一种与水稻抗褐飞虱相关的snp位点及应用
【专利摘要】本发明公开了一种与水稻抗褐飞虱相关的 SNP 位点及应用。所述水稻单核苷酸多态性SNP 位点，分别定位于水稻BGIOSGA015836基因启动子上游?641bp 、?140bp和?43bp的位置，其中BGIOSGA015836基因启动子上游?641bp的碱基突变为T，基因启动子上游?140bp的碱基突变为G，基因启动子上游?43bp的碱基突变为G。本发明发现水稻BGIOSGA015836基因上游的三个多态性位点与水稻抗虫性表型存在紧密关联，通过这3个多态性位点的突变，可以引起水稻抗褐飞虱BGIOSGA015836基因的高表达，从而使得水稻表现出抗褐飞虱的效果。
【专利说明】
一种与水稻抗褐飞虱相关的SNP位点及应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种与水稻抗褐飞虱相关的SNP位点 及应用。
【背景技术】
[0002] 随着人类进入后基因组时代，全面开展功能基因组研究已成为生命科学研究的前 沿领域。由于水稻的转基因技术相对容易，并且与其它禾本科作物基因组具有共线性，因而 被视做模式植物。目前，水稻基因组精细遗传图和物理图谱已完成，进一步对水稻功能基因 进行研究，对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。
[0003] 目前世界上有超过一半的人以水稻为主食。粮食安全问题，是全世界人民面临的 挑战。20世纪50、60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育两次科技革命使水稻产量大 幅度提高。但近几十年来水稻受到大面积的病虫危害，使水稻生产受到威胁。褐飞虱是我国 水稻生产中的主要害虫，其成虫和若虫以口针刺吸水稻汁液，引起黄叶或枯死，导致减产或 绝收。据中国农业年鉴记载，褐飞虱虫害在1966、1969、1973、1977、1983和2003年全国性大 发生，1987、1991、2005、2006和2007年全国性特大发生，危害面积达到水稻总面积的50%以 上，给我国水稻生产造成了严重的损失。且褐飞虱的危害多发生在水稻成熟灌浆期，此时大 量使用杀虫剂，对稻谷的污染也是非常严重的问题。
[0004] 利用抗褐飞虱基因培育抗虫水稻品种是褐飞虱综合防治中最为经济有效的方法， 而遗传标记方法是培育抗性品种的重要技术。随着分子生物学和遗传学的发展，已涌现出 很多种遗传标记，如AFLP、RAPD、SSR、SNP等标记，其中，SNP标记因具有分布广泛、适宜高通 量自动化分析、遗传稳定等特点，日益成为遗传育种研究中首选的遗传标记。若这些遗传标 记能与生产性状相关联在一起，即可实现从DNA水平上进行选择育种，克服传统方法中人为 主观因素的干扰，提高选择的准确性，并且可在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选出优 良的后备亲本，从而缩短育种周期，加快育种进程。由此发现与水稻抗褐飞虱有关的基因及 其SNP位点，大大提高筛选效果。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种与水稻抗褐飞虱相关的SNP位点及其应用。
[0006] 本发明所采取的技术方案是：
[0007] 水稻单核苷酸多态性SNP位点，分别定位于水稻BGI0SGA015836基因启动子上游序 列第-641个、-140个和-43个碱基处，其中BGI0SGA015836基因启动子上游第-641个碱基突 变为T，基因启动子上游第-140个碱基突变为G，基因启动子上游第-43个碱基突变为G。
[0008] 优选的，所述的水稻单核苷酸多态性SNP位点在筛选抗褐飞虱水稻品种中的应用。
[0009] 一种提高水稻抗褐飞虱的方法，将水稻BGI0SGA015836基因启动子上游第-641个 碱基突变为T，和/或位于基因启动子上游第-140个碱基突变为G，和/或位于基因启动子上 游第-43个碱基突变为G。
[0010] -种抗褐飞虱水稻品种的鉴定方法，包括如下步骤:提取水稻基因组DNA，以提取 得到的DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，将得到PCR产物测序鉴定，若含有上述所述的单 核苷酸多态性SNP位点，则判定为抗褐飞虱水稻品种。
[0011 ]优选的，所述引物，其核苷酸序列如下所示：
[0014]因为基因序列中开始RNA链合成的第一个核苷酸所对应的碱基记为+1，此碱基上 游的序列记为负数，下游的序列记为正数。抗虫水稻品种BG1222的BGI0SGA015836基因的上 游-750~-lbp的序列如SEQ ID N0:3所示，感虫水稻品种TNl的BGI0SGA015836基因的上游-750~-lbp的序列如SEQIDN0 :4所示。
[0015]本发明的有益效果是：
[0016]本发明发现水稻BGI0SGA015836基因上游的三个多态性位点与水稻抗虫性表型存 在紧密关联，通过这3个多态性位点的突变，可以引起水稻抗褐飞虱BGI0SGA015836基因的 高表达，从而使得水稻表现出抗褐飞虱的效果。
[0017] 本发明还公开了抗褐飞虱水稻品种的鉴定方法，通过提取水稻基因组DNA，以提取 得到的DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，将得到PCR产物测序鉴定，若含有上述的单核苷 酸多态性SNP位点，则判定为抗褐飞虱水稻品种。
【附图说明】
[0018] 图1为受到褐飞虱吸食后的水稻品种BG1222和TN1的BGI0SGA015836表达量时间序 列变化；
[0019] 图2为杂交F2后代中BGI0SGA015836的表达量与水稻抗虫性分数值的关系。
【具体实施方式】
[0020] 褐飞虱是危害水稻生产的主要害虫，近年来由于褐飞虱生物型发生变异及产生抗 药性等原因，褐飞虱灾害发生日趋严重。生产实践证明，利用抗性品种是最经济、安全而有 效的措施。按照"标准苗盘鉴定法"对BG1222进行了多年的苗期抗虫级别检测，发现其对褐 飞虱具有稳定高抗性，且BG1222对白叶枯病也具有较高的抗性，因此在育种上具有较高的 利用价值。
[0021] TN1是国际公认不含任何抗虫基因的感虫水稻品种。
[0022] 发明人通过对褐飞虱具有稳定抗性的水稻品种BG1222和感虫水稻品种TN1的研究 找到水稻抗褐飞虱基因 BGI0SGA015836。抗虫品种与感虫品种相比，BGI0SGA015836的基因 表达量存在显著差异。在抗虫品种BG1222中，BGI0SGA015836的表达量比感虫水稻品种TN1 的表达量高十倍以上。无论是否受到褐飞虱吸食BG1222中的BGI0SGA015836的表达量都远 高于TN1的表达量。
[0023] 此外发明人还对抗虫水稻品种BG1222和感虫水稻品种TN1中抗褐飞虱基因 BGI0SGA015836的上游序列进行分析，发现3个多态性SNP位点。
[0024] 本发明研发过程中所用的水稻品种BG1222和感虫水稻品种TN1均为纯合子。
[0025]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0026] 实施例1抗虫品种与感虫品种相比BGI0SGA015836的基因表达量存在显著差异
[0027] 一.水稻基因 RNA提取
[0028] 1)样本分为组织以及细胞:细胞直接收集;液氮研磨组织样本，加入500ul含4%β-巯基乙醇的CTAB提取液，65度水浴30min;
[0029] 2)然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀后10,000g离心10min;
[0030] 3)加入等体积的异丙醇，-20度放置lh，12,000g离心10min，弃上清；
[0031] 4)加入lOOOul Trizol重悬沉淀，然后加入200μ1氯仿，用手剧烈振荡15秒，室温静 置5min;
[0032] 5)4°C下，10，000g离心3min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个 新的RNase free EP管；
[0033] 6)加入0.5倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；
[0034] 7)4°C下，12,000g离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，去上清；
[0035] 8)加入lml 75%乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，去上清；
[0036] 9)室温晾干或真空干燥，加入60μ1 DEPC水溶解沉淀。
[0037] 二.去基因组
[0038] 使用RNase-free的DNase I，按以下体系配置反应液：
[0040] 37°C 消化 30min，65°C 灭活 10min。
[0041] 然后按以下步骤操作：
[0042] 1)加入等体积的苯酚，上下颠倒混匀后10，OOOrpm，离心5min，取上清；
[0043] 2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀后10，OOOrpm，离心10min，取上清；
[0044] 3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，-20 °C静置15min;
[0045] 4)4°C下，10，000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；
[0046] 5)用75%乙醇洗涤两次，超净台风干；
[0047] 6)加入10μ1 DEPC水溶解沉淀。
[0048]三.纯度检测及电泳检测
[0049] 纯度检测：取2μ1 RNA样品60倍稀释，在微量分光光度计k2800(北京凯奥）上测定 0D值，0D26Q/0D28()的比值大于1 · 8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。
[0050] 四.逆转录
[0051 ] 1)在PCR管中加入模板RNA、引物混合物，总量12ul。反应体系如下：
[0053] 70°C保温lOmin后迅速在冰上冷却2min。
[0054] 2)在该PCR管中加入下列试剂
[0057] 将上述20μ1反应溶液42°C保温60min; 72°C保温15mn; -20°C保存备用。
[0058] 五.定量
[0059] 利用下列引物对进行BGIOSGAO15836的基因表达量的分析，其碱基序列如下所示。
[0060] RE-f：CCAACAGCTCTGCGCTCATC(SEQ ID NO：5),
[0061] RE-r：ACTCCAGCCAAAAGAAACCCA(SEQ ID N0：6)〇
[0062] 1)反应体系：cDNA稀释3倍
[0064] 2)反应条件：使用 ViiA7software
[0065] 95〇C30S；
[0066] 95°C3S，60°C34S(收集荧光信号）；45个循环。
[0067]融解曲线分析:温度60°C_95°C，每分钟读1次。
[0068] 结果见图1。
[0069]图1中横坐标为水稻受到褐飞虱吸食的小时数，纵坐标为BGI0SGA015836的相对表 达量：以在0小时(h)，TNl中基因 BGI0SGA015836的表达量标准化为数值1，其它时间与材料 的基因表达量都是基于此，由于表达量的差异值有几十倍之多，所以将表达量数值取以10 为底的对数得到最终相对表达量。
[0070]从图1可以看出受到褐飞虱吸食的情况下，植株受到外来刺激，BGI0SGA015836的 表达量会提高，说明该基因在BG1222和TN1中既具有组成型(没有受到外界刺激也有表达差 异）表达差异，也具有诱导型（受到外界刺激引起表达差异）表达差异。在不同时间点， BGI0SGA015836基因在BG1222的表达量都会显著高于TN1的表达量。
[0071] 图1结果表明在抗虫品种BG1222中BGI0SGA015836的表达量比感虫水稻品种TN1的 表达量高十倍以上。无论是否受到褐飞虱吸食，BG1222中的BGI0SGA015836的表达量都远高 于TN1的表达量。
[0072] 实施例2BGI0SGA015836的基因的克隆，以及多肽分析
[0073] 分别对抗虫品种BG1222以及感虫品种TN1的BGI0SGA015836基因进行克隆，进行分 析。
[0074] 其中抗虫品种BG1222中的BGI0SGA015836基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示 (包括外显子和内含子），感虫品种TN1中的BGI0SGA015836基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所不(包括外显子和内含子）。
[0075] 其中抗虫品种BG1222中BGI0SGA015836基因的cDNA序列如SEQIDN0:9所示 ；而感 虫品种TN1中BGI0SGA015836基因的cDNA序列如SEQ ID如：10所示。上述〇0嫩有5处碱基有 所不同，但是编码得到的水稻抗褐飞虱的多肽序列是相同的，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0076] 实施例3抗虫品种与感虫品种相比BGI0SGA015836上游多态性位点的检测
[0077] 一、利用CTAB抽提法提取水稻基因组DNA，或利用商品化的试剂盒来提取水稻基因 组。
[0078]二、PCR
[0079]利用下列引物对进行BGI0SGA015836上游多态性位点的检测，其碱基序列如下所 不。
[0082] 反应体系如下：
[0084] PCR反应程序为：941€4111丨11;94 1€5〇86(3,551€3〇86(3,721€5〇6(3,35个循环。72 1€ lOmin。将PCR反应产物纯化后测序，根据测序结果的序列判断其基因多态性位点类型。 [0085]因为基因序列中开始RNA链合成的第一个核苷酸所对应的碱基记为+1，此碱基上 游的序列记为负数，下游的序列记为正数。
[0086] 测序后分析发现:抗虫品种BG1222和感虫品种TN1中BGI0SGA015836的上游序列中 存在3个SNP多态性位点与水稻抗虫性表型存在紧密关联，结果见表1。
[0087] 表1SNP的分布
[0089] 表1中，抗虫品种BG1222与感虫品种TN1相比，位于BGI0SGA015836基因启动子上游 第-641bp位(也就是第-641个碱基处）的碱基C突变为T，位于BGI0SGA015836基因启动子上 游第-140bp(也就是第-140个碱基处）的碱基T突变成G，以及位于BGI0SGA015836基因启动 子上游第-43bp (也就是第-43个碱基处）的碱基A突变成G。
[0090] 抗虫水稻品种BG1222的BGI0SGA015836基因的上游-750~-lbp的序列如SEQ ID N0:3所示，感虫水稻品种TNl的BGI0SGA015836基因的上游-750~-lbp的序列如SEQIDN0 : 4所示。
[0091] 虽然上述两个品种BGI0SGA015836基因的上游序列还存在其他碱基的不同，但是， 有且只有这3个SNP多态性位点与水稻抗虫性表型存在紧密关联。而且这3个SNP位点是位于 BGIOSGAO15836基因启动子的上游调控区域。
[0092] 实施例4抗虫品种与感虫品种进行杂交F2代
[0093] 通过BG1222与TN1的杂交建立F2后代群体，？2后代群体的样本n = 512。从中选取了 60个不同抗性分数值的个体检测，并对不同抗性级别表型的F2后代个体分别检测其 BGI0SGA015836的表达量，以确定BGI0SGA015836的表达量以及上游多态性位点与水稻抗虫 表型的相关性。
[0094] 结果见图2。
[0095] 图2结果表明：杂交F2后代验证表明BGI0SGA015836的表达量与水稻抗虫性成正相 关（表达量越高抗虫性越强）。后代中抗虫性越强，其抗性分数值（Grade)越小，相对应 BGI0SGA015836的表达量越高。抗性分数值(Grade)分为0，1，3，5，7，9;分数值越小代表其抗 虫性越强。
[0096]在?2后代群体，对不同抗性级别表型的F2后代个体检测BGI0SGA015836上游序列的 多态性位点。结果见表2。
[0097]表2SNP与水稻抗虫性表型的关联度
[0099]表2中，SNP index表示该位点的碱基类型与参考序列相比，与参考序列不同的碱 基类型的序列数量除以总共的序列数量的比值;如果SNP index是0表明该位点的碱基类型 与参考序列完全一样，如果SNP index是1表明该位点的碱基类型与参考序列完全不一样。 [0100] 表2以BG1222的序列为参考序列，RF2(F2中表现出有抗虫性的个体）的SNP基本与 BG1222相同，SF2(F2中表现出感虫性的个体）的SNP与BG1222完全不同。Delta_SNP index反 应该位点与表型的关联性，如果是0表明该位点与表型无相关性，如果越接近1表明该位点 与表型的相关性越强。
[0101] 从表2可知：杂交F2后代中，上述基因上游多态性位点（SNP)与水稻抗虫性表型存 在紧密关联。
[0102] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 水稻单核苷酸多态性SNP位点，分别定位于水稻BGI0SGA015836基因启动子上游序 列第-641个、-140个和-43个碱基处，其中BGI0SGA015836基因启动子上游第-641个碱基突 变为T，基因启动子上游第-140个碱基突变为G，基因启动子上游第-43个碱基突变为G。2. 权利要求1所述的水稻单核苷酸多态性SNP位点在筛选抗褐飞虱水稻品种中的应 用。3. -种提高水稻抗褐飞虱的方法，其特征在于:将水稻BGI0SGA015836基因启动子上游 第-641个碱基突变为T，和/或位于基因启动子上游第-140个碱基突变为G，和/或位于基因 启动子上游第-43个碱基突变为G。4. 一种抗褐飞虱水稻品种的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：提取水稻基因组 DNA，以提取得到的DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，将得到PCR产物测序鉴定，若含有 权利要求1所述的单核苷酸多态性SNP位点，则判定为抗褐飞虱水稻品种。5. 根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于:所述引物，其核苷酸序列如下所示： SNP-f：CAGTTCAACAGGCTGACT(SEQ ID NO：I), SNP-r：GGGATCAGAGAGGAAGAAATC(SEQ ID N0：2)〇
【文档编号】C12Q1/68GK105950722SQ201610289724
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】李怡峰, 肖汉祥, 张振飞, 李燕芳, 张扬
【申请人】广东省农业科学院植物保护研究所