一种氯胺酮人工抗原的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种氯胺酮人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：与溴乙酸乙酯反应引入酯基，碱性条件下水解得到含羧基的氯胺酮半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使氯胺酮半抗原与牛γ球蛋白(BGG)结合制备氯胺酮人工抗原，即氯胺酮?牛γ球蛋白。所制备的氯胺酮人工抗原可进行动物免疫，取得相应的氯胺酮抗体，可用于各种氯胺酮免疫分析法的研究，为氯胺酮的检测提供更加方便快速准确的途径。
【专利说明】
一种氯胺酮人工抗原的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种氯胺酮人工抗原的制备方法。
【背景技术】
[0002] 氯胺酮(Ketamine、KET)，药品全名为盐酸氯胺酮，又叫氯氨酮，别名众多，如克他 命、开他敏、K粉或K仔等，临床中一般作麻醉剂使用。分子式为(C 13H16CIN0)，结构式如下：
[0004] 氯胺酮属苯环己哌啶(Phencyclidine)衍生物，基本结构为环己胺。Domino等1965 年引入临床，是非巴比妥类静脉麻醉药中具有确切镇痛作用的麻醉药。作为医药使用主要 有针剂和片剂两种剂型。氯胺酮盐酸盐为白色结晶性粉末，无臭。易溶于水，可溶于热乙醇， 不溶于乙醚。
[0005] 氯胺酮是一种通过静脉给药的短效麻醉剂，其进入血循环后大部分进入脑组织， 然后再分布于全身组织中，肝、肺和脂肪内的药物浓度也较高。由于KET是毒品"K粉"的主要 成分，近年来，其非法滥用现象严重。
[0006] 目前，对氯胺酮的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱(GC)，薄层色谱 (TLC)，质朴(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能 达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一 种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方 法，该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的氯胺酮 人工抗原的制备方法，制备的氯胺酮人工抗原可用于免疫制备具有特异性的氯胺酮抗体， 进一步用于检测。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种氯胺酮人工抗原 的制备方法，所制备的氯胺酮人工抗原可进行动物免疫，取得相应的氯胺酮抗体，可用于各 种氯胺酮类免疫分析法的研究，为氯胺酮的检测提供更加方便快速准确的途径。
[0008] -种氯胺酮人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0009] (1)制备人工半抗原：
[0010] (a)将lOOmg盐酸氯胺酮放入烧杯，加入l〇ml去离子水，再慢慢加入氨水调pH值至 11;
[0011] (b)加入50ml二氯甲烷萃取，总共萃取3次，收集有机相待用；
[0012] (c)将有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到游离态氯胺酮；
[0013] (d)将游离态氯胺酮溶于5ml丙酮中，加入60iil溴乙酸乙酯和150mg碳酸钾，80°C下 回流反应20h，冷却至常温，过滤，得到滤液；
[0014] (e)滤液减压蒸馏得到氯胺酮的酯；取50mg氯胺酮的酯、lml四氢呋喃、1.5ml甲醇 混合均匀，加入5ml浓度为1M的氢氧化钠溶液，常温反应20h;
[0015] (f)加入盐酸调pH值至7.0,用乙酸乙酯萃取，萃取3次，收集有机相，减压蒸馏得到 氯胺酮半抗原；
[0016] (2)制备人工抗原：
[0017] (g)将50mg氯胺酮半抗原、2.5ml N，N-甲基甲酰胺（DMF)、30mg N-基琥珀酰亚胺 (NHS)、55mg环己基碳酰二亚胺(DCC)混合均匀，常温反应20h;
[0018] (h)反应结束后，离心取上清液，得到A液；
[0019] ⑴将75mg牛丫球蛋白（BGG)加入到15ml 0.01MPBS缓冲液混合均匀，得到B液； [0020] (j)将A液和B液按体积比为1: 5混合均匀，4°C下反应20h，得到人工抗原混合液;将 人工抗原混合液移入透析袋中，用0.01MPBS缓冲液搅拌透析4次，透析结束后离心取上清 液，得到氯胺酮人工抗原；即氯胺酮-牛y球蛋白（BGG)抗原。
[0021 ]由于氯胺酮的分子量较小，单独作用时不具有免疫原性或免疫原性较弱，因此必 须将其与大分子载体比如牛Y球蛋白（BGG)连接形成氯胺酮抗原后，才能刺激机体产生相 应的氯胺酮抗体。本发明在制备氯胺酮人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明 显改变其结构，保留了抗原决定簇。在氯胺酮半抗原和牛Y球蛋白（BGG)之间引入桥结构， 暴露抗原决定簇，所获得的氯胺酮人工抗原保持了氯胺酮的结构特异性，有利于相应氯胺 酮抗体的产生。
[0022]本发明的技术方案分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：与溴乙酸乙酯反应 引入酯基，碱性条件下水解得到含羧基的氯胺酮半抗原;第二步为人工抗原的制备与检测： 通过碳二亚胺法使氯胺酮半抗原与牛y球蛋白（BGG)结合制备氯胺酮人工抗原，即氯胺酮-牛Y球蛋白（BGG)。制备氯胺酮的人工抗原即氯胺酮-牛Y球蛋白（BGG)形成相应全抗原。其 反应方程式如下：
[0024] 本发明制备得到的氯胺酮人工抗原可通过以下方法进行鉴定：
[0025] 偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率）的方法虽然很 多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量）的原理建立起来的。分 光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子 浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱 图迭加的性质。
[0026] 摩尔吸收系数e :配制氯胺酮半抗原浓度为0，5，10，20，30，40ug/ml的0.01MPBS溶 液，通过紫外扫面图可知氯胺酮半抗原的最大吸收波长为288nm，在288nm处测吸光值，每个 浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为￡ =吸光值/摩尔浓度。本发明计算得￡ = 5326.82L/mol [0027] 偶联物蛋白浓度的测定:配制浓度为0，10，20，30，40,60，80，100，120ug/ml的牛y 球蛋白（BGG)0.01MTOS溶液lml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30°C水浴温热5分 钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶 液按一定比例吸收，在655处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度 值。本发明计算得氯胺酮抗原的蛋白浓度为4.57mg/ml。
[0028] 偶联比测定：配制100ug/ml的牛y球蛋白（BGG)PBS溶液，将偶联物用roS稀释到 100ug/ml，在276处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1，A2,则偶联比率y为：y = [(ArAd/eVdOOX 10-V43000)，本发明计算得 Y ~220
[0029] 其中e为摩尔吸光系数(L/mol)，43000为牛y球蛋白（BGG)的分子量，100XHT 3为 牛Y球蛋白（BGG)浓度(ug/ml)。
[0030] 本发明的有益效果:本发明合成了氯胺酮的人工抗原，合成工艺先进，特异性强， 得到的氯胺酮人工抗原用于免疫新西兰白兔，检测结果表明，氯胺酮人工抗原的免疫血清 的效价为1:120000，完全可用于免疫分析中，为氯胺酮的检测提供更加方便快速准确的途 径。
【附图说明】
[0031 ]图1是氯胺酮人工半抗原的液相色谱图。
[0032]图2是氯胺酮人工半抗原的质谱图。
[0033]图3是氯胺酮人工抗原制备前后的紫外扫描图。
【具体实施方式】
[0034]氯胺酮人工抗原制备分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：与溴乙酸乙酯反 应引入酯基，碱性条件下水解得到含羧基的氯胺酮半抗原；第二步为人工抗原的制备与检 测:通过碳二亚胺法使氯胺酮半抗原与牛T球蛋白（BGG)结合制备氯胺酮人工抗原，即氯胺 酮-牛y球蛋白（BGG)抗原。
[0035] 实施例1
[0036] (1)制备人工半抗原KET半抗原的合成：
[0037] (a)将100mg盐酸氯胺酮放入烧杯，加入10ml去离子水，再慢慢加入氨水调PH值至 11;
[0038] (b)加入50ml二氯甲烷萃取，总共萃取3次，收集有机相待用；
[0039] (c)用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到游离态氯胺酮；
[0040] (d)将游离态氯胺酮溶于5ml丙酮中，加入60iil溴乙酸乙酯和150mg碳酸钾，80°C下 回流反应20h，冷却至常温，过滤，得到滤液；
[0041] (e)滤液减压蒸馏得到氯胺酮的酯；取50mg氯胺酮的酯、lml四氢呋喃、1.5ml甲醇 混合均匀，加入5ml浓度为1M的氢氧化钠溶液，常温反应20h;
[0042] (f)加入盐酸调PH值至7.0,用乙酸乙酯萃取，萃取3次，收集有机相，减压蒸馏得到 氯胺酮半抗原。
[0043] (2)制备人工抗原一KET抗原(氯胺酮-牛y球蛋白）的合成：
[0044] (g)将50mg氯胺酮半抗原、2.5ml N，N-甲基甲酰胺（DMF)、30mg N-基琥珀酰亚胺 (NHS)、55mg环己基碳酰二亚胺(DCC)混合均匀，常温反应20h;
[0045] (h)等反应结束后，离心取上清液，得到A液；
[0046] (i)将75mg牛y球蛋白（BGG)加入到15ml 0.01MPBS缓冲液混合均匀，得到B液；
[0047] (j)将A液和B液按体积比为1: 5混合均匀，4°C下反应20h，得到人工抗原混合液;将 人工抗原混合液移入透析袋中，用0.01MPBS缓冲液搅拌透析4次，透析结束后离心取上清 液，得到氯胺酮人工抗原；即氯胺酮-牛y球蛋白（BGG)抗原。
[0048] (3)氯胺酮人工抗原的鉴定：
[0049]偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率）的方法虽然很 多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量）的原理建立起来的。分 光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子 浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱 图迭加的性质。
[0050] 摩尔吸收系数e :配制氯胺酮半抗原浓度为0，5，10，20，30，40ug/ml的ros溶液，通 过紫外扫面图可知氯胺酮半抗原的最大吸收波长为288nm，在288nm处测吸光值，每个浓度 做平行样。摩尔吸光系数计算为￡ =吸光值/摩尔浓度。计算得e = 5326.82L/m〇l [00511 偶联物蛋白浓度的测定:配制浓度为0，10，20，30，40，60，80，100，120ug/ml的牛y 球蛋白（BGG)PBS溶液lml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混勾，30°C水浴温热5分钟，每个 浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一 定比例吸收，在655处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。计算 得氯胺酮抗原的蛋白浓度为4.57mg/ml。
[0052] 偶联比测定：配制100ug/ml的牛y球蛋白（BGG)PBS溶液，将偶联物用roS稀释到 100ug/ml，在276处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1，A2,则偶联比率y为：y = [(A「A2)/e]/(100X 10-3/43000)，计算得 y ~22〇
[0053] 其中e为摩尔吸光系数(L/mol)，43000为牛y球蛋白（BGG)的分子量，100XHT 3为 牛Y球蛋白（BGG)浓度(ug/ml)。
[0054]氯胺酮人工半抗原的液相色谱图如图1所示，氯胺酮人工半抗原的质谱图如图2所 示，氯胺酮人工抗原制备前后的紫外扫描图如图3所示。
【主权项】
1. 一种氯胺酮人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 制备人工半抗原： (a) 将lOOmg盐酸氯胺酮放入烧杯，加入10ml去离子水，再慢慢加入氨水调pH值至11; (b) 加入50ml二氯甲烷萃取，总共萃取3次，收集有机相待用； (c) 将有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到游离态氯胺酮； (d) 将游离态氯胺酮溶于5ml丙酮中，加入60μ1溴乙酸乙酯和150mg碳酸钾，80°C下回流 反应20h，冷却至常温，过滤，得到滤液； (e) 滤液减压蒸馏得到氯胺酮的酯；取50mg氯胺酮的酯、lml四氢咲喃、1.5ml甲醇混合 均匀，加入5ml浓度为1M的氢氧化钠溶液，常温反应20h; (f) 加入盐酸调pH值至7.0,用乙酸乙酯萃取，萃取3次，收集有机相，减压蒸馏得到氯胺 酮半抗原； (2) 制备人工抗原： (g) 将50mg氯胺酮半抗原、2.5ml N，N-甲基甲酰胺(DMF)、30mg N-基琥珀酰亚胺(NHS)、 55mg环己基碳酰二亚胺(DCC)混合均匀，常温反应20h; (h) 反应结束后，离心取上清液，得到A液； ⑴将75mg牛γ球蛋白加入到15ml 0.01MPBS缓冲液混合均匀，得至IjB液； (j )将A液和B液按体积比为1:5混合均匀，4 °C下反应20h，得到人工抗原混合液;将人工 抗原混合液移入透析袋中，用0.01MPBS缓冲液搅拌透析4次，透析结束后离心取上清液，得 到氯胺酮人工抗原；即氯胺酮-牛γ球蛋白抗原。
【文档编号】C07K14/47GK105968184SQ201610590188
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月25日
【发明人】叶肖俊
【申请人】杭州莱和生物技术有限公司