用于人乳腺癌循环肿瘤dna检测的探针及其用图

用于人乳腺癌循环肿瘤dna检测的探针及其用图
【专利摘要】本发明公开了一种用于人乳腺癌循环肿瘤DNA检测的探针及其用途，属于疾病的诊断和防治领域。本发明设计了一种乳腺癌“selector”，它是由靶向乳腺癌相关基因突变区域的DNA片段组成。将乳腺癌患者循环肿瘤DNA(ctDNA)，用selector设计成的探针进行液相杂交捕获，高通量测序后，发现病人特异的癌症基因变异，并监测肿瘤负荷。与常规的检测手段相比，本发明具有非侵入性，且通量高、灵敏度和特异性好等特点，能更好地进行人乳腺癌的筛查和早期诊断，并应用于癌症的个体化治疗。
【专利说明】
用于人乳腺癌循环肿瘤DNA检测的探针及其用途
技术领域
[0001]本发明涉及一种用于诊断疾病的方法，特别涉及一种用于人乳腺癌循环肿瘤DNA 检测的方法，属于疾病的诊断与防治领域。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，全世界每年约有170万女性患乳腺癌， 52.2万死于乳腺癌。全球乳腺癌的发病率因地区环境、经济差异与生活习惯的不同而各不 相同。总体而言，西欧、北美等发达国家发病率较高，而亚洲、拉丁美洲和非洲的大部分地区 为低发区。从全球范围看，全世界每年乳腺癌的发病率以〇. 2%~8%的幅度上升，乳腺癌是 40~55岁女性的第一位死亡原因。自20世纪70年代末开始，乳腺癌的发病在全球范围内一 直位居女性恶性肿瘤的首位。在世界上我国虽属女性乳腺癌的低发地区，但近年来乳腺癌 的发病率明显增高。中国主要城市10年来乳腺癌发病率增长了 37 %，死亡率增长了38.9 %， 成为城市中死亡率增长最快的癌症，发病年龄也呈逐渐年轻化的趋势。尤其以上海、北京、 天津及沿海地区为我国乳腺癌的高发地区，已占我国女性恶性肿瘤发病率的首位。虽然国 外乳腺癌的发病率居高不下L但死亡率却不断下降，其原因不仅得益于近年来不断发展的 分子生物学技术和综合诊疗规范化水平的提高，更得益于女性乳腺癌筛查和早诊制度的建 立。
[0003] 目前国际上通行的乳腺癌检查法有6种：包括自查乳腺、临床体检、乳腺X线拍片、 乳腺超声检查、乳腺核磁共振检查、乳头溢液检查。其中，由于乳腺核磁共振检查设备要求 高，价格较高，耗时长，需静脉注射增强剂，因此不易推广。针刺细胞进行乳头溢液检查，由 于操作步骤繁琐、检出率很低等原因，一般不建议在人群筛查中应用。
[0004] 乳腺自检的最佳时期是月经来潮后第7~10天，此时雌激素对乳腺的影响最小，乳 腺处于相对静止状态，容易发现病变。但有资料表明通过这种手段，并不能提高乳腺癌的早 期诊断机率和降低病死率，因此也只能作为一种提高防癌意识的方法。
[0005] 钼靶X线是世界公认的检测早期乳腺癌的有效方法，尤其是数字化乳腺摄影，能够 清晰显示乳腺的各个层次的微细结构，特别是微细钙化。而微细钙化是X线诊断乳腺癌的重 要征象甚至是唯一征象。国外自20世纪60年代就开始使用乳腺X线做大规模的乳腺癌筛查。 乳腺X线筛查对40岁以上亚洲妇女准确性高。中国医学科学院肿瘤医院及协和医科大学开 展的乳腺癌筛查都将X线作为首选的临床筛查方法。但乳腺X线对年轻致密乳腺组织穿透力 差，故一般不建议对40岁以下、无明确乳腺癌高危因素或临床体检未发现异常的妇女进行 乳腺X线检查。乳腺X线在鉴别乳腺囊性和实性肿瘤方面有所欠缺;检查范围有一定的局限 性，常遗漏乳腺边缘和远端的病变;对萎瘪乳房的摄影效果较差。所以在我国应用钼靶摄片 作为乳腺癌筛查的方法仍存在争议。
[0006] 乳腺超声检查因为客观性较差，需要依靠超声医师的经验，主观性较强，故国外指 南并不推荐为主要的筛查方法。可以作为乳腺X线筛查的联合检查措施或乳腺X线筛查结果 为BI-RADS 0级者的补充检查措施。鉴于中国人乳腺癌发病高峰较靠前，绝经前患者比例 高，乳腺相对致密，超声可作为乳腺筛查的辅助手段。
[0007] 我们认为现阶段有必要寻找更适合我国经济体制和人群的乳腺癌检查手段，提高 乳腺癌的早诊早治。乳腺癌的早期发现、早期诊断和早期治疗是目前降低死亡率、提高治愈 率的唯一有效而实用的途径。90%的早期乳腺癌患者是可以治愈的，而晚期乳腺癌治疗后， 存活期达5年以上的只占20%。然而从我国的情况来看，到医院就诊的乳腺癌患者中，早癌 比例过低。提高早诊率是提高乳腺癌患者生存率的最关键环节，如何为乳腺癌的早期检查 和预防提供可行的措施和报警信号，并为早期诊断、早期治疗、预防肿瘤发病和降低死亡提 供依据，已成为现代医学研究的重点。
[0008] 近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，循环游离DNA检测在乳腺癌诊疗过程中 的应用成为研究热点。以细胞外游离形式存在于血液中的DNA被称为循环游离DNA。肿瘤患 者体内肿瘤来源的循环游离DNA又称为循环肿瘤DNA。对循环游离DNA的深入研究发现，循环 肿瘤DNA所占比例与癌组织的大小和状态有关，可以反映出癌组织DNA的特征，用来评估肿 瘤负荷。以往检测乳腺癌的致病性突变，需要活检或者手术切除的肿瘤组织，属于有创检 查。循环肿瘤DNA因具有与肿瘤组织相同的特征，因此对循环肿瘤DNA进行检测是对以往诊 断方法的补充，尤其是对于原发病灶已切除的患者，其血浆中的循环肿瘤DNA可作为疗效判 定、预后检测的可靠指标。而对于肿瘤高危人群的筛查，循环游离DNA的检测以其无创性，特 异性和灵敏度高的特点，有着极大的优势。且随着检测方法的灵敏性和特异性不断提高，循 环肿瘤DNA的检测变得更加精确。
[0009] 乳腺癌循环肿瘤DNA检测能够满足本领域迫切需要建立新的乳腺癌检查及监测技 术的需求，且能够早期客观、灵敏、特异和稳定的诊断乳腺癌，并监测评估肿瘤负荷，以便进 行及时、有针对性的治疗，降低医疗成本，节约社会资源。

【发明内容】

[0010]本发明所要解决的技术问题是提供一种用于人乳腺癌循环肿瘤DNA检测的特异性 强、灵敏度高的实验方法，与常规的乳腺癌诊断方法相比，本发明的方法具有快速、高通量、 灵敏和特异性好等特点，能更好地进行人乳腺癌的早期诊断和监测乳腺癌肿瘤负荷。
[0011]为了达到以上目的，本发明采用的技术手段为：
[0012] 设计一种由靶向乳腺癌相关基因突变区域的DNA片段组成的乳腺癌"selector"。 分离纯化乳腺癌患者循环肿瘤DNA(ctDNA)，用selector设计成的探针进行液相杂交捕获， 高通量测序后，发现病人特异的癌症基因变异，并监测肿瘤负荷。
[0013] 第一方面，本发明提供了一种用于人乳腺癌检测的特异性selector，其特征在于 包含全部乳腺癌相关基因突变区域，由乳腺癌突变driver基因及TCGA数据库中496例乳腺 癌患者全部外显子数据组成，长度为0.365Mb。
[0014] 第二方面，本发明提供了一种用于含有上述特异性selector的探针组合，其特征 在于将上述乳腺癌selector定制成为探针，分离纯化患者循环游离DNA后，利用该探针进行 液相杂交捕获测序。
[0015] 具体的，本发明的一种用于人乳腺癌循环肿瘤DNA检测的探针组合，其包括乳腺癌 驱动基因及乳腺癌患者的外显子序列，所述的乳腺癌驱动基因及乳腺癌患者的外显子序列 所位于的染色体及其起始位点分别如下表所示：






[0024] 进一步的，本发明还公开了一种用于诊断人乳腺癌的捕获测序系统，其包括本发 明所述的捕获探针、杂交系统、测序装置以及循环游离DNA提取试剂盒。
[0025] 在本发明中，优选的，使用上述捕获测序系统检测人乳腺癌时，包括以下步骤：
[0026] (1)使用循环游离DNA提取试剂盒提取血浆循环游离DNA;
[0027] (2)将提取的循环游离DNA片段末端修复加接头，构建文库；
[0028] (3)捕获前对文库进行PCR扩增并纯化；
[0029] (4)将扩增后的样本文库与探针进行杂交；
[0030] (5)去除未结合序列，然后将捕获序列洗脱下来；
[0031 ] (6)对捕获后的样本再次进行PCR扩增并纯化；
[0032] (7)高通量测序分析。
[0033] 最后，本发明还提出了所述的探针组合以及所述的捕获测序系统在制备诊断人乳 腺癌试剂中的用途。
[0034] 相较于现有技术，本发明的有益效果体现在：
[0035] 特异性强：用本发明的selector和捕获测序平台检测乳腺癌患者血液样本和健康 人血液样本，只有乳腺癌患者ctDNA测序分析后发现突变，显示结果为阳性，而健康人循环 游离DNA的测序分析结果显示为阴性。这说明本发明有很好的特异性。
[0036] 灵敏度高:采用本发明的方法可检测到从乳腺癌患者血浆样本中所提取的7_32ng DNA，说明本发明方法具有很高的灵敏度。
[0037] 高通量:本发明方法应用高通量测序，单个样本的测序深度可以达到ΙΟΟΟΟχ。
[0038] 无创性:本发明发明所需样本为患者外周血，不需要穿刺活检样本或切检样本，收 集方便，且可重复性高。
【具体实施方式】
[0039] 以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的 目的，决不限制本发明的范围。
[0040]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，参见《分子克隆》 (科学出版社，第二版，2002年）。
[0041]实施例1 一种用于人乳腺癌检测的特异性selector的设计及探针的制备
[0042] 1、一种用于人乳腺癌检测的特异性selector的设计
[0043] 本发明的人乳腺癌特异性selector，包含了TCGA(THE CANCER GENOME ATLAS)数 据库中496例乳腺癌患者全部外显子数据和乳腺癌突变driver基因，长度为0.365Mb，每部 分具体长度按乳腺癌亚型和基因分布如下表2所示，由哈尔滨医科大学生物信息科学与技 术学院设计并验证。
[0044] 表 2
[0046]具体的，所述的496例乳腺癌患者全部外显子数据和乳腺癌突变driver基因包括 如下表3所示的基因序列：








[0058] 实施例2-种用于诊断人乳腺癌的捕获测序系统
[0059] 本发明的捕获测序平台，包括实施例1制备得到的探针、杂交系统、测序装置 (Roche Nimblegen)以及循环游离DNA提取试剂盒（QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit)〇
[0060] 实施例3本发明的基因芯片在诊断人乳腺癌中的应用
[0061]本发明所使用的捕获测序平台为罗氏Roche Nimblegen;循环游离DNA提取试剂盒 为QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit;测序分析由上海欧易完成。
[0062]本发明所采用的生物材料均来自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院乳腺外科，所有样 本均有患者本人签署的组织提供知情同意书及伦理证明。
[0063]检测方法：
[0064] -、血衆游离循环肿瘤DNA提取流程（DNA提取试剂盒，QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit)
[0065] 1.用EDTA抗凝采血管收集患者血液，3000rpm，离心10分钟后，分离上清，将上清再 离心，20000 X g，离心10分钟后，将上清分离备用。
[0066] 2.吸取 100ul Proteinase K至50ml离心管中。
[0067] 3.吸取lml血浆加至50ml离心管中。
[0068] 4·吸取0·8ml Buffer ACL(含有 1 ·Oug carrier RNA)至50ml离心管后，将离心管 帽扣紧，脉冲涡旋30秒。
[0069] 5.60度孵育30分钟
[0070] 6.打开离心管帽，加入1.8ml Buffer ACB，再将离心管帽扣紧，脉冲涡旋15-30秒。 [0071 ] 7.将装有混合液体的50ml离心管冰浴5分钟。
[0072] 8.将QIAamp Mini column安置于QIAvac 24Plus的Vacconnector上，在QIAamp Mini column上再安置一个20ml的拓展管。
[0073] 9.将50ml离心管内的混合液体加入至带有拓展管的QIAamp Mini column内，利用 真空栗将混合液体过滤，然后弃掉拓展管。
[0074] 10.向QIAamp Mini column内加入600ul Buffer ACW1，利用真空栗将液体过滤。
[0075] 11.向QIAamp Mini column内加入750ul Buffer ACW2,利用真空本将液体过滤。
[0076] 12.向QIAamp Mini column内加入750ul的无水乙醇，利用真空栗将液体过滤。
[0077] 13.将QIAamp Mini column的帽扣紧后，置于一个干净的2ml收集管内，高速离心 (20000 Xg) 3分钟。
[0078] 14.将QIAamp Mini column置于另一新的收集管中，打开帽，56度孵育10分钟。
[0079] 15 ·将QIAamp Mini column置于新的 1 · 5ml离心管中，向QIAamp Mini column的膜 上加入30ul Buffer AVE，扣紧帽后，室温孵育3分钟。
[0080] 16 ·将带有QIAamp Mini column的1 · 5ml离心管高速离心（20000 X g) 1分钟，洗脱 血浆游离循环肿瘤DNA(ctDNA)。
[0081] 二、捕获测序流程 [0082]第一部分样品准备
[0083] 第一步:DNA质检
[0084] Note: ctDNA 样品质量达标：0D260/0D280 = 1 · 8-2 · 0，利用 Qubit 系统对 DNA 进行定 量。
[0085] 每一个样品建一个测序文库
[0086] 第二步：AMPure XP beads纯化样品
[0087] 1.将AMPure XP beads在室温平衡至少30分钟
[0088] 2.每个样品准备400μ1的70%乙醇，在步骤8中使用。
[0089] 3.混匀磁珠悬浮液，从颜色上观察试剂颜色一致。
[0090] 4.加入180μ1均勾的AMPure XP beads到每一个ctDNA样品中，吹打10次保证混勾。
[0091] 5.室温孵育样品5分钟。
[0092] 6 ·将样品管或板放在磁力架上，静置至溶液澄清(大约3-5分钟）
[0093] 7.保持样品管或板在磁力架上，小心移除上清，当移除溶液时不要碰触到磁珠。
[0094] 8.将样品管或板继续放在磁力架上，每管加入200μ1 70 %乙醇。使用新配制的 70 %乙醇以保证实验结果良好。
[0095] 9.等待1分钟使磁珠沉淀，然后移除乙醇。
[0096] 10.重复8、9一次。
[0097] 11.用strip caps封口，简单离心收集剩余的乙醇，将板放回磁力架30秒，用Ρ20移 除剩余的乙醇。
[0098] 12将未封口的板放到PCR仪上烘干样品，PCR仪设置37°C保持3-5分钟，或直至乙醇 完全挥发殆尽。
[0099] 13.加50μ1无核酸污染的水到每个样品管中。
[0100] 14.用strip caps封口，用vortex mixer混勾并简单离心以收集液体。
[0101] 15.室温保持2分钟
[0102] 16.将样品管或板放在磁力架上保持2-3分钟，直至溶液澄清。
[0103] 17 .转移上清(大概48μ1)到一个新的管中，得到纯化后的ctDNA样本，此次可以丢 弃磁珠。如果不进行下一步，封口存放在-20°C。
[0104] 第三步:末端补平
[0105] 利用SureSelect XT Library Prep Kit ILM进行此步骤。
[0106] 1 ·按照下表4准备合适的master mix，实验在冰上进行，用votex mixer混勾，样品 一直放在冰上。
[0107]表4末端补平反应体系的制备
[0109] 2.加52μ1 master mix到纯化好的ctDNA样品中，吹打混勾。
[0110] 3.PCR仪上按照以下程序孵育样品，不需要热盖。
[0111] 20°C下孵育30min后，维持在4°C。
[0112] 第四步:AMPure XP beads纯化样品
[0113] l.AMPure XP beads平衡至少30分钟至室温，任何情况下不要冻存磁珠。
[0114] 2.混匀磁珠及试剂至颜色均匀。
[0115] 3.加180μ1均匀的AMPure XP beads到100μΙ末端补平DNA样品中，吹打10次混匀样 品。
[0116] 4.室温孵育5分钟。
[0117] 5.将样品管或板放到磁力架上，静置至溶液澄清(约需3-5分钟）。
[0118] 6.样品管或板继续放置在磁力架上，仔细移除并丢弃上清，移除上清时不要碰触 磁珠。
[0119] 7.继续把板或样品管放在磁力架上，加入200μ1新鲜配制的70 %乙醇。
[0120] 8.等待1分钟至所有磁珠沉淀，然后移除乙醇。
[0121] 9.重复步骤7-8-次。
[0122] 10.用strip caps封管，简单离心收集残存乙醇，将样品管或板放回磁力架静置30 秒，用P20枪头移除剩余乙醇。
[0123] 11将板或管放在PCR仪中干燥，PCR仪设置37度保温3-5分钟，直至乙醇完全挥发。
[0124] 12.每管中加入32μ1无核酸污染的水。
[0125] 13.用strip caps封管，vortex mixer混勾，并简单离心收集液体。
[0126] 14.室温放置2分钟。
[0127] 15.将样品管或板放在磁力架上静置2-3分钟，直至溶液澄清。
[0128] 16.转移大约30μ1上清至新管或PCR板中，得到纯化后的末端补平的ctDNA样本，磁 珠可以丢弃。
[0129] 第五步:DNA的3'末端加 A
[0130] 用SureSelect XT Library Prep Kit ILM进行该步骤实验，此步骤都在冰上进 行。
[0131 ] 1 ·按照下表5准备合适体积的Adenylation master mix，实验在冰上进行，vorgex mixer混勾。
[0132]表5 Adenylation master mix的制备
[0134] 2.每管末端补平并纯化过的DNA样品（大约30μ1)加入20ul Adenylation master mix。
[0135] 3.吹打混匀。
[0136] 4.按照以下程序设置PCR仪，孵育样品。
[0137] 37°C下孵育30min后，维持在4°C。
[0138] 第六步AMPure XP beads纯化样品
[0139] 1.室温平衡AMPure XP beads至少30分钟。
[0140] 2.混匀磁珠至颜色一致。
[0141] 3.加入90μ1混匀的AMPure XP beads至50μ1加3'末端加 A的DNA样品中，吹打10次 混匀。
[0142] 4.室温孵育5分钟。
[0143] 5.将样品管或板放在磁力架上静置大约3-5分钟至溶液澄清。
[0144] 6.保持样品管或板在磁力架上，仔细移除并丢弃澄清溶液，操作时不要碰触到磁 珠。
[0145] 7.保持样品管或板在磁力架上，每管加入200ul新配制的乙醇。
[0146] 8.静置1分钟至磁珠沉淀，移除乙醇。
[0147] 9.重复步骤7-8-次。
[0148] 10.用strip caps封管，简单离心收集残余乙醇，将管或板放回磁力架上30秒钟， 移除残余乙醇。
[0149] 11.将样品管或板放在PCR仪上，PCR仪设置37°C保温1-2分钟，或直至残余乙醇挥 发殆尽。
[0150] 12.每管加入15ul无核酸污染的水。
[0151] 13.用strip caps封口，vortex mixer混勾并简单离心收集液体。
[0152] 14.室温孵育2分钟。
[0153] 15.将样品管或板放在磁力架上静置2-3分钟，直至溶液澄清。
[0154] 16.转移13μ1澄清溶液至新的PCR管或板中，磁珠可以丢弃。
[0155] 17.马上进行下一步骤实验。
[0156] 第七步:连接adaptor
[0157] SureSelect XT library Prep Kit ILM进行本步骤实验，进行此步骤时样品置冰 上
[0158] 1 ·按照下表6在冰上准备合适体积的Ligation master mix，vortex mixer混勾。
[0159] 表6 Ligation master mix的制备
[0160]
[0161 ] 2.加入37μ1连接master mix到每个加 A并经过纯化的DNA样品中。
[0162] 3.反复吹打混匀。
[0163] 4.按照下表条件在PCR仪中孵育样品，不要用热盖。
[0164] 20°C下孵育15min后，维持在4°C。
[0165] 如果不进行下一步实验，样品封口后存放在-20°C。
[0166] 第八步:AMPure XP beads纯化样品
[0167] 1.室温平衡AMPure XP beads至少30分钟。
[0168] 2.混匀磁珠和溶剂至颜色均匀。
[0169] 3.每管50μ1 的adaptor-ligated DNA样品中加入90ul AMPure XP beads，吹打混 匀。
[0170] 4.室温孵育5分钟。
[0171] 5.将样品管或板放在磁力架上，静置3-5分钟至溶液澄清。
[0172] 6.保持样品管或板在磁力架上，小心移除并丢弃澄清溶液，移除溶液时不要碰触 磁珠。
[0173] 7.保持样品管或板在磁力架上，每管加入200μ1新鲜配制的70%乙醇。
[0174] 8.静置1分钟等待beads沉淀，然后移除乙醇。
[0175] 9.重复步骤7-8-次。
[0176] 10.用strip caps封口，简单离心收集残余乙醇，将样品管或板放回磁力架静置30 秒，移除剩余的乙醇。
[0177] 11.样品管或板不封口放在PCR板上，设置温度至37°C保温1-2分钟直至残余乙醇 挥发殆尽。
[0178] 12.加入32μ1无核酸污染的水。
[0179] 13.用strip caps封口，vortex mixer混勾并简单离心收集液体。
[0180] 14.室温放置2分钟。
[0181] 15.将样品管或板放在磁力架上2-3分钟，直至溶液澄清。
[0182] 16.将大约32μ1上清转移至新管中，磁珠可以丢弃。
[0183] 第九步：扩增adaptor-ligated 文库
[0184]此步骤成分显示如下，所有试剂在冰上融解。
[0186] 1 ·准备合适体积的pre-capture PCR reaction mix，在冰上按照下表7进行， vortex mixer混勾。
[0187] 表7 pre-capture PCR reaction mix的制备
[0189] 2.每15μ1纯化过的DNA样品中加入35μ1的PCR Reaction mixture，吹打混勾。
[0190] 3.运行下列程序：
[0192] 第十步AMPure XP beads纯化扩增文库
[0193] 1.室温平衡AMPure XP beads至少30分钟。
[0194] 2.混匀磁珠和试剂至颜色均匀。
[0195] 3.每50μ1扩增文库样品中加入90μ1匀质的AMPure XPbeads，吹打混匀。
[0196] 4.室温孵育5分钟。
[0197] 5.将样品管或板放在磁力架上，静置3-5分钟至溶液澄清。
[0198] 6.保持样品管或板在磁力架上，仔细移除并丢弃上清，移除溶液时不要碰触磁珠。
[0199] 7.保持样品管或板在磁力架上，加入200μ1新鲜配制的70 %乙醇。
[0200] 8.静置1分钟沉淀磁珠，然后移除乙醇。
[0201] 9.重复步骤7-8-次。
[0202] 10.用strip caps封口，简单离心收集残余乙醇，将样品管或板放在磁力架上30 秒，移除剩余乙醇。
[0203] 11.将样品管或板放在PCR仪上，设置温度37°C保温1-2分钟或直至残余乙醇彻底 挥发殆尽。
[0204] 12.每管加入30μ1水。
[0205] 13.封口，vortex mixer混勾并简单离心收集液体。
[0206] 14.室温放置2分钟。
[0207] 15.将样品管或板放在磁力架上2-3分钟，直至溶液澄清。
[0208] 16.转移上清(大约30μ1)到新的PCR管或板中，磁珠丢弃，得到纯化后的DNA文库。 如果不继续进行后续实验，封口并将样品放-20°C保存。
[0209]第二部分杂交捕获 [0210]第一步DNA样品与探针的杂交
[0211] 本步骤用SureSelect Reagent Kit，每种成分的融解按照表格中的要求进行， Vortex mixer混勾每种试剂，简单离心收集液体。成分列表8如下：
[0212]表8杂交所用的试剂
[0214] 杂交反应需要的750ng样品溶解在3.4μ1溶液中，起始浓度221ngAU。
[0215] 1.对已准备好的DNA文库，如果浓度高于221ngAU，稀释成221ngAU浓度，共需要 3.4μ1〇
[0216] 2.如果文库浓度达不到221ngAU，用真空干燥机浓缩至221ngAU，干燥温度不得 高于45°C。
[0217] A将30μ1建好的文库转移到Ep管中，在管盖上戳几个小孔，也可以用paraf i lm盖住 管子，戳几个小孔。
[0218] B 45°C以下浓缩DNA样品。
[0219] C加水调整至终浓度为221ngAU，注意清洗管壁获得最高的回收率。
[0220] D vortex mixer混勾并离心1分钟。
[0221] 3.转移3.4μ1 DNA样品文库(750ng)到新PCR管或板中，封好口放在冰上。
[0222] Caut i on:必须避免后续的16-24小时的孵育中样品挥发
[0223] 4.室温条件下按照下表9准备杂交缓冲液，如果有沉淀，可65 °C温育5分钟溶解，将 杂交缓冲液放在室温条件，直到步骤9使用。
[0224] 表9杂交缓冲液的准备
[0226] *Prepare Hybridization Buffer for at least 5 reaction equivalents per run to allow accurate pipetting volumes.
[0227] 5.通过混合下表10成分准备SureSelect Block Mix，混合液放在冰上直至步骤6 使用。
[0228] 表 10 SureSelect Block Mix的准备
[0230] 6 .对每一个准备好的3.4 μ 1的D N A文库，加入5.6 μ 1体积按照上表配制的 Sureselect Block Mix，吹打混勾。
[0231] 7.封口后将封好的样品管或板放在PCR仪中，运行下表11的程序：
[0232] 热盖温度：105°C，65°C保温，保证DNA+Block Mix样品在加入其它成分之前至少在 65°C温育5分钟以上。
[0233] 表11 DNA+Block Mix在杂交前的热循环程序
[0235] 8.基于下表12所列的捕获文库的大小，准备合适体积的SureSelect RNase Block。准备杂交所需的数量的溶液，混合物在步骤9之前要放在冰上。
[0236] 表12 RNase Block溶液的制备
[0238] 准备步骤9所描述的捕获文库混合物，保证65°C5分钟的温育。混合物置室温，直至 步骤10混入样品。不要将含有SureSelect Capture Library的溶液放在室温。
[0239] 9.按照表13进行混合。Vortex 5秒钟然后离心收集液体，直到步骤10使用。
[0240] 表 13 Capture Library Hybridization Mix的制备
[0242] 10.保持DNA文库+Block Mix管或板在65°C，加入步骤9制备的20μ1 Capture Library Hybridization Mix以及2μ1实施例1制备得到的探针，吹打8-10次混勾。
[0243] 杂交反应体系现在大约为27_29μ1，取决于65°C温育时的挥发量。
[0244] 11 ·用Strip caps或plateLoc Thermal Microplate Sealer封口，保证管口完全 封闭。必须充分封口以减少蒸发，否则结果回收影响。
[0245] 12.热盖105°C条件下，65°C孵育杂交混合物16-24小时。
[0246] 第二步准备链霉亲和素修饰磁珠
[0247] 1 ·65°C预热SureSelect Wash Buffer 2，用于步骤3〇
[0248] 2.vortex mixer剧烈振荡混勾Dynabeads MyOne Streptavidin T1 磁珠，磁珠在 存放过程中会沉淀。
[0249] 3.先将磁珠转入新的样品管或板，每一个杂交样品需要加入50ul重悬磁珠。
[0250] 4.洗涤磁珠：
[0251] A加入200μ1 SureSelect Binding Buffer。
[0252] B吹打使bead使充分重悬。
[0253] C将装有磁珠的管或板放在磁力架上。
[0254] D静置至溶液澄清，移除并丢弃上清。
[0255] E步骤A到D重复两次，共洗涤三次。
[0256] 5·200μ1 Sureselect Binding Buffer重悬磁珠。
[0257] Note如果有大体积的磁珠捕获系统，链霉亲和素磁珠可以用Ep管进行大体积洗 涤，洗涤好之后，200μ1 -份进行分装。
[0258] 第三步:链霉亲和素磁珠捕获杂交DNA
[0259] 1.估计并记录温育24小时后的杂交体系溶液体积。
[0260] 2.当吸取杂交体系内的溶液时，应将杂交管或板保持在65°C，每管应可以吸取25- 29μ1溶液，并将该溶液与200μ1洗涤过的链霉亲和素磁珠混合。缓慢吹打使磁珠充分重悬。 [0261] 3.封口，样品管或板放在Nutator mixer或功能相当的仪器上室温保持30分钟，确 保样品混合适度。
[0262] 4.简单离心样品管或板。
[0263] 5.将样品管或板放在磁力架上，静置直至溶液澄清，移除并丢弃上清。
[0264] 6.重悬200μ1 SureSelect Wash Buffer 1，吹打直至磁珠充分重悬。
[0265] 7.室温孵育样品15分钟。
[0266] 8.简单离心。
[0267] 9.将样品管或板放在磁力架上，直至溶液澄清，移除并丢弃上清。
[0268] Caution:整个洗涤过程保证bead重悬液温度65°C，确保捕获特异性。
[0269] 保证SureSelect Wash Buffer 2在使用前预热至65°C。实验过程中不能使用温度 波动大的仪器。
[0270] 10.用SureSelect Wash Buffer2洗涤磁珠。
[0271] A重悬200μ1的65°C预热的Wash Buffer 2,吹打直至磁珠重悬。
[0272] B封口，PCR仪65°C温育样品管或板。
[0273] C将样品管或板放在磁力架上，静置至溶液澄清，移除并丢弃上清。
[0274] D重复步骤A到C 2次，共洗涤3次。
[0275] 最后一次洗涤结束，保证所有的wash buffer都被移除。
[0276] 11.加入30μ1无核酸污染的水，吹打以重悬磁珠。
[0277] 保持所有样品在冰上直至后续使用。
[0278] 后续扩增实验中，捕获的DNA保持连接在链霉亲和素磁珠上。
[0279] 第三部分:样品加 Index
[0280] 第一步用8_bp Indexes A01-H12 Indexing primers扩增捕获文库
[0281] 本步骤所用试剂如下表14所列:融解并vortex mix混勾并放在冰上待用。
[0282]表14用于捕获后PCR扩增的试剂
[0283]
[0284] *Do not use the PCR Reaction Buffer or dNTP mix from any other kit.
[0285] 每一个文库用一个index扩增
[0286] 1 ·指定每个样品的index，Indexes A01到H12用于扩增DNA文库，一个lane的样品 不能用同样的indexing primer标记。
[0287] 2.按照下表15在冰上准备合适体积的PCR反应混合物
[0288] 表15捕获后PCR扩增的混合液的准备
[0290] 3.每个样品中加入31μ1的PCR反应混合物
[0291 ] 4·加入5μ1 合适的Indexing Primer(SSEL 8bp Indexes Α01-Η12，蓝板），每个样 品加入16或96中的一个引物。
[0292] 5.每个PCR反应中加入DNA文库样品。
[0293] A取放置冰上的包含30ulbead_bound target-enriched DNA样品的PCR样品管或 板(前面步骤准备好的）。
[0294] B吹打每个DNA文库直至bead重悬液匀质，然后转移14μ1样品到包含PCRreaction mix及indexing引物的PCR样品板或管中。
[0295] C吹打混匀PCR反应混合物。
[0296] D剩余结合在磁珠上的文库-20 °C冻存备用。
[0297] 6.按照以下程序进行PCR扩增：
[0299] 7. PCR程序结束，简单离心样品管或板。
[0300] 第二步：用AMPure XP beads纯化捕获扩增的文库
[0301] 1.室温平衡AMPure XP beads至少30分钟，磁珠在任何时候不能冻存。
[0302] 2.准备400μ1新鲜配制的70 %乙醇，步骤9使用。
[0303] 3.重悬AMPure XP beads至颜色均勾。
[0304] 4.每50μ1扩增DNA样品中加入90μ1匀质的AMPure XPbead重悬液。
[0305] 5.吹打混匀。
[0306] 检查确保磁珠在溶液中均匀存在，每个管颜色统一且没有磁珠分层的现象存在。
[0307] 6.室温温育5分钟。
[0308] 7.将样品板或管放在磁力架上，室温静置大约3-5分钟至溶液澄清。
[0309] 8.保持样品板或管在磁力架上，仔细移除并丢弃上清，移除上清时不要碰触磁珠。
[0310] 9.保持样品管或板在磁力架上，每管加入200μ1新鲜配制的70%乙醇。
[0311] 10.静置1分钟等待磁珠沉淀，移除乙醇。
[0312] 11.重复步骤9-10-次，确保最后移除所有乙醇。
[0313] 12.样品板或管封口，简单离心收集残余乙醇，将样品管或板放回磁力架30秒，Ρ20 枪头移除残余乙醇。
[0314] 13.将样品板或管放在PCR仪上37°C保温1-2分钟或直至残余乙醇完全挥发。
[0315] 14.每个管加入30μ1无核酸污染水。
[0316] 15.封口，vortex mixer混勾并简单离心收集液体。
[0317] 16.室温温育2分钟。
[0318] 17.将样品板或管放在磁力架上2分钟直至溶液澄清。
[0319] 18.上清(大约30μ1)转移至新管，磁珠可以丢弃。
[0320]样品质检合格后进彳丁尚通量测序。
[0321] 结果：
[0322] 检测到5例患者血浆游离循环肿瘤DNA中存在PIK3CA、TP53、EGFR、AKT1和PTEN的突 变情况，筛除掉外周血细胞检测到的SNP，每个患者5种基因在血浆中检测到的平均突变频 率见下表16:
[0323] 表16
[0325] 下表17为检测的原始数据(一部分）：
[0326] 表17
[0328] 血浆检测到的ctDNA浓度见下表18:
[0329] 表 18
[0332]用本发明的selector和捕获测序平台检测乳腺癌患者血液样本和健康人血液样 本，只有乳腺癌患者ctDNA测序分析后发现突变，显示结果为阳性，而健康人循环游离DNA的 测序分析结果显示为阴性。这说明本发明有很好的特异性。本发明的方法可检测到，从乳腺 癌患者血浆样本中所提取的7-32ng DNA，说明具有很高的灵敏度。本方法应用高通量测序， 单个样本的测序深度可以达到ΙΟΟΟΟχ。
[0333]以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的； 本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改 变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1.用于人乳腺癌循环肿瘤DNA检测的探针组合，其特征在于包括乳腺癌驱动基因及乳 腺癌患者的外显子序列，所述的乳腺癌驱动基因及乳腺癌患者的外显子序列所位于的染色 体及其起始位点分别如下表所示：2. -柙用亍诊断人乳脲癌的捕获测序糸统，其特祉在t包拈权利要求1所还的採针组 合、杂交系统、测序装置以及循环游离DNA提取试剂盒。3. 如权利要求2所述的捕获测序系统，其特征在于用于人乳腺癌检测时，包括以下步 骤： (1) 使用循环游离DNA提取试剂盒提取血浆循环游离DNA; (2) 将提取的循环游离DNA片段末端修复加接头，构建文库； (3) 捕获前对文库进行PCR扩增并纯化； (4) 将扩增后的样本文库与探针进行杂交； (5) 去除未结合序列，然后将捕获序列洗脱下来； (6) 对捕获后的样本再次进行PCR扩增并纯化； (7) 高通量测序分析。4. 权利要求1所述的探针组合在制备诊断人乳腺癌试剂中的用途。5. 权利要求2所述的捕获测序系统在制备诊断人乳腺癌试剂中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK105950739SQ201610369364
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】庞达, 张显玉, 肖云, 魏巍
【申请人】哈尔滨医科大学