抑制neat1用于治疗实体肿瘤的制作方法

抑制neat1用于治疗实体肿瘤的制作方法
【专利摘要】本申请涉及癌症领域，特别是实体肿瘤领域。人们发现特定的长非编码RNA(lncRNA)，NEAT1，核旁斑的必要架构组分，对于癌细胞的存活来说是必需的，但是对于正常的，非转化的细胞来说则并非如此。抑制NEAT1降低癌细胞的细胞生存力并且诱导细胞凋亡。这些数据将NEAT1鉴定为用于治疗实体肿瘤的新的治疗靶标。
【专利说明】抑制NEAT1用于治疗实体肿瘤 发明领域
[0001]本申请涉及癌症领域，特别是实体肿瘤领域。人们发现，一种特定的长非编码RNA (lncRNA)，NEATl，核旁斑的必要架构组分，对于癌细胞的存活来说是必需的，但是对于正常 的，非转化的细胞来说则并非如此。抑制NEAT1降低癌细胞的细胞生存力并且诱导凋亡。这 些数据将NEAT1鉴定为用于治疗实体肿瘤的新的治疗靶标。
[0002] 背景
[0003] p53是原型肿瘤抑制基因，然而，关于p53发挥其肿瘤抑制作用的机制，仍然有很多 有待了解。已经描述了许多靶基因，直接和间接靶标，转录因子，蛋白质编码基因和非编码 基因（例如，miRNA)。然而，尽管人们普遍认为p53是主要的细胞凋亡调节物，p53如何做到从 静歇/存活切换至细胞凋亡仍然是未知的。由于在一些情况下P53甚至看起来有助于肿瘤发 生，确定P53刺激或防止细胞凋亡(尤其是癌细胞的细胞凋亡）的机制将是有利的。
[0004] 此外，由于癌细胞已经发展了在次优环境中生存的增强的能力，甚至无论存在或 不存在野生型P53,鉴定在p53下游调节细胞生存的靶标将是有利的。最优选地，这类靶标将 允许选择性调节癌细胞中的途径，以便这些细胞可以被选择性地杀死。
[0005] 概要
[0006] 利用RNAseq和ChIPseq实验，NEAT1被鉴定为p53的直接靶基因。NEAT1是一种丰富 的核长非编码RNA，其功能为核旁斑的必要架构组分。虽然旁斑的功能仍不清楚，转染研究 表明它们分别通过结合特异性转录因子和/或经编辑的mRNA来调苄基因转录和/或mRNA翻 译。
[0007] 为了研究旁斑在体内的生理作用，产生了缺乏Neat 1的小鼠。Neat 1敲除(K0)的小 鼠是有生存力的并且没有明显的表型，除了发育期乳腺分枝化形态发生中的缺陷以及降低 的怀孕期间小叶肺泡发展和泌乳能力。
[0008] 尽管先前观察到当传代时Neatl表达和旁斑形成增加，本文中表明Neatl缺陷型小 鼠胚胎成纤维细胞(MEF)不显示任何显著生长缺陷，这提示Neatl和旁斑对于正常的，非转 化的细胞的增殖和存活来说是可有可无的。相反，培养的癌细胞的存活依赖于NEAT1表达。 使用LNA修饰的反义寡核苷酸的敲低NEAT1大幅度降低旁斑的数量、多种癌细胞系的代谢活 性和生存力。
[0009] 虽然IncRNA NEAT1在体内在乳腺形态发生过程中起重要作用，总的来说，其表达 在成年期是可有可无的。连同如下观察即NEAT1对于癌细胞的存活来说是必需的，但是对于 正常的/非转化的细胞来说则并非如此，这些数据将NEAT1鉴定为用于癌症治疗的治疗靶 标。
[0010]本发明的目标是提供NETA1基因的功能性表达的抑制剂。这样的抑制剂可以在DNA 水平上起作用，或者在RNA(即，基因产物)水平上起作用。由于NEAT1是非编码基因，因此对 于该基因来说没有蛋白产物。
[0011 ]根据另一个方面，提供NEAT1的功能性表达的抑制剂，用作药物。根据又一些方面， 提供NEAT1的功能性表达的抑制剂，用于在癌症的治疗中使用，尤其是用于在实体肿瘤的治 疗中使用。在又一些实施方案中，提供抑制剂，用于在上皮癌(carCinoma)(g卩，源自上皮细 胞的癌症）的治疗中使用。根据备选的实施方案，提供抑制剂，用于在以下癌症的治疗中使 用，所述癌症选自乳腺癌、皮肤癌、骨肉瘤、结肠直肠癌和神经母细胞瘤的组。根据非常具体 的实施方案，所述皮肤癌是非黑色素瘤皮肤癌，通常选自BCC(基底细胞癌)或SCC(鳞状细胞 癌)。
[0012] 这等同于说，提供治疗有需要的对象中的实体肿瘤的方法，包括将NEAT1的功能性 表达的抑制剂施用给所述对象。同样地，其等同于提供治疗上皮癌的方法，或治疗选自乳腺 癌、皮肤癌、骨肉瘤、结肠直肠癌和神经母细胞瘤的组的癌症的方法，其中将NEAT 1的功能性 表达的抑制剂提供给所述对象。
[0013] 抑制剂的性质对于本发明来说不是至关重要的，只要它抑制NEAT1基因的功能性 表达即可。根据具体的实施方案，所述抑制剂选自 指核酸酶或小分子。根据具体的实施方案，所述抑制剂被施加至或者被靶向至癌细胞(如， 实体肿瘤细胞）。
[0014] 根据备选的(但不是排他的）具体实施方案，抑制剂在癌细胞中选择性地诱导细胞 凋亡。这尤其意味着它在癌（例如上皮癌）细胞中诱导细胞凋亡，但是不在正常的（非转化 的)类似细胞(例如上皮细胞）中诱导细胞凋亡。根据另外的具体实施方案，抑制剂诱导细胞 凋亡不依赖于P53状态，例如，不依赖于p53是否具有特定的突变，或不依赖于其表达水平。 [0015]本文中表明，NEAT1抑制干扰DNA修复途径，尤其是干扰双链修复机制（如，同源重 组(HR)和非同源末端连接(NHEJ))。这意味着其中NEAT1被抑制的细胞将对剩余的单链修复 途径(切除修复途径)如，碱基切除修复(BER)的抑制特别敏感，然而其中NEAT1未被抑制的 细胞将对这种治疗不敏感得多。
[0016] 因此，根据特别的实施方案，提供了DNA切除修复酶的抑制剂与NEAT1的功能性表 达的抑制剂的组合，用于在癌症的治疗中使用。预期这会在细胞中诱导合成致死。
[0017] 根据具体的实施方案，DNA切除修复酶的抑制剂是DNA碱基切除修复酶的抑制剂。 根据进一步的具体实施方案，DNA碱基切除修复酶的抑制剂是PARP抑制剂。
[0018] 此外，本文中表明，NEAT1控制线粒体动力学，并且这可能也有助于其致癌活性。对 于MFF的表达来说，NEAT1是必需的，而MFF反过来又调节线粒体分裂。失去NEAT1导致MFF表 达显著减少，并最终导致肿胀的线粒体以及对氧化胁迫和/或致癌胁迫的增加的敏感性。靶 向NEAT1使得癌细胞对氧化胁迫极为敏感。因此，根据具体的实施方案，提供了增加氧化胁 迫的活性剂与NEAT1的功能性表达的抑制剂的组合，其用于在癌症的治疗中使用。预期这也 会在细胞中诱导合成致死。这类增加氧化胁迫的活性剂的例子在本领域中是已知的，并且， 包括(但不限于)例如鱼藤酮、H202、tBHP、冈田酸。
[0019] 根据类似的方面，提供了治疗癌症的方法，包括将NEAT1的功能性表达的抑制剂施 用给有需要的对象，该方法可以进一步包括施用DNA碱基切除修复酶的抑制剂。这可以作为 组合治疗（即，伴随施用或同时施用）而完成，或者可以通过分别施用所述化合物来完成，但 尤其是通过随后的施用（即，在彼此的有限时间范围内，使得两种抑制剂在对象中同时有活 性)来完成。
[0020] 根据另一个方面，提供了鉴定肿瘤是否适合于用NEAT1的功能性表达的抑制剂治 疗的方法。这些方法通常具有以下步骤：
[0021] -确定在肿瘤中或者在肿瘤细胞的样品中NEAT1的表达是否增加；
[0022] -确立肿瘤是否是适合于治疗，其中增加的表达表明治疗的适合性。
[0023] 通常，肿瘤将是实体肿瘤。因此这些方法可以包括提供(实体)肿瘤细胞样品的第 一步骤。确定步骤可以完全在体外发生，即，没有在人体或动物体上相互作用的步骤。
[0024] 根据特定的实施方案，所述肿瘤是上皮癌。根据备选的实施方案，所述肿瘤选自乳 腺癌、皮肤癌、骨肉瘤、结肠直肠癌和神经母细胞瘤。
[0025] 根据具体的实施方案，当确立了肿瘤适合于治疗时，该方法可以进一步包括将 NEAT1的功能性表达的抑制剂施用给其中存在肿瘤的对象的步骤。这是为了治疗肿瘤。 [0026]这些抑制剂还可以与例如DNA切除修复酶的抑制剂或增加氧化胁迫的活性剂组 合。
[0027]附图的简要说明
[0028]图1提供的证据表明，NEAT1在乳腺癌细胞系MCF-7中是直接的p53靶基因。RNA-seq 和p53ChIPseq实验已在暴露于MDM2拮抗剂Nutlin3a24小时后的MCF-7细胞中进行。显示了 NEAT1基因座，并且，在未处理的(对照)细胞和在Nutlin3a处理24小时的细胞中显示了蓝色 的RNA-seq峰(显示了两个生物学重复），从0(对照)至24小时的峰的强度增加表明Nutlin3a 诱导NEAT1的转录。p53-ChIP峰以绿色示出；这些峰表明在Nutlin3a暴露时p53被直接募集 至NEAT1启动子。
[0029] 图2.在多种p53野生型人癌细胞系中，两种NEAT1转录物（NEAT1_1和长同种型 NEAT1_2)均由Nut 1 in3a诱导。该作用是p53依赖性的。
[0030] 图3.Nutlin3a以p53依赖性方式诱导旁斑形成。A.将MCF-7细胞暴露于Nutlin-3a (24小时），并且利用NEAT1特异性探针组通过FISH分析来评估旁斑形成（红点）。细胞核用 DAPI复染（蓝色）。13在用对照/乱序gapmer(scr)或革E向NEAT1转录物的gapmer(gap4和gap6) 转染细胞之前(模拟)和之后，对暴露于Nutlin-3a的MCF-7细胞中的旁斑形成进行定量。
[0031] 图4.在暴露于低胁迫条件的人类和小鼠细胞中诱导NEAT1，所述低胁迫条件包括 暴露于衰老的诱导物极光激酶抑制剂4201152-即?4以20 4)、低剂量的鱼藤酮(1?〇丨;8)(其 促进氧化胁迫）、低剂量的多柔比星(D〇X〇，C)以及复制胁迫诱导的损伤(RS;D)。在暴露于诱 导细胞凋亡的胁迫水平如高剂量的D〇X〇(E)和高剂量的辐射（12Gy;F)的细胞中，NEAT1不被 显著诱导。
[0032] 图5.Neatl_旁斑在体内响应于致癌胁迫而形成。A-D:在DMBA/TPA处理后因致癌胁 迫所致的旁斑形成。用DAPI进行细胞核染色（蓝色），用Neatl的RNA-FISH对旁斑进行染色 (红色），并且，用角蛋白1对表皮的基底上层进行共染色（绿色）。白色虚线勾画出表皮的基 底膜。局部的DMBA处理后48小时，在正常表皮中观察不到旁斑(A)。在滤泡间上皮增生(B)、 表皮乳头状瘤（C)和分化性鳞状细胞癌（D)中，旁斑存在并且逐步地更丰富。E-Η:在 K19CreER KRasLSL-G12D基因小鼠模型中因致癌胁迫所致的旁斑形成（Lapouge等人， 2011)。用DAPI进行细胞核染色（蓝色），用Neatl的RNA-FISH对旁斑进行染色（红色），并且， 用角蛋白5对表皮的基底层和基底上层进行共染色(青色）。白色虚线勾画出表皮的基底膜。 示出对表皮的染色，他莫昔芬(Tamoxifen)施用后1周(E)，l个月(F)和2个月(G)，或者，他莫 昔芬施用后4个月(H)当出现表皮增生时。
[0033]图6.在暴露于两阶段化学诱导致癌方案的NeatlK0(-/_)小鼠中，肿瘤发展显著改 变。（A)DMBA/TPA处理8个月后，每只小鼠 （n = 31)的乳头状瘤的数量;显著性通过非配对双 尾t检验来确定。（B)在相同实验中具有鳞状细胞癌的小鼠的百分比(n = 31，p值0，0072，卡 方检验）（C)小鼠的代表性照片被示出。
[0034]图7 .对于原代细胞永生化来说Neatl是必需的。在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中， 当Nutlin3a暴露时诱导的Neatl表达(A)和按3T3方案复制传代的Neatl表达(B)。虽然在早 期传代中NeatlKO MEF的生长与野生型对照可比较(C)，与WT MEF形成对照，在晚期传代中 NeatlKO细胞进入细胞凋亡并且不能永生化（图7D-F)。由于MEF的永生化总是与p53途径的 失活相关，因此，该结果表明Neatl和p53可能是合成致死的。
[0035]图8.NEAT1KD降低人癌细胞系的细胞生存力。在一系列的癌细胞系中，Gapmer 4和 5(gap 4和5)被用于敲低所有NEAT1同种型的表达，并且Gapmer 6(gap 6)被用于特异性KD 长同种型的表达。转染gap4和5导致NEAT1表达有力减少(A)和旁斑形成(B)，以及诱导细胞 凋亡，如使用胱天蛋白酶3/7辉光测定(C)和通过FACS分析测量的。转染gap 4、gap 5和gap 6都显著降低MCF-7生长，如使用WST1测定来测量(D)。
[0036] 图9.NEAT1的敲低削弱HR和NHEJ DNA修复(A)，但是不削弱Alt-NHEJ或SSAWdC) 顶部子图显示用gapmer不同NEAT1同种型的有效KD，如通过相对RNA水平所示。SCR:乱序对 照。蓝条，所有的NEAT1同种型。绿条，长NEAT1同种型。下部子图显示，在将U20S细胞暴露于 低浓度的DNA损伤剂博莱霉素后，NEAT1KD细胞与对照细胞相比积累了更多损伤。该结果与 NEAT1KD细胞的降低的DNA损伤修复能力是一致的。
[0037] 图10 · NEAT 1KD导致MFF表达急剧降低。（A)该子图显示用gapmer不同的NEAT 1同种 型的有效KD，如通过转染后24小时和48小时的相对RNA水平所示。NIC:乱序对照（红条）； N1KD NEAT1_1和NEAT1_2KD(橙条）。0)在NEAT1KD后，在多种癌细胞系中的MFF mRNA相对表 达。该图显示MFF转录高度依赖于NEAT1表达。
[0038] 图11.在癌细胞中，NEAT1KD导致基础p53活性增加，以及使p53野生型癌细胞对p53 再激活疗法敏感。(A)蛋白质印迹显示，在暴露于Nutlin3a(在MCF7细胞中）之后，在NEAT1KD 细胞中P53功能加剧，并且因此nutlin-3a诱导的细胞凋亡增加-如通过PARP切割的增加来 示例-在NEAT1KD后。（B)在NEAT1KD细胞中，p53典型靶基因 p21的mRNA表达水平增加，尤其是 在暴露于Nutlin3a后;该数据证实了在这些实验条件下p53转录活性增加。
[0039] 图12.响应于低、慢性和/或致癌胁迫的NEAT1上调如何有助于癌前细胞的细胞存 活的模型。当暴露于相同胁迫时，由于线粒体缺陷和受损的DNA修复，缺乏NEAT1的细胞将死 亡。
[0040] 详细说明 [0041 ] 定义
[0042]本发明将针对具体实施例并参照某些附图来描述，但本发明不限于此，而是仅由 权利要求限定。权利要求中的任何参考记号不应被解释为限制范围。所描述的附图仅仅是 示意性的而非限制性的。在附图中，出于说明性的目的，一些要素的尺寸可能被夸大并且未 按比例绘制。当在本说明书和权利要求书中使用术语"包括"时，其并不排除其它要素或步 骤。当提到单数名词时，使用不定冠词或定冠词(例如"a"或"an"、"the"）的时候，这包括该 名词的复数，除非另外明确说明。
[0043]此外，说明书中和权利要求书中的术语第一、第二、第三等被用于区分相似要素， 而不一定用于描述顺序或时间顺序。应当理解，如此使用的这些术语在适当的情况下是可 互换的，并且，本文中描述的本发明的实施方案能够以不同于本文中所述或所示的其他顺 序操作。
[0044] 提供以下术语或定义仅为帮助理解本发明。除非在本文中明确定义，本文中使用 的所有术语都具有与对于本发明的领域中的技术人员来说相同的含义。关于本领域的定义 和术语，从业者可以具体参考Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第2版，Cold Spring Harbor Press，Plainsview，New York(1989);和Ausubel等人， Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47),John ffiley&Sons,New York(1999)。本文中提供的定义不应当被解释为具有比本领域普通技术人员所理解的更小 的范围。
[0045] 如本文中使用的术语"ΝΕΑΤΓ是指基因核旁斑组装转录物1(有时也称作核富集丰 富转录物1，并且先前有时称作TncRNA)，人类中的基因 ID: 283131，以及从该基因转录的 mRNA。由于它是非蛋白质编码基因，因此不存在蛋白产物。人类基因具有不同的转录物(或 剪接变体），其命名法并不完全一致。如本文中使用的，NEAT1_1是指Genbank登录号NR_ 028272(具有3756bp的转录物长度），术语NEAT1_2用于超过20kb的最长转录物(GenBank登 录号HG503867为22743bp，Ensembl中的转录物ID ENST00000501122(但在那里称作NEAT1_ 1)，或者，UCSC链接ucOlOrog. 2为21760bp)。其他报告的转录物包括例如GenBank登录号 HG503866(Ensembl中的转录物ID ENST00000499732(但在那里称作NEAT1_2)，其长度为 1745bp)，登录号EF177379(3729bp)，NEAT1_202(转录物ID ENST00000601801，1457bp)和 NEAT1_201(转录物ID ENST00000384994，100bp miRNA)。
[0046] NEAT1_1和NEAT1_2转录物两者都是lincRNA(大的基因间非编码RNA)。
[0047] 除非另外明确提及，术语NEAT1包括不同的同种型。NEAT1的片段也在预期之内，只 要它们是功能活性的（例如，如果它们能够形成旁斑）。根据具体的实施方案，NEAT1基因产 物是指一个或多个长转录物，特别是>20kb的转录物，其是旁斑的结构部分（即，特别是 ΝΕΑΤ1_2)〇
[0048] 关于NEAT1的"功能性表达"，是指功能性基因产物的转录和/或翻译。对于非蛋白 质编码基因如NEAT1，"功能性表达"可以在至少两个水平上下调。首先，在DNA水平上，例如， 通过缺失或破坏基因，或发生转录缺乏(在这两种情况下防止相关基因产物的合成）。转录 缺乏可以例如由表观遗传改变(例如DNA甲基化)或由丧失功能突变所引起。如本文中使用 的"丧失功能"或"L0F"突变是防止、降低或消除基因产物的功能的突变，与之相反，增加功 能突变赋予蛋白质增强的或新的活性。L0F可以通过范围广泛的突变类型所引起，包括但不 限于，缺失整个基因或部分基因，剪接位点突变，由小插入或缺失引起的移框突变，无义突 变，替换必要氨基酸的错义突变和阻止产物正确细胞定位的突变。同样包括在该定义内的 是NEAT1基因的启动子或调节区中的突变，如果这些干扰基因功能。无效突变是完全消除基 因产物功能的L0F突变。在一个等位基因中的无效突变通常将降低表达水平50%，但是对基 因产物的功能可能具有严重影响。需要注意的是，功能性表达也可以因增加功能突变而被 下调:通过赋予蛋白质新的活性，该蛋白质的正常功能被下调，并且表达更少的功能活性蛋 白质。
[0049]其次，在RNA水平上，例如通过发生缺乏有效翻译-例如由于mRNA的去稳定化（例 如，通过UTR变体)使得其在从转录物发生翻译之前被降解。或者通过缺乏有效转录，例如， 由于突变引入新的剪接变体。
[0050]如在本申请中关于特定蛋白质特别是肿瘤相关蛋白（例如p53状态，Myc状态)使用 的术语"状态"是指这些特定蛋白质的突变状态和/或表达。通常，该术语以"无关于"或"不 依赖于"状态的含义使用，这意味着观察到效应与特定蛋白质（例如，p53、Myc状态）的表达 水平或其中突变的存在无关。
[00511 如本文中使用的"长非编码RNA"（长ncRNA，lncRNA)是长于200个核苷酸的非蛋白 质编码转录物。IncRNA的一个特定类别是长的基因间ncRNA( 1 incRNA)，这是指从蛋白质编 码基因之间的非编码DNA序列转录的长非编码RNA。
[0052]如本文中使用的"实体肿瘤"或"肿瘤(neoplasm)"是指由于细胞的异常生长或分 裂所致的异常组织团。通常情况下，这些肿瘤是恶性的。该术语不包括血液肿瘤（白血病，淋 巴瘤，多发性骨髓瘤）。这些肿瘤的典型特征是表观遗传异常(染色体易位），这在实体肿瘤 中是罕见的。
[0053]如本文中使用的"上皮癌"是指源自上皮细胞的癌症。
[0054]如本文中使用的"DNA碱基切除修复酶的抑制剂"是指可以在DNA水平上(通过抑制 相关基因产物的形成，即通过防止或干扰转录）、在RNA水平上(通过中和或去稳定化mRNA以 防止或干扰翻译）或者在蛋白质水平上(通过中和或抑制参与BER的蛋白质）干扰基因产物 的碱基切除修复功能的物质。特别预期的是抑制剂是PARP抑制剂，因为这类抑制剂是良好 表征的。最特别预期的是PARP-1和/或PARP-2的抑制剂，因为这些酶是最活跃地参与BER的 PARP。然而，其他PARP的抑制剂也可能是有用的。在这方面，最近的出版物表明PARP抑制剂 iniparib(其是明确预期使用的）抑制非PARP-1和PARP-2的PARP，特别是PARP-5和PARP-6 (Ji J,Lee MP,Kadota Μ等人Pharmacodynamic and pathway analysis of three presumed inhibitors of poly(ADP-ribose)polymerase :ABT-888,AZD 2281, and BSI201.Proceedings of the 102nd Annual Meeting of the American Association for Cancer Research；201lApr 2-6；Orlando , Fla .AACR.2011. Abstract nr 4527； Maegley KA，Bingham P，Tatlock JH等人.All PARP inhibitors are not equal: an in vitro mechanistic comparison of PF_01367338to iniparib.J Clin Oncol.2011；29 (增干丨J;abstr el3576) ；Nagourney RA , Kenyon KR,Francisco FR 等人· Functional analysis of PARP inhibitors AZD 2281and BSI-201 in human tumor primary cultures: a comparison of activity and examination of synergy with cytotoxic drugs.J Clin 0ncol.2011;29(增刊；abs el3599))。
[0055]本申请是第一次表明，NEAT1表达在正常的、非转化的细胞中可以省却，但是其表 达对于癌细胞的存活是重要的。因此，抑制NEATllncRNA可用于在癌细胞特别是实体肿瘤细 胞最特别是上皮癌细胞中选择性地诱导细胞凋亡。
[0056]因此，本发明的一个目标是提供NETA1基因的功能性表达的抑制剂。这样的抑制剂 可以在DNA水平上起作用，或者在RNA(即，基因产物)水平上起作用。由于NEAT1是非编码基 因，因此对于该基因来说没有蛋白产物。
[0057]如果抑制是在DNA水平实现的，这可以使用基因治疗来敲除或破坏靶基因来完成。 如本文中使用的"敲除"可以是基因敲低或基因可以通过突变(如，点突变、插入、缺失、移框 或错义突变)来敲除，这可以通过本领域已知的技术进行，包括但不限于，逆转录病毒基因 转移。另一种可以敲除基因的方式是通过使用锌指核酸酶。锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指 DNA结合结构域与DNA切割结构域融合产生的人工限制酶。锌指结构域可以工程化以靶向期 望的DNA序列，其使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的独特序列。通过利用内源性DNA 修复机制，这些试剂可用于精确地改变高等生物的基因组。其他可用于敲除基因的基因组 定制技术是大范围核酸酶（meganuclease)和TAL效应子核酸酶（TALEN，Cellectis bioresearch) oTALEN?由与引入双链断裂(DSB)的核酸内切酶的催化结构域融合的用 于序列特异性识别的TALE DNA结合结构域组成。TALEN?的DNA结合结构域能够高精度 地靶向大型识别位点（例如17bp)。大范围核酸酶是序列特异性核酸内切酶，天然存在的 "DNA剪刀"，源自多种单细胞生物，如细菌、酵母、藻类和一些植物细胞器。大范围核酸酶具 有12和30个碱基对之间的长识别位点。天然大范围核酸酶的识别位点可以被修改以便靶向 天然基因组DNA序列（如，内源性基因）。
[0058]另一个最近的基因组编辑技术是CRISPR/Cas系统，该系统可用于实现RNA指导的 基因组加工。CRISPR是成簇的规律间隔的短回文重复的缩写，即，包含多个、短的、直接重复 的碱基序列的DNA基因座。Cas表示CRISPR相关基因。具有cas基因和专门设计的CRISPR区域 的质粒可用于在任何位置修改宿主基因组(Hale等人，Molecular Cell 45(3):292-302 (2012);Cong等人，Science 339(6121) :819-823(2013) ;Mali等人，Science 339(6121): 823-826(2013))。
[0059] 基因失活（即，抑制基因的功能性表达）也可以例如通过创建表达反义RNA的转基 因生物体或者通过将反义RNA施用给对象来实现。反义构建体可以被递送(例如作为表达质 粒被递送），当在细胞中转录时，其产生与细胞NEATllncRNA的至少一个独特部分互补的 RNA〇
[0060] 用于抑制基因表达的更快速的方法基于使用更短的反义寡聚物，所述更短的反义 寡聚物由DNA，或其他的合成结构类型组成，所述合成结构类型如硫代磷酸酯 (phosphorothiates)，2'-0_烷基核糖核苷酸嵌合体，锁核酸(LNA)，肽核酸(PNA)，或吗啉代 (morphol inos)。除了RNA寡聚物、PNA和吗啉代之外，在真核细胞中所有其他反义寡聚物通 过核糖核酸酶Η介导的靶向切割的机制起作用。PNA和吗啉代以高亲和力和特异性结合互补 DNA和RNA靶标，并因此通过对RNA翻译机构的简单空间阻碍起作用，并且似乎对核酸酶攻击 完全抵抗。"反义寡聚物"是指这样的反义分子或抗基因活性剂，其包含长度至少约10个核 苷酸的寡聚物。在实施方案中，反义寡聚物包含至少15、18、20、25、30、35、40或50个核苷酸。 反义方法包括设计与RNA互补的寡核苷酸(DNA或RNA，或它们的衍生物），所述RNA由NEAT 1的 多核苷酸序列编码。可以将反义RNA引入到细胞中以通过与互补mRNA碱基配对并物理阻碍 翻译机构来抑制互补mRNA的翻译。因此，这种效应是化学计量的。绝对互补性尽管是优选 的，但并不必需。如本文中所提到的，与RNA的一部分"互补"的序列是指具有足够的互补性 从而能够与该RNA杂交形成稳定双链体的序列;在双链反义多核苷酸序列的情况下，可以因 此检测双链体DNA的单链，或者可以测定三链体的形成。杂交能力将取决于互补性的程度和 反义多核苷酸序列的长度两者。通常，杂交的多核苷酸序列越长，其可以包含越多的与RNA 错配的碱基并仍形成稳定双链体(或三链体，视情况而定）。本领域的技术人员可以通过使 用标准程序查明错配的容许度，以确定杂交复合物的熔点。反义寡聚物的长度应为至少10 个核苷酸，并优选长度从15至约50个核苷酸范围的寡聚物。在某些实施方案中，寡聚物的长 度为至少15个核苷酸、至少18个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷 酸、至少35个核苷酸、至少40个核苷酸、或者至少50个核苷酸。一种相关方法使用核酶代替 反义RNA。核酶是具有酶样切割特性的催化性RNA分子，其可以设计成靶向特异性RNA序列。 已经报告了在小鼠、斑马鱼和果蝇中使用核酶成功使得靶基因失活，包括时间和组织特异 性基因失活。RNA干扰(RNAi)是转录后基因沉默的一种形式。RNA干扰现象首先观察并描述 于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中，其中外源性双链RNA(dsRNA)被显示通过诱 导靶RNA快速降解的机制特异性地和强有力地破坏含有同源序列的基因的活性。一些报告 描述了其他生物体中的相同催化现象，包括证明基因失活的空间控制和/或时间控制的实 验，包括植物（拟南芥（Arabidopsis thaliana))、原生动物（布氏锥虫（Trypanosoma bruceii))、无脊椎动物（黑腹果绳(Drosophila melanogaster))和脊椎动物物种(斑马鱼 (Danio rerio)和非洲爪蟾(Xenopus laevis))。序列特异性的信使RNA降解的介导物是由 核糖核酸酶ΠΙ从较长的dsRNA切割所产生的小干扰RNA(siRNA)。通常，siRNA的长度是20- 25个核苷酸之间(Elbashir等人(2001 )Nature 411,494 498) diRNA通常包含有义RNA链和 互补的反义RNA链，它们通过标准Watson Crick碱基配对相互作用（在下文中称作"碱基配 对"）退火在一起。有义链包含与祀mRNA内包含的靶序列相同的核酸序列。本发明siRNA的有 义链和反义链可以包含两条互补的单链RNA分子，或者可以包含这样的单个分子，其中两个 互补区碱基配对并通过单链"发夹"区域共价连接(经常称作shRNA)。术语"分离的"是指通 过人为干预从天然状态改变或移除。例如，天然存在于活的动物中的siRNA不是"分离的"， 但合成的s i RNA或与其天然状态的共存物质部分或完全分开的s i RNA则是"分离的"。分离的 siRNA可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，如，举例来说，其中 siRNA已被递送进入的细胞。
[0061] 本发明的siRNA可以包括部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA或重组产生 的RNA，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸从而与天然存在的RNA不同 的改变的RNA。这样的改变可以包括例如向siRNA的一个或多个末端或者向siRNA的一个或 多个内部核苷酸添加非核苷酸物质，包括使得siRNA对核酸酶消化具有抗性的修饰。
[0062] 本发明的siRNA的一条或两条链也可以包含3'突出。7突出"是指从RNA链的3'末 端延伸的至少一个未配对的核苷酸。因此，在一个实施方案中，本发明的siRNA包含至少一 个长度从1个至大约6个核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核苷酸），优选长度从1个至大约5 个核苷酸，更优选长度从1个至大约4个核苷酸，并且特别优选长度从大约1个至大约4个核 苷酸的3'突出。
[0063] 在其中siRNA分子的两条链均包含3'突出的实施方案中，每条链的突出的长度可 以相同或不同。在最优选的实施方案中，在siRNA的两条链上均存在3'突出，并且，长度为两 个核苷酸。为了增强本发明siRNA的稳定性，3'突出也可以稳定化从而抗降解。在一个实施 方案中，通过包含嘌呤核苷酸(如，腺苷核苷酸或鸟苷核苷酸)使突出稳定化。
[0064] 备选地，将嘧啶核苷酸替换为经修饰的类似物(例如，将3'突出中的尿苷核苷酸替 换为2'脱氧胸苷)是耐受的并且不影响RNAi降解的效率。特别地，2'脱氧胸苷中不存在2'羟 基显著增强3'突出在组织培养基中的核酸酶抗性。
[0065] 本发明的siRNA可以靶向任何靶NEAT1RNA序列(所述"靶序列"）中的大约19至25个 连续核苷酸的任何片段，其实例在本申请中给出。选择SiRNA的靶序列的技术在本领域中是 公知的。因此，本发明siRNA的有义链包含与祀mRNA中的大约19个至大约25个核苷酸的任何 连续片段相同的核苷酸序列。
[0066] 可以使用本领域技术人员已知的许多技术来获得本发明的s i RNA。例如，可以使用 本领域已知的方法化学合成或重组产生siRNA。优选地，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺 和常规的DNA/RNA合成仪化学合成本发明的siRNA^iRNA可以合成为两个独立的互补RNA分 子，或者合成为具有两个互补区的单个RNA分子。合成的RNA分子或合成试剂的商业供应商 包括 Prol i go (Hamburg，德国）、Dharmacon Res ear ch (Lafay ette，Colo.，USA)、Pierce Chemical (Perbio Science 的一部分，Rockford ,111.，USA)、Glen Re search (Sterling, Va.，USA)、ChemGenes(Ashland，Mass.，USA)和Cruachem(Glasgow，UK)〇
[0067] 备选地，也可以使用任何合适的启动子从重组的环状或线性DNA质粒表达siRNA。 用于从质粒表达本发明的siRNA的合适的启动子包括，例如，U6或H1RNA pol III启动子序 列以及巨细胞病毒启动子。其他合适的启动子的选择在本领域技术范围内。本发明的重组 质粒还可以包含用于在特定的组织中或者在特定的细胞内环境中表达siRNA的诱导型或可 调控启动子。从重组质粒表达的siRNA可以通过标准技术从培养的细胞表达系统分离，或者 可以在细胞内表达，例如在乳腺组织中或者在神经元中。
[0068] 本发明的siRNA也可以从重组病毒载体胞内表达。重组病毒载体包含编码本发明 的s i RNA的序列和用于表达s i RNA序列的任何合适的启动子。合适的启动子包括，例如，U6或 H1RNA pol III启动子序列以及巨细胞病毒启动子。其他合适的启动子的选择在本领域技 术范围内。本发明的重组病毒载体还可以包含用于在肿瘤所位于的组织中表达siRNA的诱 导型或可调控启动子。
[0069] 如本文中使用的，siRNA的"有效量"是足以导致RNAi介导的祀mRNA降解的量，或者 是足以在对象中抑制转移的进展的量。可以通过使用如上所述的分离和定量mRNA或蛋白质 的标准技术测量对象细胞中的祀mRNA或蛋白质的水平来检测RNAi介导的祀mRNA降解。
[0070] 通过考虑以下因素如对象的大小和重量;疾病渗透的程度;对象的年龄、健康和性 另IJ;给药途径；以及给药是局部性的还是全身性的，本领域技术人员可以容易地确定待施用 至给定对象的本发明的s iRNA的有效量。通常，本发明的siRNA的有效量包括从大约1纳摩尔 (nM)至大约100nM的细胞内浓度，优选从大约2nM至大约50nM，更优选从大约2.5nM至大约 10nM。考虑可以施用更大或更少量的siRNA。
[0071] 已经显示，在斑马鱼和青蛙中吗啉代反义寡核苷酸克服了核糖核酸酶H- competent反义寡核苷酸的局限性，后者包括许多非特异性作用，这归因于由核糖核酸酶Η 的低严格性要求所导致的对其他mRNA分子的非靶特异性切割。因此，吗啉代寡聚物代表了 重要的新型反义分子。本发明的寡聚物可以通过本领域中已知的标准方法来合成。例如，硫 代磷酸酯寡聚物可以通过Stein等人（1988)Nucleic Acids Res. 16,3209 3021的方法来合 成，甲基膦酸酯寡聚物可以通过使用可控孔径玻璃聚合物支持物来制备(Sarin等人(1988) Proc·Natl .Acad. Sci .USA. 85，7448-7451)。吗琳代寡聚物可以通过Summerton和Weller美 国专利号5，217，866和5，185，444的方法来合成。
[0072]反义RNA策略的另一种特殊形式是gapmerjapmer是嵌合的反义寡核苷酸，其包含 长度足以诱导核糖核酸酶Η切割的脱氧核苷酸单体的中心构件。Gapmer中心构件的侧翼是 2' -0修饰的核糖核苷酸或其他经人工修饰的核糖核苷酸单体的构件(如，桥接核酸(BNA))， 其保护内部构件免受核酸酶降解。Gapmer已被用于获得核糖核酸酶-Η介导的靶RNA切割，同 时降低硫代磷酸酯键的数量。与未经修饰的DNA相比，硫代磷酸酯拥有针对核酸酶的增加的 抗性。然而，它们具有若干缺点。这包括与互补核酸的低结合能力和与蛋白质的非特异性结 合，这导致毒性副作用，从而限制了它们的应用。毒性副作用的发生以及导致脱靶效应的非 特异性结合已经激励人们设计新的人工核酸，用于开发在体内提供有效的和特异性的反义 活性而不表现出毒性副作用的经修饰的寡核苷酸。通过招募核糖核酸酶H，gapmer选择性地 切割被靶向的寡核苷酸链。该链的切割引发反义效应。该方法已经被证明是抑制基因功能 的强有力的方法，并且正在成为用于反义治疗剂的流行方法。Gapmer可由商业提供，例如由 Exiqon提供的LNA?longRNA GapmeRs，或由Isis pharmaceuticals提供的MOE GapmersaMOE gapmers或"2'MOE Gapmers"是15-30个核苷酸的反义硫代磷酸酯寡核苷酸，其中所有的骨 架连接通过在非桥接氧上添加硫而修饰(硫代磷酸酯），并且，一段至少10个连续核苷酸的 片段保持未经修饰（脱氧糖），并且，其余的核苷酸在2'位置包含(/_甲基乙基取代 (M0E)。用于NEAT1抑制的示例性gapmer在实施例中列出。
[0073]根据另一个方面，提供NEAT1的功能性表达的抑制剂，用作药物。根据又一些方面， 提供NEAT1的功能性表达的抑制剂，用于治疗癌症，尤其是用于治疗实体肿瘤。在又一些实 施方案中，提供所述抑制剂，用于治疗上皮癌（carcinoma)(上皮癌症（epithelial cancer))〇
[0074] 上皮癌的典型例子包括，但不限于：上皮性肿瘤（I⑶8010-8045)，鳞状细胞肿瘤 (ICD 8050-8080)，如，鳞状细胞癌，基底细胞肿瘤（ICD 8090-8110)，如，基底细胞癌，移行 细胞癌（ICD 8120-8130)，腺癌（ICD 8140-8380)，如腺癌，皮革状胃（linitis plastic)，舒 血管肠肽瘤(vipoma)，胆管癌，肝细胞癌，腺样囊性癌，肾细胞癌，附件和皮肤附属物肿瘤 (ICD 8390-8420)，粘液表皮样肿瘤（ICD 8430-8439)，囊性、粘液性和浆液性肿瘤（ICD 8440-8490)，导管、小叶和髓质肿瘤（ICD 8500-8540)，腺泡细胞肿瘤（ICD 8550-8559)，以 及复杂的上皮性肿瘤（ICD 8560-8580)。
[0075] 上皮癌的器官位点的例子包括，但不限于，肺，乳房，前列腺，结肠和直肠，胰腺和 卵巢。
[0076] 根据备选的实施例，提供所述抑制剂，用于治疗以下癌症，所述癌症选自乳腺癌、 皮肤癌、骨肉瘤、结肠直肠癌和神经母细胞瘤的组。根据非常具体的实施方案，皮肤癌是非 黑色素瘤皮肤癌。根据另外的具体实施方案，皮肤癌选自BCC或SCC。
[0077] 根据非常具体的实施方案，预期治疗的癌症不是血液肿瘤。即，所述癌症不选自由 白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤组成的组。血液肿瘤(或液体肿瘤)通常特征在于染色体易 位，其不常在实体肿瘤中观察到，这导致不同的诊断和治疗模式。另外，由于这些肿瘤通常 循环，因此局部施用治疗困难得多。
[0078] 根据类似的实施方案，提供治疗有需要的对象中的癌症的方法，包括将NEAT1的功 能性表达的抑制剂施用给所述对象。在此，尤其预期的待治疗癌症是实体肿瘤。在又一些实 施方案中，提供治疗有需要的对象中的上皮癌的方法。待治疗的癌症如上所述。
[0079] NEAT1抑制剂的性质对于本发明来说不是至关重要的，只要它抑制NEAT1基因的功 能性表达即可。根据具体的实施方案，所述抑制剂选自抑制性RNA技术(如，gapmer、shRNA、 siRNA)、CRISPR、TALEN或锌指核酸酶。根据具体的实施方案，所述抑制剂被施加至或者被靶 向至癌细胞(如，实体肿瘤细胞）。
[0080] 根据备选的，但不是唯一的具体实施方案，抑制剂在癌细胞中选择性地诱导细胞 凋亡。这尤其意味着它在癌细胞中诱导细胞凋亡，但是不在正常的（非转化的）类似细胞中 诱导细胞凋亡。在这种情况下，"类似"意指来自相同组织或来源但是非转化的细胞，例如， 与上皮癌细胞相比的上皮细胞。
[0081] 根据另外的具体实施方案，抑制剂诱导细胞凋亡而不依赖于P53状态(例如，不依 赖于P53是否具有特定的突变)或不依赖于其表达水平。
[0082]虽然抑制NEAT1表达足以引起癌细胞的细胞凋亡（参见实施例部分），但是同样预 期了将NEAT1抑制剂与其他抗癌剂的组合治疗。由于NEAT1抑制干扰DNA修复途径(特别是同 源重组和非同源末端连接修复途径），因此与其他修复途径(如，碱基切割修复途径)的抑制 剂的组合是特别预期的。
[0083]因此，根据具体的实施方案，提供了DNA切除修复酶的抑制剂与NEAT1的功能性表 达的抑制剂的组合，用于在癌症的治疗中使用。同样地，提供了用于治疗癌症的方法以治疗 有需要的对象，其中将DNA切除修复酶的抑制剂与NEAT 1的功能性表达的抑制剂的组合施用 给所述对象。
[0084] 根据另一个方面，提供了鉴定肿瘤是否适合于用NEAT1的功能性表达的抑制剂治 疗的方法。这些方法通常具有以下步骤：
[0085] -确定在肿瘤中或者在肿瘤细胞的样品中NEAT1的表达是否增加；
[0086] -确立肿瘤是否适合于治疗，其中增加的表达提示治疗的适合性。
[0087] "确定表达"可以包括以下方法，如，检测或测量基因产物的存在，或者确定表达水 平，g卩，基因产物存在的（相对或绝对)量。确定表达可以定性地(g卩，样品中是否有表达)和/ 或定量地(确定表达的量或表达水平)进行。最典型地，表达将定量地进行，以便能够比较表 达水平。确定表达可以包括与阳性对照(例如用于评估基因产物是否能够在样品中检测，特 别是检测方法是否工作）、阴性对照或空白（通常用于评估是否无假阳性信号正在产生）、一 个或多个标准物（内标或外标，通常用于允许更准确的定量）、或者它们的组合进行比较。附 加地或备选地，阳性对照可以是内部阳性对照，通常是已知存在于样品中的基因产物(例如 用于评估基因产物是否能够在样品中检测，特别是检测方法是否工作或者基因产物是否确 实存在于样品中）。表达和/或活性的检测在本领域中是公知的，并且，本领域技术人员能够 选择合适的对照和/或标准物。
[0088]需要注意的是，确定NEAT1的存在或表达是指确定至少一个同种型的存在或表 达--明确预期，确定NEAT1的所有RNA同种型的总的存在或表达，或者确定一个或多个具 体RNA的存在或表达。
[0089]如所提到的，确定基因的量可以涉及与一个或多个对照或标准物进行比较。通常， 这将被完成以确立基因产物的水平是否改变，最特别地，是否升高。如本文中使用的，基因 产物的"改变的水平"可以意指基因产物的"升高的水平"或"降低的水平"，这通常对于对照 来评估。本领域技术人员能够挑选最相关的对照。例如，这可以取决于特别的基因产物，所 研究的癌症的性质，可获得的一个或多个样品，等等。合适的对照包括，但不限于，在无癌症 对象的细胞中的表达(任选地来自同一对象，当他/她仍然健康时），或者健康志愿者中的平 均基因产物水平的一组临床数据。也可以是人工产生的表达标准物，例如，如在"实时"定量 PCR中使用的。如从前述可以明显看出的，对照可以来自同一对象，或者来自一个或多个不 同的对象，或者源自临床数据。任选地，对照与例如性别、年龄等匹配。
[0090] 关于如本文中提及的基因产物的"升高的"水平，指比正常存在的更高的水平。通 常，这可以通过与对照比较来评估。根据特定的实施方案，基因产物的升高的水平是比对照 的那些高 10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90% 或甚至 100% 的水 平。根据另外的具体实施方案，它意指基因产物存在，而其在正常情况下(或在对照中）不存 在，或处于实际上不可检测的水平。换句话说，在这些实施方案中，检测特定基因产物的存 在相当于检测该基因产物的升高的水平。根据又一些具体实施方案，它意指基因产物存在， 而在大多数来自无肿瘤个体的细胞样品（作为对照）中不存在。本领域技术人员将理解，基 因产物需要比确切水平更高以便允许可靠的和可再现的诊断，所述确切水平可能取决于所 测试的肿瘤的类型、评估的是哪个同种型的水平以及这些水平的天然变异性。然而，评估升 高本身是相当简单的，因为它只需要常规技术。
[0091] 除了着眼于与具有正常水平的对照相比升高的水平，本领域技术人员将理解，也 可以完成替代方案，即，与具有高水平的对照(例如其中NEAT1高表达的肿瘤样品）比较。因 此，如果在细胞或细胞样品中测量的基因产物水平与从患有对用NEAT1抑制剂治疗敏感的 肿瘤的对象获得的合适"对照"的水平相似，这可以被视为相当于与阳性对照相比升高的基 因产物水平，并且关联于对用功能性NEAT1表达的抑制剂治疗的细胞敏感性。在其他情况 下，如果基因产物水平显著低于具有高水平NEAT1的对照的那些水平，这可以用于确立对用 DNA碱基切除修复酶的抑制剂治疗的不敏感性。
[0092] 对于与阳性对照或阴性对照相比的基因产物的"降低的水平"，关于基因产物的升 高的水平的考虑参照适用。当然，可以将基因产物水平与阴性对照和阳性对照两者进行比 车父，以便提尚诊断的准确性。
[0093]可以例如对NEAT1的降低的水平进行评估以监测NEAT1抑制的成功，以检查治疗是 否成功。
[0094]根据具体的实施方案，确定NEAT1的表达(或增加的表达)通过确定NEAT1的长同种 型的表达来完成。
[0095] 值得注意的是，由于NEAT1是旁斑的主要结构组分，确定NEAT1的表达可以通过评 估样品的细胞中的旁斑的存在和/或数量来完成。旁斑数量的增加相当于功能性NEAT1表达 的增加，反之，旁斑的减少(或不存在)提示NEAT 1的表达减少。
[0096]由于方法包括确定在癌中或在癌细胞的样品中NEAT 1的表达的步骤，因此该方法 可以包括提供癌细胞样品的第一步骤。所述确定步骤可以完全在体外发生，即，没有在人体 或动物体上相互作用的步骤。
[0097]根据具体的实施方案，癌是实体肿瘤。根据备选的实施方案，肿瘤是上皮癌。根据 另外的备选实施方案，所述癌选自乳腺癌、皮肤癌、骨肉瘤、结肠直肠癌和神经母细胞瘤。 [0098]根据具体的实施方案，当确立了肿瘤适合于治疗时，方法可以进一步包括将NEAT1 的功能性表达的抑制剂施用给其中存在肿瘤的对象的步骤。这是为了治疗肿瘤。
[0099] 如已经提到的，NEAT1的表达水平可以在施用抑制剂之后进行监测，以检查NEAT1 的功能性表达是否降低(通常与治疗前的情况比较）。这可以与治疗的成功相关联。
[0100]根据备选的具体实施方案，方法可以包括施用NEAT1的功能性表达的抑制剂和碱 基切除修复酶的抑制剂(如，PARP抑制剂)的组合的步骤。
[0101]应当理解的是，尽管在本文中关于根据本发明的细胞和方法已经讨论了具体的实 施方案、特定的配置以及材料和/或分子，然而可以在形式和细节上做出各种变化或修改， 而不脱离本发明的范围和精神。提供以下实施例以更好地说明具体的实施方案，并且，它们 不应当被认为是限制本申请。本申请仅由权利要求限定。 实施例
[0102] 实施例1.NEAT是p53的直接靶基因，并且，它在不同的细胞类型中被诱导
[0103] 通过进行RNAseq和ChIPseq分析，NEAT1被确认为p53的直接靶基因（图1)。
[0104]用Nutlin3A(p53的主要负调节物MDM2的特异性拮抗剂)处理乳腺癌细胞系MCF-7， NEAT1 (并且，特别是长同种型NEAT1_2)的转录被上调，如由RNA-seq峰的增加的强度所示出 (在图1中为蓝色）。该上调是通过将P53募集至NEAT1启动子所介导的，如由p53-ChIP-seq峰 的增加的强度所示出（图1中的绿色）。
[0105] 在其他几个细胞系中评价了Nut 1 in3A对NEAT 1表达的影响，包括U20S (骨肉瘤，图 2A)、A459(肺癌，图2B)、人ES细胞（图2C)以及永生化人成纤维细胞系(BJ，图2D)。将p53的靶 基因 P21用作对照，因为这应该会通过Nutlin3A暴露而被上调。可以表明，在这些不同的细 胞系中，Nut 1 in3A确实诱导了NEAT 1的表达。两种同种型均受影响，其中对于较长的同种型 (NEAT1_2)来说作用更强。
[0106] 接着，评价了这种效应是否是P53依赖性的。通过shRNA(p53shRNA序列： GACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTT; SEQ ID NO: 1)敲低MCF-7中 的P53消除了NEAT1的上调，提示Nutlin介导的NEAT1诱导确实是p53依赖性的（图2F)。在神 经母细胞瘤细胞系中得到了类似的结果(NGP;图2G)。
[0107] 因此，NEAT1的诱导是p53依赖性的，并且不限于乳腺癌细胞系。
[0108] 为了在NEAT的不同同种型之间进行区分，使用下述策略。所有qPCR标记的NEAT1或 NEAT1_1用靶向+/-2200bp区域的引物实现。这样标记的敲低探针也靶向2000和3756bp之间 的区域。所使用的RNA-FISH探针组由靶向区域l-3756bp的一大组寡核苷酸构成。引物和敲 低探针标记的NEAT1_2(长转录物)靶向+/-21300bp区域。RNA-FISH探针(仍然是一组寡核苷 酸)靶向来自3800-11700bp的部分以避免检测较短同种型。
[0109] 用于抑制NEAT1的gapmer如下：
[0110] NEATl-Gapmer4GACGTAACAGAATT(SEQ ID NO:2)
[0111] NEATl-Gapmer5TAAGCACTTTGGAAAG(SEQ ID NO:3)
[0112] NEATl-Gapmer6CTCACACGTCCATCT(SEQ ID NO:4)
[0113] Gapmer 4和5抑制NEAT1的长同种型和短同种型两者，gapmer 6特异于长同种型。
[0114] 响应于Nutlin的NEAT1诱导可见于结肠直肠癌细胞系HCT116,但不可见于同基因 的p53K0 HCT116细胞系（图2E)，再次证实nutlin诱导的NEAT1表达是p53介导的。p53-Neatl 途径在小鼠中同样是保守的，因为Nutlin在早期传代(P3)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中诱 导表达Neatl(未示出）。
[0115] NEAT1受Nutlin的上调还具有功能性的后果:Nutlin在MCF-7细胞中诱导旁斑形成 (图 3)。
[0116] 在Nutlin暴露后，在MCF-7的细胞核(蓝色;DAPI染色）中通过RNA-FISH检测到旁斑 (红色）；当NEAT1 (两种同种型或仅长同种型)被抑制时，该效应剧烈减弱（图3,用gapmer 4 或6处理的图像）。未处理的（NT)或Nutlin-3a处理的细胞的旁斑相对数量/细胞示于图3B。 用p53shRNA处理的MCF-7细胞中的类似观察再次证实了这种诱导是p53依赖性的（数据未示 出）。因此，p53在这些细胞中刺激旁斑的形成。
[0117]在永生化人二倍体成纤维细胞系BJ中已经得到了类似结果(数据未示出）。用LNA- gapmer 4和6(两者均靶向NEAT1)转染细胞同样减少了旁斑的形成，这证实了先前的研究， 所述先前的研究表明旁斑形成依赖于NEAT1的表达。
[0118] 实施例2.NEAT1由不同形式的低和/或慢性胁迫诱导，但不由高胁迫诱导
[0119] 我们的数据表明，尽管观察到响应于低/慢性胁迫水平的明显的p53依赖性NEAT1 诱导和旁斑形成，但是未见到响应于急性胁迫水平的诱导（图4)。
[0120] 在不同的低慢性胁迫条件下NEAT1上调：；其在响应于暴露至极光激酶抑制剂AZD 而经历衰老的黑色素瘤细胞Mel 501中诱导（图4A);在BJ细胞中，它响应于通过将该细胞暴 露于鱼藤酮所导致的氧化胁迫而被诱导（图4B);在Wi38(肺成纤维细胞)细胞系中，它还响 应于低剂量的多柔比星而被诱导（图4C)，以及在复制胁迫(RS)期间被诱导（图4D);并且，当 传代培养时，小鼠 Neatl在MEF中被诱导(数据未示出）。已经显示，p53在传代期间在MEF中作 为对升高的氧化胁迫水平的响应被而诱导，所述升高的氧化胁迫水平由在含氧量正常的条 件下培养所述细胞所产生。顺便提一下，NEAT1还被发现在着色的/增厚的表皮角化细胞(一 种上皮细胞类型）中上调(未示出）。这与由UV辐射所引起的慢性胁迫一致。
[0121] 值得注意的是，NEAT1表达的诱导仅响应于低剂量的多柔比星而发生，但不显著响 应于较高剂量(5μΜ，图4E)。对于暴露于高剂量的辐射的细胞来说，同样如此(图4F)。
[0122] 除了低和慢性胁迫，还通过用DMBA/TPA( 7，12-二甲基苯并[a]蒽和12-0-十四酰佛 波醇-13-乙酸酯)作为致癌物进行处理来评价致癌胁迫的效应(图5)。
[0123] 实施例3. NEAT1K0小鼠的产生表明它们没有重大的生长缺陷
[0124] 为了检查NEAT1和旁斑在体内的生理作用，产生了缺乏Neatl的小鼠。与早先的报 告(Nakagawa等人，2011) -致，Neatl敲除(K0)的小鼠是有生存力的并且没有立即的明显表 型。然而，我们观察到青春期乳腺分枝化形态发生中的缺陷以及怀孕期间小叶肺泡发展和 泌乳能力的减弱(数据未示出）。关于这项工作的完整说明，参见Standaert等人，RNA，2014。
[0125] 实施例4. NETA1抑制选择性地影响癌细胞的存活，但是不影响正常细胞的存活
[0126] 虽然NEAT1K0小鼠不显示明显的生长缺陷，在暴露于两阶段化学诱导致癌方案 (DMBA/TPA)的NeatlK0(-/_)小鼠中，肿瘤发展显著改变:在该模型中，NEAT1抑制导致显著 较少的乳头状瘤形成（图6)。杂合(NEAT1+/-)小鼠显示中间表型。
[0127] 为了进一步研究Neatl的丧失对细胞生长和存活的影响，我们将NEAT1K0 MEF外植 在培养物中。这些细胞在早期传代中未显示整体的生长缺陷，并且进入衰老，就像它们的WT 对应物一样。然而，值得注意的是，NeatlKO细胞最终死亡(在培养许多代之后）并且不能永 生化，这与WT MEF形成对照（图7)。这表明NEAT1在慢性胁迫培养条件下具有促存活作用，并 且表明，当细胞积累可能的永生化/转化突变时，NEAT1的抑制诱导细胞凋亡。由于MEF的永 生化总是与P53途径的失活相关，因此，该结果表明Neatl和p53可能是合成致死的。
[0128] 为了进一步延伸在NETA1K0小鼠中观察到的抗致癌作用，在不同的癌细胞中使用 LNA-gapmer抑制NEAT1。这些不同的gapmer可以有效地敲低NEAT1 (长同种型和短同种型两 者（gap 4，gap 5)，或者仅长同种型（gap6))。这些gapmer的KD效率示于图8A和9C。可以显 示，在不同的癌细胞类型中，NEAT1KD诱导旁斑（图8B)，减少细胞生存力并且诱导细胞凋亡， 如通过增加的胱天蛋白酶3和7活性和FACS分析所确定的（图8C)。癌细胞的代谢活性受到严 重影响，因此生长也受到严重影响（图8D)。关于U20S细胞，观察到细胞从它们的塑料支持物 脱落(数据未示出）。
[0129] 实施例5.NEAT1抑制损害DNA修复途径和线粒体分裂，以及使癌细胞对p53再激活 疗法敏感
[0130] NEAT1诱导的细胞存活背后的可能机制之一是DNA修复的激活。因此，评价了 NEAT1 抑制对DAN修复途径的作用。我们发现，NEAT1的敲低损害HR和NHEJ DNA修复（图9A)，但是不 损害Alt-NHEJ或SSA修复（图9B)。因此，非抑制的、碱基切除修复(BER)途径的附加抑制将引 起合成致死。
[0131]为了证实NEAT1抑制干扰DNA修复的假设，将U20S细胞暴露于不同浓度的DNA损伤 剂博莱霉素。在NEAT1抑制的细胞中，DNA损伤（如通过γ H2AX强度来测量)确实增加了（图 9C，最后三幅子图）。因此，在NEAT 1KD细胞中，DNA修复被严重损害了。值得注意的是，最长的 转录物与较短形式相比表达少大约8倍，因此，我们预期，当用NEAT1引物检测表达时， NEATl_2gapmer不会导致KD，这是因为gapmerNEATl_2的KD效率大约是50% (NEAT1 = hNeatl ；NEATl_2 = hNeatl_2) 〇
[0132] 在NEAT 1抑制时所观察到的细胞凋亡效应背后可能的另一种机制是线粒体缺陷， 因为NEAT1和相关的旁斑控制线粒体动力学。可以观察到NEAT1抑制导致MFF(线粒体分裂因 子)表达的显著降低（图10)。
[0133] 此外，NEAT1KD导致基础p53活性的增加，如通过蛋白质印迹（图11A)和通过诱导 P53转录活性（图11B)所显示的。
[0134] 因此，提出这样的模型（图12)，其中NEAT1通过响应于低/慢性胁迫或致癌胁迫而 抑制正常的线粒体分裂、DNA损伤和p53,从而有助于细胞存活（例如，癌前细胞的细胞存 活）。响应于这些胁迫条件的Neatl的丧失严重损害癌前细胞的生存力。
[0135] 参考文献
[0136] Nakagawa S,Naganuma T , Sh i o i G,Hirose T . Paraspeckles are subpopulation-specific nuclear bodies that are not essential in mice.J Cell Biol.2011；193(l):31-9.
[0137] Standaert L，Adriaens C，Radaelli E，Van Keymeulen A，Blanpain C，Hirose T,Nakagawa S，Marine JC.The long noncoding RNA Neatlis required for mammary gland development and lactation.RNA.2014Dec；20(12):1844-9.
【主权项】
1. NEATl的功能性表达的抑制剂，其用作药物。 2. NEAT 1的功能性表达的抑制剂，其用于治疗癌症，特别是实体肿瘤。3. 权利要求2的抑制剂，其中实体肿瘤是上皮癌。4. 权利要求2的抑制剂，其中实体肿瘤选自乳腺癌、皮肤癌、骨肉瘤、结肠直肠癌和神经 母细胞瘤的组。5. 权利要求1至4中任一项的抑制剂，其选自 指核fe酶。6. 根据权利要求2至5中任一项的抑制剂，其在癌细胞中选择性地诱导细胞凋亡。 7. DNA碱基切除修复酶的抑制剂与NEATl的功能性表达的抑制剂的组合，所述组合用于 治疗癌症。8. 权利要求7的组合，其中DNA碱基切除修复酶的抑制剂是PARP抑制剂。9. 治疗对象中实体肿瘤的方法，包括将NEATl的功能性表达的抑制剂施用给有需要的 对象。10. 权利要求9的方法，还包括施用DNA碱基切除修复酶的抑制剂。11. 鉴定适合于用NEAT 1的功能性表达的抑制剂治疗的实体肿瘤的方法，包括： -确定在肿瘤中或者在肿瘤细胞的样品中NEATl的表达是否增加； -确立肿瘤是否适合于治疗，其中增加的表达提示治疗的适合性。12. 根据权利要求11的方法，其中肿瘤是上皮癌。13. 根据权利要求11或12的方法，其中评价NEAT 1的长同种型的表达。14. 根据权利要求11至13中任一项的方法，其中通过确定旁斑的存在来评价NEAT 1表 达。15. 根据权利要求11至14中任一项的方法，还包括将NEATl的功能性表达的抑制剂施用 给其中存在肿瘤的对象的步骤。
【文档编号】C12N15/113GK105960459SQ201580007520
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2015年2月9日
【发明人】J-C·马林, L·斯坦德尔特
【申请人】非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所, 天主教鲁汶大学研究发展中心