电荷的纳米金静电吸附于直径为2.6 Ml、带负电的磁球表面，通过表面生长过程使纳米金填满磁球表面的位点。通过Au-S键，在纳米金包覆的磁球(MB-AuNPs)表面固定生物素修饰的发夹型DNA探针，当序列完全匹配的miRNA与 DNA探针的环状部分杂交时，发夹型探针被打开，生物素基团远离磁球表面。通过生物素与亲和素的相互作用，在磁球表面衍生二茂铁覆盖的纳米金/亲和素复合物。随后，将上述复合物收集到磁性金电极表面进行电化学测定。基于上述复合物对电化学信号的双重放大作用，可用于检测含量极低的miRNA序列。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种二茂铁标记的磁性纳米复合物的制备方法并用于检测 miRNA。该复合物制备简单，具有双重信号放大功能，对miRNA检测快速、灵敏度高、选择性好，且无需对样品进行标记。
[0005]本发明公开了一种二茂铁标记的磁性纳米复合物的制备方法并应用于miRNA的测定，其特征在于通过碱基序列配对在MB-AuNPs表面衍生二茂铁覆盖的纳米金/亲和素复合物，来放大电化学信号。具体步骤如下:1)在MB-AuNPs表面通过Au-S键固定生物素修饰的发夹型DNA探针；2)miRNA与发夹型探针DNA的环状部分杂交将发夹型探针打开，使得生物素基团远离磁球表面；3)通过生物素与亲和素的相互作用，在磁球表面衍生二茂铁覆盖的纳米金/亲和素复合物。
[0006]所述的发夹型DNA探针茎部一端修饰巯基，另一端修饰生物素基团。
[0007]所述的发夹型DNA探针环状部分与miRNA序列互补配对，使得发夹结构打开，生物素基团远离磁球表面。
[0008]采用上述复合物检测miRNA的具体方法是:(1)将MB-AuNPs与浓度为1 yM生物素修饰的发夹型DNA探针溶液混合震荡5 h，超纯水清洗，磁分离，除去上清液；(2)将步骤(1)得到的MB-AuNPs采用50此，0.1 mM的巯基己醇封闭10~30 min，超纯水清洗，磁分离，除去上清液；(3)在步骤(2)的基础上采用50 yL，1%的牛血清白蛋白封闭0.5?1.5 h，超纯水清洗，磁分离，除去上清液；(4)miRNA的检测:(a)将上述(3)封闭后的MB-AuNPs与50 yL浓度为1 nM的miRNA混合震荡20?180 min，超纯水清洗，磁分离，除去上清液；(b)将10 yL二茂铁覆盖的纳米金/亲和素复合物加入到步骤(a)所得的MB-AuNPs中，20 ?60 min后用超纯水清洗，磁分离，除去上清液；(c )将步骤(b)中所得的复合物收集到磁性金电极表面，在0.1?0.5 M的KC1 〇4水溶液中进行电化学检测；本发明采用的电化学检测是在室温条件下，采用三电极体系，其中，二茂铁标记的磁性纳米复合物修饰的金电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，Pt丝为辅助电极，扫速为 0.1 V/s，扫描范围为-0.1?0.7 V。
[0009]本技术发明了一种二茂铁标记的磁性纳米复合物的制备方法并用于检测miRNA， 相比于现有技术，有如下优点:易于磁性分离、表面便于化学修饰、导电性好、电化学信号强。通过上述复合物对电化学信号的双重放大作用，本发明对靶点miRNA的最低检测浓度可达到5 fM。【附图说明】
[0010]【图1】为本发明制备的二茂铁标记的磁性纳米复合物示意图:1为纳米金包覆的磁球，2为生物素修饰的发夹DNA探针，3为miRNA，4为二茂铁覆盖的纳米金/亲和素复合物。 [〇〇11]【图2】为本发明检测miRNA的原理图。[0〇12]【图3】为磁球(a)，纳米金包覆的磁球(b)，在(b)基础上纳米金的生长(c)，二茂铁标记的磁性纳米复合物(d)的扫描电镜图。[〇〇13]【图4】曲线a和b分别为miRNA浓度为0.1 nM和0.1 pM时二茂铁标记的磁性纳米复合物的循环伏安图；曲线c为miRNA不存在时的循环伏安图。扫速为0.1 V/s，箭头为扫描方向。【具体实施方式】[〇〇14]为了方便本领域的生产人员便于理解，本发明提供了一种二茂铁标记的磁性纳米复合物制备方法的【具体实施方式】。
[0015]实施例1二茂铁标记的磁性纳米复合物制备，其过程包括以下流程:第一步，生物素修饰的发夹型DNA探针在MB-AuNPs表面的固定MB-AuNPs中加入20此，5虚的发夹型DNA探针，常温震荡5小时，磁分离;50此，0.1 mM疏基己醇封闭30分钟，磁分离;50 yL，1%牛血清白蛋白封闭1 h，磁分离备用。
[0016]第二步，miRNA的杂交以及二茂铁覆盖的纳米金-亲和素复合物的固定发夹型DNA探针修饰的MB-AuNPs中加入100此，1 nM的miRNA，室温震荡3 h，通过磁分离将未反应的miRNA分离。加入10 yL二茂铁覆盖的纳米金/亲和素复合物，震荡1 h，超纯水清洗，磁分离。
[0017]所制备的二茂铁标记的磁性纳米复合物与裸磁球、磁球上沉积金以及磁球上进一步生长金的扫描电镜图和能谱图见附图3。
【主权项】
1.二茂铁标记的磁性纳米复合物的制备并用于miRNA的检测，其特征在于以下步骤:1)通过震荡孵育5 h将发夹型DNA探针固定于纳米金包裹的磁球表面；2)将1 nM的 miRNA和5 yL上述磁球混合震荡3 h后，miRNA与发夹型DNA探针的环状部分杂交，使得发夹 结构打开，随后将二茂铁覆盖的纳米金/亲和素复合物衍生到磁球表面;3)将上述复合物收 集到磁性电极表面，通过测定二茂铁的电化学响应对miRNA定量。
【文档编号】C12Q1/68GK105950711SQ201610246575
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】王建秀, 卢知轩, 衣馨瑶, 王璟芮
【申请人】中南大学