一种布鲁氏菌l7/l12蛋白抗原表位多肽及其应用
【专利摘要】本发明公开一种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽及其应用。本发明的多肽是：其氨基酸序列中含有SEQ ID N0.1，或SEQ ID N0.1所示的序列经过一个或/和几个氨基酸残基的取代和/或缺失形成的序列形成的多肽，也可以是氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示的序列和添加有具有布鲁氏菌免疫源性功能的衍生的多肽。本发明的SEQ ID N0.1多肽可以构成的重组载体或表达盒或转基因细胞或重组菌。而本发明所涉及的各多肽可在制备诊断或预防或治疗布鲁氏菌引起的疾病的试剂或药物中的应用。本发明筛选多肽为化学合成，经刺激DC后可释放出高浓度的IL?4，可作为目的抗原检测检测布鲁氏菌病感染的血清，或制备L7/L12蛋白单克隆抗体的抗原。
【专利说明】
一种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种多肽，特别是一种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 布鲁氏菌(Brucella)，革兰氏阴性兼性细胞内寄生菌，是严重的人兽共患病，广泛 感染家畜、野生动物和人，家畜动物布鲁氏菌主要感染羊、牛和猪，其中对人致病的主要有 马耳他布鲁氏菌和流产布鲁氏菌;布鲁氏菌病感染家畜引起公畜的附睾炎和怀孕家畜的流 产、胎盘炎症和不育;对于人类，布鲁氏菌病课引起急性炎症和许多类似流感感染的症状， 包括波浪热、多汗、背疼和体质虚弱，在一些病人身上，急性临床症状可持续一年以上最终 导致慢性的持续性感染，慢性临床症状包括不规则的发热、关节疼、乏力，并发引起关节炎、 区部末梢神经炎症、脊柱炎、骨髓炎和粘液囊炎，布鲁氏菌病的流行不仅危害着畜牧业的发 展，造成了巨大的经济损失，而且严重威胁着人类的健康和公共卫生安全。
[0003] 目前，全世界用于预防布鲁氏菌病的有效疫苗均为减毒的活疫苗，各种疫苗的使 用不仅干扰着疫苗免疫和自然感染的鉴别诊断，而且所有的疫苗株不同程度的对人有致病 毒力，甚至有些疫苗对人为强致病力，安全可靠的灭活疫苗研究效果差，不能起到免疫保护 作用。基因工程疫苗的研究近几十年来一直被全世界研究人员所关注和努力，但由于布鲁 氏菌本身免疫抗原多样化，结构复杂，未能发现可用于田间试验的疫苗抗原，寻找存在于各 种布鲁氏菌种间保守存在且具有很好免疫功能的蛋白，研制预防保护力高的亚单位疫苗是 解决这一问题的有效办法。
[0004] 现有技术中大多数表达工具只能表达一种蛋白，而布鲁氏菌存在多种与免疫相关 的蛋白，研究表明单个蛋白的表达不能形成有效的保护疫苗用抗原，表达制备多个防控作 用的亚单位疫苗成本高，且组合成分复杂；而决定免疫蛋白功能的成分是位于蛋白上微小 的抗原决定簇，对免疫相关蛋白免疫抗原表位的挖掘和鉴定，可以有效的提取布鲁氏菌中 有效的免疫抗原成分，同时也对蛋白的结构和功能研究提供直接的指导，表位抗原成分的 确定，可为检测、预防或治疗能提供良好的抗原组分。因此筛选获得免疫蛋白上这些抗原决 定簇多肽为解决现有技术存在的不足提供了一种思路和途径。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽及其用途。
[0006] 本发明的布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽氨基酸序列中含有SEQ ID N0.1。 [0007]本发明的布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽可以是其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1 所示的序列经过一个或/和几个氨基酸残基的取代和/或缺失形成的序列形成的多肽，也可 以是氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的序列和添加有具有布鲁氏菌免疫源性功能的衍生的 多肽。
[0008] 由序列SEQ ID NO. 1可以构成的重组载体或表达盒或转基因细胞或重组菌。
[0009] 而本发明所涉及的各多肽可在制备诊断或预防或治疗布鲁氏菌引起的疾病的试 剂或药物中的应用。
[0010] 由序列SEQ ID NO. 1可以形成一种用于治疗或预防布鲁氏菌的药物组合物。
[0011] 布鲁氏菌L7/L12蛋白是核糖体的组成部分，辅助核糖体与GTP包裹转录因子发生 作用，使转录精确发生，研究证明L7/L12蛋白与布鲁氏菌免疫相关，是布鲁氏菌基因工程疫 苗的候选抗原。本发明利用生物信息学的手段，对布鲁氏菌L7/L12免疫蛋白氨基酸的组成 和功能进行分析，并模拟构建出蛋白的高级结构模型，综合上述结果发掘出的蛋白上潜在 的具有免疫功能的抗原多肽，化学合成这些多肽后，通过实验验证手段最终获得功能多肽， 制备出的布鲁氏菌L7/L12免疫蛋白多肽为布鲁氏菌病的检测、疫苗、防控提供新的思路，这 也对于提高我国动物布鲁氏菌病的防治技术水平，保证养殖业健康发展、提供农牧民收入、 保证公共卫生和畜产品安全同样具有重大的社会效益。
[0012] 本发明的有益效果为：1)本发明筛选多肽为化学合成，而不是活的布鲁氏菌上提 取，因此在生产过程中完全避免了人为的制毒、散毒等安全隐患。2)本发明采用生物信息学 工具与试验验证相结合筛选抗原多肽，缩小的筛选抗原多肽的范围，提高了筛选效率。3)本 发明在树突状细胞上筛选抗原多肽，由于树突状细胞具有强大的抗原加工和递呈能力，结 果更为接近于动物模型。4)本发明所获得的多肽能与布鲁氏菌病阳性血清发生反应，故该 重组蛋白可作为目的抗原检测检测布鲁氏菌病感染的血清，如ELISA方法等。5)本发明所表 达的目的蛋白，可直接用于制备L7/L12蛋白单克隆抗体的抗原。
【附图说明】
[0013]图1是本发明实施例的树突状细胞培养图。
[0014] 图2是本发明流式细胞仪检测树突状细胞的表型结果。
[0015] 图3是本发明得到的多肽作用树突状细胞后IL-2的分泌量;样本依次为1-5:多肽， 与实施方法中列出的多肽顺序相对应，6:已知抗原表位对照;7:阴性对照。
[0016] 图4是本发明得到的的多肽作用树突状细胞后IL-4分泌量;样本依次为1-5:多肽， 6:已知抗原表位对照;7:阴性对照。
[0017] 图5是本发明得到的多肽作用树突状细胞后IFN-y分泌量;样本依次为1-5:多肽， 6:已知抗原表位对照;7:阴性对照。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
[0019] 一、实验材料的制备 1)抗原表位多肽的获得 用生物信息学软件对布鲁氏菌L7/L12蛋白氨基酸的组成、性质以及其高级结构进行分 析，结合所有结果，挖掘获得可能具有免疫原性的五个多肽片段，并委托南京金斯瑞生物科 技有限公司合成，得到各多肽序列如下： (I)LAKIVEDLSALTVLEAAELSKLL(SEQ ID从).2，在后述的内容中为多肽样本1); (|)1爾11^￥1^1^61^〇^41(0以5￡0 10从).4，在后述的内容中为多肽样本3); (|)￡六1(01^￡6六?1^￥1^6六51(0￡六￡1(11^(5￡〇10勵.5，在后述的内容中为多肽样本4); g:.KIKAQLEAAGAKVELK(SEQ ID N0.1，在后述的内容中为多肽样本5)。
[0020] 在下述的内容中多肽样本的次序按 2 )小鼠骨髓源树突状细胞(DC)的培养 颈椎脱位法处死Babl/c小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。 用lml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养 皿中，每根骨头反复4~6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpmXlO min。弃去 上清，加入5 ml无菌Tris-NH4C1溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞 后，再次离心，1500 rpmX5 min，弃上清。用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基 悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。将细胞培养板放入37°C，含5% C02的孵箱中培养48~72小时。 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。加入新鲜的完全培养基 及相同浓度的rmGM-CSF，继续培养至第5天。半量换液，并补足rmGM-CSF;尽量保留悬浮细 胞。继续培养至第7天，用吸管轻轻吹打后收集所有悬浮细胞，得到富集的小鼠骨髓来源的 树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cell, BMDC)，经在显微镜下观察期形态符 合骨髓源树突状细胞的特征，参见附图1;流式细胞仪检测其表型结果表明，细胞表面CDnc 抗体达到70%以上，证明培养树突状细胞高达70%以上，能满足实验要求结果参见附图2。
[0021] 3)多肽与DC的相互作用 收集培养7天的DC，计数，调整到1 X 105细胞/ml浓度，将细胞按每孔500ul接种培养与 48孔细胞培养板，细胞培养体系中分别加入合成的各多肽，终浓度为10ng/ml。每个多肽做3 个平行对照，同时用已经鉴定的多肽刺激细胞培作为阳性对照，以没刺激的细胞培养为空 白对照，作用30小时后，收集细胞培养上清，-80°C保存，以备做芯片检测。
[0022] 4)细胞培养上清细胞因子的芯片操作流程 本发明的检测选用RayBiotech公司的Quantibody Mouse Cytokine Array 1试剂盒， 按其操作说明完成。其具体操作如下： 泛）每个孔中加 l〇〇yl的样品稀释液，室温摇床上孵育30min，封闭定量抗体芯片检测 孔。抽去每个孔中的缓冲液，添加1 〇〇y 1的标准液(试剂盒提供的标准液)和被检样品（即细 胞培养上清)到孔中，4°C过夜孵育。
[0023] g請洗 抽去每个孔中的标准品或样品，1 X洗液I清洗3次，每次10min室温摇床震荡，每孔150y 1的1 X洗液I，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20 X洗液I。抽去每个孔中的1 X洗 液I，加入1 X洗液II清洗3次，每次5min室温摇床震荡，每孔150y 1的1 X洗液II，每次清洗 要抽干净洗液，用去离子水稀释20X洗液11(所有试剂由试剂盒提供）。
[0024] 義检测抗体混合物的孵育 离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。 添加80yL的检测抗体(即由试剂盒提供的实验要检测的标准抗体)到每个孔中，RT摇床上孵 育1.5小时。抽去每个孔中的检测抗体，1 X洗液I清洗3次，每次10min室温摇床震荡，每孔 150y 1的1 X洗液I，每次清洗要抽干净洗液，然后加入1 X洗液II清洗3次，每次5min室温摇 床震荡，每孔150y 1的1 X洗液II，每次清洗要抽干净洗液。
[0025] ? Cy3_链霉亲和素的孵育 离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。 添加80yl的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箱纸包住玻片避光孵育，RT摇床上孵育1个小 时。抽去每个孔中的Cy3-链霉亲和素，1 X洗液I清洗3次，每次lOmin室温摇床震荡，每孔 150yl的1 X洗液I，每次清洗要抽干净洗液。，然后加入1 X洗液II清洗3次，每次5min室温 摇床震荡，每孔150y 1的1 X洗液II，每次清洗要抽干净洗液。
[0026] (g)荧光值定量检测细胞因子 将固定芯片的玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。采用激光扫 描仪InnoScan 300用Cy3或者绿色通道(激发频率=532nm)扫描信号。采用QAM-CYT-1的数据 分析软件来进行数据分析，分析所得数据见图3、图4、图5。
[0027]二、多肽的活性功能鉴定 样本细胞因子的芯片检测 多肽与DC作用后的培养上清为样本，10倍稀释后加入包被完好的细胞因子检测芯片， 作用30分钟后显色，置于检测仪器先对不同细胞因子显色扫描，获取发光强度值。同时做已 知阳性多肽和空白对照，并用标准品做定量对照，绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样本 中细胞因子的量，进行具体检测实验，其中与B细胞和T细胞多肽相关的因子有IL-2、IL-4和 IFN- y 〇
[0028] 1)IL_2 分析 IL-2即白细胞介素-2(interleukin-2，IL_2)，又名T细胞生长因子（T cell growth factor，TCRF)。主要由活化的⑶4+Thl细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子。可促进 ThO和CTL的增殖，故为调控免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。能活 化T细胞，促进细胞因子产生；刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK 细胞产生;促进B细胞增殖和分泌抗体;激活巨噬细胞。IL-2的主要生理作用是刺激和维持T 细胞的分化增殖。因此，多肽与DC刺激后释放IL-2的水平反应其多肽活化T细胞免疫反应的 能力，是评价T细胞多肽的重要指标。具体的检测结果参见附图3。经检测结果表明，阳性对 照多肽刺激后释放IL-2的浓度为2. lpg/ml，而受试各样本的多肽组多肽刺激后并不能释放 IL-2〇
[0029] 2)IL_4 分析 细胞介素_4(白介素-4，Interleukin-4，IL-4)是II型辅助T细胞(Th2细胞)分泌的细 胞因子。白细胞介素-4的生物作用，包括刺激活化B细胞和T细胞增殖、CD4+T细胞分化成II 型辅助T细胞.它也在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用。白细胞介素-4诱导B细胞 抗体类别转换向IgE，为B细胞生长因子-1 (B cell growth factor-1，BCGF-lhIL-A促进 B细胞MHCII类抗原、FceRII /⑶23和⑶40的表达，并增强B细胞提呈抗原能力，使免疫系统对 小量抗原刺激发生免疫应答。促进巨噬细胞提呈抗原和杀伤肿瘤细胞的功能，可能与调节 MHCII类抗原和FcR表达有关。IL-4与GM-CSF、IL-3和LPS有协同作用。IL-4可诱导外周血单 核细胞分泌G-CSF和M-CSF，增强中性粒细胞介导的吞噬、杀伤活性和ADCC作用。因此，IL-4 分泌水平是评价多肽B细胞免疫反正能力的重要指标。检测结果参见图4,表明：阳性对照多 肽刺激后释放IL-4的浓度为11.3pg/ml，虽然各受试样本多肽组多肽刺激后均可释放IL-4， 但仅受试样本5的多肽刺激DC后释放IL-4的浓度高达40pg/ml，与阳性对照比差异显著(p〈 0.001 )，其余各样本与阳性对照比差异不显著。
[0030] 3)IFN-y 分析 干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面 受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制，其类型分为三类，a-(白细胞） 型、0-(成纤维细胞)型，y-(淋巴细胞)型；y -干扰素（Interferon-y，IFN-y )是水溶性 二聚体细胞因子，是II型干扰素的唯一成员。最初叫巨噬细胞活化因子。IFN-Y是I型辅助 T细胞(Thl细胞)的标志性的细胞因子。II型辅助T细胞(Th2细胞)释放白细胞介素-4 (IL- 4)和白细胞介素-13 (IL-13)。自然杀伤细胞和⑶8T细胞也产生y-干扰素。y-干扰素通 过迅速降解RANK-RANKL信号通路的TRAF6而抑制破骨细胞形成。多肽刺激DC后y -干扰素释 放水平与T细胞的活化呈正相关，通过Y -干扰素的检出通常来评价多肽是否为T细胞免疫 多肽。检测结果见图5,表明：阳性对照多肽刺激后释放IFN-y的浓度为20.2pg/ml，而受试 各样本多肽组多肽刺激后不能释放IFN-Y。
[0031]以上实验表明利用蛋白芯片检测刺激后细胞分泌IL-2、IL-4和IFN-Y的水平如图 3-图5，统计学分析检测结果，发现从该蛋白上筛选合成的多肽与DC相互作用后，只有与本 发明的序列SEQ ID NO. 1的多肽作用可产生大量的IL-4分泌，从而获得B细胞表位 KIKAQLEAAGAKVELK。通过本发明对相应蛋白表面抗原表位的挖掘，对研究该蛋白的免疫学 功能有重要的意义，另一方面，有效的抗原表位除去了蛋白上繁杂的非抗原决定簇，可以集 中生产大量有效的抗原表位来用作疾病的诊断和疫苗的开发，是疫苗用良好候选抗原;从 蛋白上挖掘出有效的B细胞表位，本身就是一种良好的疾病用诊断抗原，可以用于ELISA等 血清学方法的建立，其敏感性要高于蛋白抗原本身，而筛选出了表位多肽可以用的单克隆 抗体的制备。这一结果说明SEQ ID NO. 1衍生的多肽将可在制备诊断或预防或治疗布鲁氏 菌引起的疾病的试剂或药物中的应用，且其本身可以用于制备重组载体或表达盒或转基因 细胞或重组菌。
【主权项】
1. 一种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽，其特征在于其氨基酸序列中含有SEQ ID NO. 1〇2. -种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1 所示的序列经过一个或/和几个氨基酸残基的取代和/或缺失形成的序列形成的多肽。3. -种布鲁氏菌L7/L12蛋白抗原表位多肽，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1 所示的序列和添加有具有布鲁氏菌免疫源性功能的衍生的多肽。4. 由SEQ ID NO. 1所构成的重组载体或表达盒或转基因细胞或重组菌。5. 权利要求1或2或3所述的多肽在制备诊断或预防或治疗布鲁氏菌引起的疾病的试剂 或药物中的应用。6. -种治疗布鲁氏菌病的药物组合物，其特征在于其中有SEQ ID NO. 1。
【文档编号】G01N33/569GK105968176SQ201610225924
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】曹小安, 周继章, 李兆才, 娄忠子, 景志忠, 付宝权, 尚佑军
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所