艾滋病相关肠道普氏菌移位的特异性检测引物及应用
【专利摘要】本发明公开了一种艾滋病相关肠道普氏菌移位的特异性检测引物及应用，所述引物序列为：上游引物 Pre?F 5’?CATCGAAAGCTTGCTTTTGATGGGC?3’，下游引物 Pre?R 5’?CCGCTGACCTGTTCAGACCAACAGC?3’；本发明的特异性检测引物具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的检测能力和广泛的应用前景。
【专利说明】
艾滋病相关肠道普氏菌移位的特异性检测引物及应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体涉及用于检测艾滋病患者肠道内普氏菌 (PreraieDa cOjOri)移位的特异性检测引物及应用。
【背景技术】
[0002] 艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)引起的慢性消耗性 传染病，目前已成为全球性的公共卫生问题。截至2015年10月底，全国报告存活的HIV/AIDS 共计57.5万例，死亡17.7万人。高效抗逆转录病毒治疗(Highly Active Anti-Retroviral Therapy，HAART)虽然能有效抑制病毒复制，延长患者寿命，但是不能完全治愈AIDS。目前 的研究发现，肠道是HIV感染早期攻击与复制的靶器官，在外周血CD4+T细胞还未下降时，肠 道的⑶4+T细胞已处于耗竭状态，且HAART治疗不能恢复肠道⑶4+T细胞的数量，有效重建肠 道免疫。肠道屏障受损，肠道菌群移位入血，引起病理性的免疫活化，加速HIV/AIDS的疾病 进展和非艾滋相关并发症的发生，同时，HIV/AIDS患者抵抗力低下，肠道菌群移位可引起肠 源性感染，是AIDS患者死亡最主要的原因。
[0003] 普氏菌(PreraieDa copri)属于革兰氏阴性厌氧杆菌，广泛分布于人体肠道内， 是临床上较常见的一种条件致病菌，可引起内源性感染，例如脓肿、甲沟炎、尿路感染、脑脓 月中、骨髓炎、菌血症及上呼吸道感染。文献表明，HI V/AIDS肠道菌群紊乱，其中普氏菌比例显 著升高。普氏菌通过受损肠屏障进入外周血，活化机体免疫，加快疾病进程。如果能早期诊 断出HIV/AIDS有普氏菌移位情况，在现有的治疗方案上进行针对性治疗，就能够减少感染 机会，也就可以在一定程度上延长患者的生命。目前，对于肠道菌群移位的诊断，主要是在 患者基础疾病与临床表现的基础上加上实验室诊断，常用的有患者血液中内毒素检测，该 方法虽然快速但却不能明确具体的感染细菌种类，往往在病发后诊断，不利于早期诊断治 疗;此外临床上还常使用血培养的检测方法，该方法虽然能够明确感染细菌类型，但成本较 高、花费时间长且易受外界因素影响结果并不一定可靠，既增加了诊断成本，又延误了确诊 时机。因此，急需建立一种快速、灵敏、特异的检测方法来提高临床对HIV/AIDS肠道内普氏 菌菌群移位的检测能力。本发明根据16S rRNA高变区设计Prera ieDa copri的特异性引 物，建立了HIV/AIDS肠道普氏菌移位的快速检测方法。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术不足，本发明提供了一种检测艾滋病患者肠道内普氏菌移位特异性 快速检测引物；引物序列为： 上游引物 Pre-F 5 ' -CATCGAAAGCTTGCTTTTGATGGGC-3 ' 下游引物 Pre-R 5 ' -CCGCTGACCTGTTCAGACCAACAGC-3 '。
[0005] 本发明另一目的是将上述引物应用于制备艾滋病相关肠道普氏菌移位显症之前 的早期诊断产品。
[0006] 还可以用于制备艾滋病相关肠道内普氏菌位移的检测试剂盒，该试剂盒包括引 物组以及检测试剂盒常用的其他常规检测试剂组分： 上游引物 Pre-F 5 ' -CATCGAAAGCTTGCTTTTGATGGGC-3 ' 下游引物 Pre-R 5 ' -CCGCTGACCTGTTCAGACCAACAGC-3 '。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案： 1、 根据16S rRNA高变区设计PreraieDa cojori的特异性引物，建立了艾滋病患者肠道 普氏菌移位快速检测引物，即特异分子检测引物的序列为： 上游引物 Pr e-F 5 ' -CATCGAAAGCTTGCTTTTGATGGGC-3 ' 下游引物 Pr e-R 5'-CCGCTGACCTGTTCAGACCAACAGC-3' 2、 用上述特异性引物和待检样品DNA进行PCR，如果PCR产物片段大小为780bp，则待检 样品中有普氏菌;可以使用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物大小，如果电泳结果在780bp 处出现扩增条带，即表明待检样品中有普氏菌。
[0008] 本发明针对现阶段尚没有艾滋病患者肠道普氏菌移位快速检测技术，通过对 PreraieDa copri设计特异性引物进行PCR扩增，用于艾滋病患者肠道普氏菌移位的快速 分子检测，建立肠道普氏菌移位快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系。此技术可 应用于艾滋病患者肠道普氏菌移位显症之前的早期监测，为治疗策略的制定提供科学依 据。
[0009] 本发明适用于临床PreraieDa cojori有关的任何感染疾病的病原体快速检测诊 断。
[0010] 本发明方法适用于血液、奠便、组织中PreraieDa cojori的快速鉴定，本发明与现 有技术相比，具有以下技术优势： 1、 准确可靠:本发明检测方法是利用细菌16S rRNA设计可变区特异性引物能准确鉴定 供试病原菌，结果可靠； 2、 实用性好:本发明所设计的一对特异性引物，可用于血液、粪便、组织的高灵敏度快 速分子检测，因此本方法的实用性强； 3、 操作简便快速:应用本发明方法，不需要经过细菌培养，检测所需样本量少，可以对 患者外周血或外周血DNA pmol含量的普氏菌DNA直接PCR扩增和常规的琼脂糖凝胶电泳即 可判断结果阴阳性，一般整个检测过程一个半小时内完成。
【附图说明】
[0011 ]图1为健康人外周血DNA经PCR电泳、检测结果，其中Cn为空白对照;Cp为阳性对照； Μ为DNA Marker; 1-20为20例健康人样本； 图2为艾滋病患者外周血DNA进行特异性引物PCR扩增电泳检测结果，其中Cn为空白对 照;Cp为阳性对照;Μ为DNA Marker; 1- 19为艾滋病患者样本。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围，该领域的技术人员可以根据上述本
【发明内容】
对本发明做 出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特异表明，所用试剂均为分析纯，所有试 剂均可从商业渠道获得，百分比均为质量百分比。文中未注明具体条件的实验方法，通常按 照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或试剂制造厂商所建议的条件实施。除非另行定 义，文中所使用的所有专业和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
[0013] 实施例中主要试剂与仪器为： 血液基因组DNA提取试剂盒(DP318)、金牌MiX (TSE101)、高速低温离心机、PCR仪、凝胶 成像仪。血液样本来源于昆明医科大学第一附属医院艾滋病样本库。
[0014] 实施例1:引物设计 根据16S rRNA高变区设计PreraieDa copri的一对特异性引物，PCR扩增目的带为780 bp;引物序列为：
[0015]实施例2:特异性检测引物检测艾滋病患者肠道普氏菌移位 本实施例测试组为19例AIDS患者的外周血DNA;该19例AIDS患者的外周血DNA同时采用 二代高通量16S rRNA测序法进行测序作为对比；以20例健康人的外周血DNA作为对照组，以 水代替模板为空白对照；以cojori DNA为阳性对照。
[0016] 1、DNA模板的制备 血液DNA提取使用市购血液DNA提取试剂盒提取，按试剂盒说明书方法操作。
[0017] 2、PCR反应及凝胶检测 反应体系:金牌Mix (TSE101)试剂盒，反应体系为50yL体系，不足50yL用双蒸水补足， 具体如下：
PCR条件:预变性98°C 2分钟，变性98°C 10秒，退火60°C 10秒，延伸72°C 5秒，进行25 个循环，最后延伸72°C 1分钟。
[00?8] 配制1%琼脂糖凝胶，分子marker标记PCR产物大小，使用电压100V，电泳30min后取 出并置于BioRad凝胶成像系统下记录凝胶图片。
[0019] 结果表明，见图1、2,空白对照和健康人血样DNA均未检出PreraieDa cojori目的 条带，而阳性对照Cp出现条带大小780bp，表明健康人的血液循环系统中不存在Pre ra i eDa 菌移位。与之相反，AIDS患者血液样本DNA中均扩增出目的条带，大小为780bp，表明 在AIDS患者血液中有PreraieDa copri移位菌或其裂解DNA片段，检出率100%，该结果与采 用二代高通量16S rRNA测序结果一致，但二代高通量测序技术较本技术复杂成本高。
[0020] 此外，AIDS患者血液DNA 16S rRNA测序分析发现除了有PreraieDa copri移位还 有其它微生物移位，如梭形巨单胞菌）JaecaiiAacierit/ffi Prat/s/ji izii(柔嫩梭菌）、7?腫i/3〇cocct/s /λΓ〇??(瘤胃球菌）、Sj〇(颤杆菌）、 Dialister succina tiphilusi |Sf) ^Megasphaera sp. (|EL?SBj< IMI ) n Sphingobium SjO.(革肖月旨菌）、C7osi_ric/i腫 /?esi_/e(梭菌）、i?/3ierococct/s st/ift/i-et/s(肠球 菌）、?Sirepiococct/s j〇arasa/3gt/i/3is(链球菌)等微生物，但PreraieDa cOjOri在所有移位 菌中所占的丰度最高，推测copri移位可能早于其他肠道菌群的移位，利用本 发明普氏菌特异性引物只检测到/^reraieDa copri，说明本发明特异性引物特异性效果 好，针对性强，检测时不会受其他肠道菌的干扰影响，同时也可判断患者存在肠道菌群移位 感染的风险。
【主权项】
1. 一种艾滋病相关肠道普氏菌移位的特异性检测引物，所述引物序列为： 上游引物 Pre-F 5 ' -CATCGAAAGCTTGCTTTTGATGGGC-3 ' 下游引物 Pre-R 5 ' -CCGCTGACCTGTTCAGACCAACAGC-3 '。2. 权利要求1所述的艾滋病相关的肠道普氏菌移位特异性检测引物在制备艾滋病相关 肠道内普氏菌移位诊断产品中的应用。3. 权利要求1所述的艾滋病相关的肠道普氏菌移位特异性检测引物在制备艾滋病相关 肠道内普氏菌位移的检测试剂盒中的应用。
【文档编号】C12Q1/04GK105950779SQ201610583472
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月22日
【发明人】王昆华, 谢振荣, 徐玉, 沈宗文, 任莉, 王腊梅, 王华伟
【申请人】昆明医科大学第附属医院, 昆明医科大学第一附属医院