检测δ42pd1的方法、引物及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种引物对，所述引物对的扩增产物和/或扩增量能区分Δ42PD1和PD?1序列。本发明还提供了所述的引物对在制备检测Δ42PD1的产品中的应用。经实验证明，本发明的引物对特异性好、灵敏度高、检测时间短和适用范围广，且基于该引物对建立的Δ42PD1的检测方法，可灵敏、准确、简便和快速的检测Δ42PD1的存在和/或含量，且可对Δ42PD1与PD?1序列进行高度区分。
【专利说明】
检测Δ 42PD1的方法、引物及试剂盒
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及检测A 42TO1的引物、试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 细胞程序性细胞死亡受体1 (programmed cell death 1，Ρ?-1 )，又名CD279，属于 ⑶28分子家族，表达于激活的Τ细胞，ΝΚΤ细胞，Β细胞和巨噬细胞表面Η)-1有两个配体，PD-L1 (又名CD274或者B7-H1)和H)-L2(又名CD273或者B7-DC)，二者都是B7家族成员。研究结果 表明，PD-1/ro-L通路(包括ro-1/PD-Ll和ro-l/PD-L2)具有免疫抑制功能。
[0003] 在研究中国人群PD-1分子的基因多态性时首次发现了一种全新的PD-1基因的 mRNA选择性剪接转录本。与全长ro-lmRNA相比，该新型转录本框内缺失了外显子2起始端的 42个碱基(ACT CCC CAG ACA GGC CCT GGA ACC CCC CCA CCT TCT CCC CAG)，该段碱基编 码ro-Ι胞外区的14个氨基酸(DSPDRPWNPPTFFP)。因此，该新型ro-Ι基因的选择性剪接转录 本被命名为A 42PD1。研究发现，常用的商业化的PD-1的单克隆抗体（EH12.2H7，MIH4， EH12.1，J110等）不能识别Δ 42PD1，提示14个氨基酸的缺失使Δ 42PD1的结构发生显著变 化。此外，A42PD1也不能与Η)-1的配体(PD-L1和TO-L2)相结合。以上结果表明，A42PD1与 Η)-1具有不同的结构。进一步研究发现，△ 42PD1可诱导人外周血单个核细胞和树突状细胞 分泌TNF-a，IL-6和IL-Ιβ等前炎性细胞因子。此外，在小鼠体内Δ42ΗΗ可作为分子佐剂，显 著增强HIV Gag p24DNA疫苗诱导的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，这些结果都提示 Δ 42TO1可能具有重要的免疫调节功能。
[0004] 然而，Δ42ΗΗ与ro-Ι序列的高度一致性，显著增加了开发特异性检测该基因转录 水平的技术手段，限制了对该新发现免疫调节分子的研究和应用。
[0005] 然而，Δ42ΗΗ与Η)-1序列的高度一致性，显著增加了开发特异性检测该基因转录 水平的技术手段，限制了对该新发现免疫调节分子的研究和应用。目前对基因转录水平的 常用检测方法包括普通PCR和qPCR等。PCR技术是终点法分析，需要PCR后的凝胶电泳分析结 果，耗时较长，使用的染料(如EB等)具有致癌性，且其检测灵敏度较低。qPCR又分为探针法 和SYBR Green I法，二者均无需电泳分析，且灵敏度高，可定量。但是探针法需要使用较为 昂贵的特异性探针，成本较高，不利于大规模使用;而SYBR Green I法虽无需为使用较为昂 贵的探针而被广泛使用，但其所用引物的特异性和灵敏性则成为设计的关键。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、简便和快速的检测A42PD1的方 法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测时间短和适用范围广的引物对 和含有该引物对的试剂盒及其应用。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0008] 本发明一方面公开了一种用于检测A42PD1的引物对，所述引物对的扩增产物和/ 或扩增量能区分A 42TO1和Η)-1序列。
[0009] 在一优选例中，检测A42PD1的引物对的两条引物序列均与A42PD1完全配对，且 其中一条引物序列在与ro-ι序列配对时被ro-i序列中形成的Δ42ΗΗ的剪接位点所隔断。
[0010] 在一优选例中，在剪接位点所隔断的引物序列，隔断后分为引物的上游区域和引 物的下游区域，所述上游区域的碱基与下游区域的碱基比为1:4~4:1。
[0011]在一优选例中，检测Δ42ΗΗ的引物对中的一条序列包含SEQ ID N0:1所示的核苷 酸序列。
[0012] 在一优选例中，另一条引物序列包含SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
[0013] 在一优选例中，所述的区分所用的方法为荧光定量PCR方法。
[0014]在一优选例中，所述的区分所用的方法为荧光定量PCR SYBR Green I染料法。同 时区分方法不局限于荧光定量PCR方法，区分方法还包括芯片杂交、测序、凝胶电泳等方法。
[0015] 本发明第二方面公开了上面所述引物对在制备检测Δ42ΗΗ的产品中的应用。
[0016] 在一优选例中，所述检测Δ 42TO1的产品包括PCR扩增试剂。
[0017] 在一优选例中，所述PCR扩增试剂为荧光定量PCR试剂。
[0018]本发明第三方面公开了一种试剂盒，包括上面所述的引物对。
[0019] 在一优选例中，试剂盒还包括PCR扩增试剂。
[0020] 在一优选例中，所述PCR扩增试剂为荧光定量PCR试剂。
[0021] 在一优选例中，所述荧光定量PCR试剂包括来自TaKaRa公司的货号为RR820A的 SYBR?PremiX Ex Taq?II试剂盒所包含的试剂。
[0022] 在一优选例中，试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
[0023] 在一优选例中，试剂盒还包括RNA提取试剂。
[0024] 在一优选例中，所述RNA提取试剂包括来自TIANGEN公司的货号为Cat.#DP419的 RNAsimple Totle RNA Kit总RNA提取试剂盒所包含的试剂。
[0025]在一优选例中，试剂盒还包括逆转录试剂。
[0026] 在一优选例中，所述逆转录试剂包括来自TaKaRa公司的货号为Code No.6110A的 逆转录试剂盒1st Strand cDNA Synthesis Kit所包含的试剂。
[0027]本发明第四方面公开了上面所述的试剂盒在检测Λ42Η)1中的应用。
[0028]本发明第五方面公开了一种检测待测样品中A42PD1的方法，包括使用上面所述 的引物对的步骤。
[0029]在一优选例中，检测待测样品中Δ 42TO1的方法，所述待测样品为包含有DNA和/或 RNA的血液、细胞或组织，或为质粒，或为DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA、 mRNA或cDNA片段的试剂；
[0030] 在一优选例中，当待测样品为DNA、cDNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA或cDNA片 段的试剂，或为质粒时，将其直接作为模板与所述引物对进行实时荧光PCR反应;然后判断 待测样品中A 42TO1的存在和/或含量。
[0031] 在一优选例中，当待测样品为含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为mRNA，或 为含有mRNA的试剂时，将其转化为DNA、cDNA或cDNA片段再进行实时荧光PCR反应检测;然后 判断待测样品中A42TO1的存在和/或含量。
[0032] 在一优选例中，所述待测样品为血液时，还包括对血液的总RNA提取的步骤以及对 总RNA进行逆转录的步骤。
[0033] 在一优选例中，检测待测样品中A42PD1的方法，利用荧光PCR反应检测所用的反 应体系如下： SYBR? Premix Ex Taq? II 12,5 μL ROX Reference Dye II 0,5 μL
[0034] 弓丨物对（上下游引物浓度分别为ΙΟμΜ)上下游引物均为IpL MA、cDNA或eDNA片段 拷贝数为1><10%iL ddH.O 9 μL.
[0035] 在一优选例中，上面所述的荧光PCR反应的程序如下：98°C预变性1分钟;98°C变性 1 Os、60 °C退火30s，40个循环。
[0036]本发明的有益效果包括：
[0037] (1)本发明针对Δ42Η)1设计的扩增引物特异性好、灵敏度高、检测时间短和适用 范围广。
[0038] (2)本发明建立的△ 42PD1的检测方法，可灵敏、准确、简便和快速的定性和/或定 量的检测A 42PD1的存在和/或含量，对△ 42PD1与Η)-1序列可进行高度区分。
【附图说明】
[0039]图1 Λ 42PD1与PD-1的有差异部分的基因序列对比，以及Δ 42PD1上游引物的序列 (SEQ ID Ν0.1)在Δ42ΗΗ与Η)-1对应的位置的示意图。
[0040] 图2 SEQ ID NO.USEQ ID从).2引物对检测&42^)1的特异性分析结果示意图。 [0041 ] 图3 SEQ ID NO.USEQ ID从).2引物对检测&42^)1的灵敏性分析结果示意图。 [0042] 图4 SEQ ID N0.1、SEQ ID勵.2引物对定量检测&42?01的(^值与&42?01拷贝数 的线性回归分析。
[0043] 图5每ml人外周血Δ 42roimRNA拷贝数检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0044] 除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
[0045] 下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅 是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领 域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂 商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0046] 实施例1
[0047]本实施例提供了一种检测人△ 42TO1转录水平的引物对及其应用。
[0048]引物对的设计:上游引物(SEQ ID NO. 1)包含20个寡核苷酸，其中前16个核苷酸位 于Δ42ΗΗ的第一个外显子上，后4个位于第二个外显子上，该设计可以排除基因组PD-1DNA 对检测结果的干扰;此外在ro-i全长转录本上，上游引物的前16个寡核苷酸和后4个寡核苷 酸所对应的核酸序列之间存在42个碱基(如图1所示），以排除ro-lmRNA对检测结果的干扰， 即上游引物序列跨越PD-1形成Δ 42PD1的剪接位点，是该对引物可以特异性检测Δ 42PDlmRNA的关键所在。
[0049] 为得到灵敏度和特异性最好的引物，我们最初设计了至少5条跨越剪接位点的上 游引物，实验结果发现，尽管这至少5条上游引物的检测敏感性相当，但是上游引物(SEQ ID NO. 1)的特异性显著优于其它4条引物。
[0050] 引物对具体序列如下：
[0051] 上游引物F:5'-CCAGGATGGTTCTTAGCCCT-3'（SEQ ID N0.1)，
[0052] 下游引物R:5'-GCTTGTCCGTCTGGTTGCTG-3'（SEQIDN0·2)。
[0053] 上述引物对由深圳华大基因科技有限公司合成。
[0054] 上述PCR引物可应用于制备检测Δ 42PD1的产品，以对Δ 42TO1与PD-1序列可进行 高度区分;所述检测A 42TO1的产品还可以包括PCR扩增试剂;所述PCR扩增试剂优选为荧光 定量PCR试剂。
[0055] 实施例2
[0056] 本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：
[0057] (1)上游引物F和下游引物R(来自实施例1);
[0058] (2)来自TaKaRa公司的货号为RR820A的SYBR?Premix Ex Taq?II试剂盒所包含 的试剂。
[0059] 实验证明，上述SYBR?Premix Ex Taq?II试剂盒、上游引物F和下游引物R的联 合使用，具有省时、经济、可重复性高、高灵敏度和特异性的特点，效果更加优越。
[0060] 上述试剂盒可应用于检测Δ 42TO1上，能够高度区分Δ 42TO1与ro-Ι序列。
[0061 ] 实施例3
[0062]本实施例提供了一种检测待测样品中A42PD1的方法，例如检测待测样品中Δ 42PD1的存在和/或含量，该方法使用了实施例1的RPA引物和实施例2的试剂盒。
[0063]上述待测样品可以为包含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为质粒，或为 DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段的试剂。当待测样品为 DNA、cDNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA或cDNA片段的试剂，或为质粒时，将其直接作为模 板与所述引物对进行实时荧光PCR反应;然后判断待测样品中△ 42TO1的存在和/或含量； [0064]当待测样品为含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为mRNA，或为含有mRNA的 试剂时，将其转化为DNA、cDNA或cDNA片段再进行实时荧光PCR反应检测;然后判断待测样品 中Δ 42H) 1的存在和/或含量。例如当待测样品为血液时，还需要对血液的总RNA提取以及对 总RNA进行逆转录，以得到cDNA样品，总之待测样品本身为DNA、cDNA或cDNA片段，或为含有 DNA、cDNA或cDNA片段的试剂，或为质粒时不作处理，其余均需处理成DNA、cDNA或cDNA片段 样品。
[0065]上述方法包括如下步骤：
[0066] 1.实时荧光PCR反应
[0067] 按照SYBRK'Premix Ex Taq?II(Code No.RR820A，TaKaRa)试剂盒的说明配制反 应液：取 12.5yL SYBR Premix Ex Taq II、lyL上游引物F(10yM)、lyL下游引物R(10yM)、0.5 yL ROX Reference Dye II、lyL DNA或cDNA或cDNA片段（拷贝数为 101 至 109)、9yL超纯水加 入至0.2mL PCR反应管中，以超纯水为阴性对照样品，振荡混匀后瞬时离心数秒。将反应管 置于ViiA?7实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)上进行实时荧光PCR扩增和检测，所 述实时荧光PCR扩增的程序如下:98 °C 1分钟;98 °C 10秒，60 °C 30秒，40个循环。如表1所示。 [0068]表 1
[0070] 2.判断待测样品中Δ 42TO1的存在和/或含量
[0071]在每个循环的60°C阶段结束后收集荧光信号并进行熔融曲线的分析，结果为阳性 (Ct彡33)代表待测样品中含有Δ 42PD1，结果为阴性（Ct > 33)则代表待测样品中未含Δ 42HH。
[0072] 当需要判断待测样品中Δ42Η)1的含量时，则在上述步骤1中还需设定已知拷贝数 的阳性对照。
[0073] 实施例4
[0074]本实施例对实施例1的引物对进行了特异性验证，具体包括如下步骤：
[0075] 1.样品制备
[0076] 将Δ 42roi和ro-Ι全长cDNA(其中ro-Ι来源于Genbank的ID NM_005018)插入载体 pVAXl载体（货号V260-20,美国Invitrogen公司）中，构建真核表达质粒pVAX-A42PDl和 pVAX-PDl。采用质粒中量提取试剂盒(货号D0018,上海碧云天生物技术有限公司），并按照 试剂盒说明制备质粒PVAX- Δ 42PD1和pVAX-PD1。用微量紫外分光光度计分别测定质粒 pVAX- Δ 42PD1和pVAX-PD 1的浓度，通过其分子量计算出拷贝数，然后制备拷贝数为1 X 109/ yL的样品。
[0077] 2.PCR 反应
[0078] 按照SYBRK'Premix Ex Taq?II(Code No.RR820A，TaKaRa)试剂盒的说明配制反 应液：取 12.5yL SYBR Premix Ex Taq II、lyL上游引物F(10yM)、lyL下游引物R(10yM)、0.5 yL ROX Reference Dye II、lyL样品、9yL超纯水加入至0.2mL PCR反应管中，以超纯水为阴 性对照样品，振荡混匀后瞬时离心数秒。将反应管置于ViiA?7实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)上进行实时荧光PCR扩增和检测，所述实时荧光PCR扩增的程序如下：98°C1分 钟;98 °C 10秒，60 °C 30秒，40个循环。如表1所示。
[0079] 表 1
[0081] 3.结果：
[0082] 检测结果如图2所示，图2表明ΙΟ9拷贝数的Δ 42TO1样品的Ct值为10.065，ΙΟ9拷贝 数的H)1样品的Ct值为31.572,阴性对照检测不到Ct值。此实验结果说明用该引物对扩增Δ 42PD1的效率约为扩增Η)-1的效率的221(231·572^^ 65)倍，具有非常强的特异性。
[0083] 实施例5
[0084] 本实施例对实施例1的引物对进行了灵敏性验证，具体包括如下步骤：
[0085] 1.样品制备
[0086]用微量紫外分光光度计分别测定质粒pVAX- △ 42Η)1(质粒的制备见实施例4)的浓 度，通过其分子量计算出拷贝数，然后依次制备10倍梯度稀释至个位拷贝数的样品，共计7 个梯度，拷贝数为：1X 1〇6至1X 10Q/yL。
[0087] 2.PCR 反应
[0088] 按照SY'BRK Premix Ex Taq?II(Code No.RR820A，TaKaRa)试剂盒的说明配制反 应液：取 12.5yL SYBR Premix Ex Taq II、lyL上游引物F(10yM)、lyL下游引物R(10yM)、0.5 yL ROX Reference DyeII、lyL样品、9yL超纯水加入至0.2mL PCR反应管中，以超纯水为阴 性对照样品，振荡混匀后瞬时离心数秒。将反应管置于ViiA?7实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)上进行实时荧光PCR扩增和检测，所述实时荧光PCR扩增的程序如下：98°C1分 钟;98 °C 10秒，60 °C 30秒，40个循环。如表2所示。
[0089] 表2
[0091] 3.结果:检测结果如图3所示，图3表明用所述引物的qPCR检测A42PD1的检测下线 为1(10,拷贝，而阴性对照检测不到Ct值。且Ct值与A42PD1拷贝数之间具有非常强的线性 关系(P〈0.0001，r = 0.999，图4)，表明用本发明的引物对的qPCR检测Δ 42PD1的灵敏性非常 强。
[0092] 实施例6
[0093]本实施例提供了实施例1中提供的引物对定量检测人外周血A42roimRNA逆转录 后cDNA的拷贝数。
[0094] 1.样品制备
[0095] 取24名健康人静脉抗凝血(EDTA抗凝）250yL，用RNAsimple Totle RNA Kit总RNA 提取试剂盒(Cat. #DP419，TIANGEN)，参考试剂盒说明书，提取血液细胞总RNA，溶于50yL无 RNA酶的超纯水中。取12.5yL总RNA，用逆转录试剂盒PrimeScript?lst Strand cDNA Synthesis Kit(Code No.6110A，TaRaKa)，参考试剂盒说明书，进行逆转录合成20yL cDNA。 阳性对照的标准品制备如实施例4所述的样品制备。
[0096] 2.PCR 反应
[0097] 按照SYBRK Premix Ex Taq?II(Code No.RR820A，TaKaRa)试剂盒的说明配制反 应液：取 12.5yL SYBR Premix Ex Taq II、lyL上游引物F(10yM)、lyL下游引物R(10yM)、0.5 yL ROX Reference Dye II、lyL cDNA模板（由健康人抗凝血制备）、9yL超纯水加入至0.2mL PCR反应管中；以超纯水为阴性对照模板，用标准品平行做阳性对照实验。振荡混匀后瞬时 离心数秒。将反应管置于ViiA?7实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)上进行实时荧 光PCR扩增和检测，所述实时荧光PCR扩增的程序如表2所示。
[0098] 3.结果
[0099]检测结果如图5所示，图5表明24例健康成年人外周血中A42PDlcDNA拷贝数平均 值为7.92 X 107，最小和最大值分别为2.85 X 106和1.91 X 108。
【主权项】
1. 一种用于检测A 42PD1的引物对，其特征在于，所述引物对的扩增产物和/或扩增量 能区分Δ 42TO1和Η)-1序列； 任选的，所述引物对的两条引物序列均与A 42TO1完全配对，且其中一条引物序列在与 ro-Ι序列配对时被ro-Ι序列中形成的Δ 42TO1的剪接位点所隔断； 任选的，在剪接位点所隔断的引物序列，隔断后分为引物的上游区域和引物的下游区 域，所述上游区域的碱基与下游区域的碱基比为1:4~4:1。2. 根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，引物对中的一条序列包含SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列； 任选的，另一条序列包含SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； 任选的，所述的区分所用的方法为荧光定量PCR方法； 任选的，所述的区分所用的方法为荧光定量PCR SYBR Green I染料法。3. 根据权利要求1或2所述的引物对在制备检测A42PD1的产品中的应用； 任选的，所述检测A 42PD1的产品还包括PCR扩增试剂； 任选的，所述PCR扩增试剂为荧光定量PCR试剂。4. 一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物对。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:还包括PCR扩增试剂； 任选的，所述PCR扩增试剂为荧光定量PCR试剂； 任选的，所述荧光定量PCR试剂包括来自TaKaRa公司的货号为RR820A的S YBR?Premix Ex Taq?II试剂盒所包含的试剂； 任选的，还包括阳性对照和阴性对照； 任选的，还包括RNA提取试剂； 任选的，所述RNA提取试剂包括来自TIANGEN公司的货号为Cat.#DP419的RNAsimple Totle RNA Kit总RNA提取试剂盒所包含的试剂； 任选的，还包括逆转录试剂； 任选的，所述逆转录试剂包括来自TaKaRa公司的货号为Code No . 6110A的逆转录试剂 盒.Pfim6Scnpt?lst Strand cDNA Synthesis Kit所包含的试剂。6. 权利要求5所述的试剂盒在检测△ 42PD1中的应用。7. -种检测待测样品中A42PD1的方法，其特征在于，包括使用权利要求1或2所述的引 物对的步骤。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述待测样品为包含有DNA和/或RNA的血 液、细胞或组织，或为质粒，或为DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA、mRNA或 cDNA片段的试剂； 任选的，当待测样品为DNA、cDNA或cDNA片段，或为含有DNA、cDNA或cDNA片段的试剂，或 为质粒时，将其直接作为模板与所述引物对进行实时荧光PCR反应;然后判断待测样品中△ 42PD1的存在和/或含量； 任选的，当待测样品为含有DNA和/或RNA的血液、细胞或组织，或为mRNA，或为含有mRNA 的试剂时，将其转化为DNA、cDNA或cDNA片段再进行实时荧光PCR反应检测;然后判断待测样 品中△ 42TO1的存在和/或含量； 任选的，所述待测样品为血液时，还包括对血液的总RNA提取的步骤以及对总RNA进行 逆转录的步骤。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于： 所述实时荧光PCR反应的反应体系如下： SYBR? Premix Ex Taq? II 12.5 μL. ROX Reference Dye II 0.5 pL 引物对 上下游引物浓度分别为1 ΟμΜ，上下游引物均 Λ/1 DNA、cdDNA或cDNA片段 拷贝数为1x10%iL ddH20 9. pL。.10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于:所述实时荧光PCR反应的程序如下：98°C 预变性1分钟;98 °C变性10s、60 °C退火30s，40个循环。
【文档编号】C12N15/11GK105950715SQ201610270351
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】程林, 唐娴, 王辉, 陈志伟
【申请人】深圳市第三人民医院