一种绒促性素纯化方法

文档序号:10605961阅读:945来源:国知局
一种绒促性素纯化方法
【专利摘要】本发明涉及一种绒促性素纯化方法,采用三次层析进行纯化,所述三次层析依次为亲和层析、疏水层析和离子交换层析,最终得到高纯度绒促性素固体。所述亲和层析的填料为capto blue(high sub)、所述疏水层析的填料为Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)、所述离子交换层析的填料为DEAE Sepharose Fast Flow。本发明优化了纯化工艺,使纯化过程简单化,收率明显提高,效价高于现有工艺,另外设备占地面积缩小,车间耗能变小。本发明中,预处理后绒促性素的效价为200iu/mg左右,而经三次层析处理后绒促性素的效价可达10000iu/mg左右,效价显著提高。
【专利说明】
一种绒促性素纯化方法
技术领域
[0001]本发明属于医药技术领域,涉及一种绒促性素纯化方法。
【背景技术】
[0002]绒促性素(Chor1nic Gonadotrophin)系自健康孕妇尿中提取、精制而成的一种天然促性腺激素,具有类似黄体生成素的功能。对女性可促进卵泡的成熟及排卵,并维持黄体的功能。对男性,能刺激睾丸间质细胞的发育,增加雄激素分泌,促使睾丸下降和男性第二性征发育。与尿促性素合用,可模拟生理性的促黄体生成素高峰,而触发排卵。临床上绒促性素至今仍是治疗月经失调、无排卵性不孕症、先兆流产和习惯性流产、隐睾症、男性性功能低下等的首选药物。
[0003]1928年,Zondek和Ascbheim首先用乙醇沉淀法,从孕妇尿中取得了活性物质,其他研究者则进行应用吸附剂从尿中直接吸附绒促性素的研究。而现有的方法是粗品加溶剂提取后板框过滤,在用酒精沉淀,离心获得中间体,再进行一步上柱,沉淀,离心,干燥获得产品。但该过程复杂,收率低,效价最高只有5000iu/mg左右。如CN104497128A,提供了一种低盐抽提法从粗品中提取绒促性素的方法,但该方法效价也不理想。

【发明内容】

[0004]为了克服现有技术的不足,本发明提供一种绒促性素纯化方法。该方法优化了纯化工艺,使纯化过程简单,收率明显提高,效价高于现有工艺。
[0005]本发明提供了如下的技术方案:
一种绒促性素纯化方法,采用三次层析进行纯化,所述三次层析依次为亲和层析、疏水层析和离子交换层析,最终得到高纯度绒促性素固体。
[0006]本申请的纯化方法,分三步层析,可使得到的绒促性素固体纯度高、效价高。
[0007]在上述方案中优选的是,所述亲和层析的填料为capto blue (high sub)、所述疏水层析的填料为Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)、所述离子交换层析的填料为DEAE Sepharose Fast Flow。
[0008]在上述任一方案中优选的是,包括以下各步骤:
(1)预处理:绒促性素粗品溶于溶解液中,加入乙醇溶液至混合溶液中存在低浓度乙醇后沉淀、取上清液,所述上清液再加入乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇,取沉淀得固体;
(2)第一步层析:步骤(I)得到的固体进行captoblue (high sub)亲和层析得蛋白溶液A;
(3)第二步层析:步骤(2)得到的蛋白溶液A经PhenylSepharose 6 Fast FlowChighsub)疏水层析得蛋白溶液B;
(4)第三步层析:将步骤(3)得到的蛋白溶液B经DEAESepharose Fast Flow离子交换层析得蛋白溶液C; (5)后处理:步骤(4)得到的蛋白溶液C加乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇,沉淀后收集固体,即得绒促性素固体。
[0009]在上述任一方案中优选的是,步骤(I)预处理:绒促性素粗品溶于溶解液中,加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为45-55%,搅拌、沉淀后取上清液,所述上清液加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为80-90%,取沉淀,离心,常温减压干燥,得固体。
[0010]乙醇浓度为45-55%时可使杂质全部沉淀,蛋白质不沉淀,然后取上清液,再加入乙醇使其浓度为80-90%时,可使蛋白基本沉淀。乙醇浓度高时能把蛋白质沉淀,离心后得到固体,经乙醇处理,利于固体析出。如果直接用绒促性素粗品上柱,由于缓冲体系不一样,不容易吸附在柱子上。
[0011]在上述任一方案中优选的是,步骤(2)第一步层析:将步骤(I)得到的固体溶于平衡液I,进行capto blue (high sub)亲和层析得蛋白溶液A,以平衡液I平衡、洗杂液I洗杂、洗脱液I洗脱;其中,
平衡液1:50 nmol tris缓冲液中加10nmol NaCl ;
洗杂液1: 50 nmol tris缓冲液中加500 nmol NaCl,再加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为5%;
洗脱液1:50 nmol tris缓冲液中加2 mo I NaCl,再加浓度为100%浓度的乙醇至溶液中乙醇浓度为20%。
[0012]在上述任一方案中优选的是,步骤(3)第二步层析:将步骤(2)得到的蛋白溶液A经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)疏水层析得蛋白溶液B,以平衡液2平衡;其中,平衡液2:1 Onmo I Hepes缓冲液中加I.5 mo I NaCl0
[0013]在上述任一方案中优选的是,步骤(4)第三步层析:将步骤(3)得到的蛋白溶液B经DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析得蛋白溶液C,以平衡液3平衡,洗脱液3洗脱;其中,
平衡液3: 10 nmol Tris缓冲液;
洗脱液3: 10 nmol Tris缓冲液中加150 nmol NaCl。
[0014]在上述任一方案中优选的是,步骤(5)后处理:步骤(4)得到的蛋白溶液C加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为80-90%,沉淀过夜,再用3500-4000rpm离心20min收集固体,减压常温干燥得高纯度绒促性素固体。
[0015]80-90%的乙醇利于蛋白质沉淀。
[0016]在上述任一方案中优选的是,步骤(I)所述溶解液为1%浓度的乙酸钠溶液。
[0017]在上述任一方案中优选的是,步骤(2)还包括为蛋白溶液A的浓缩和超滤步骤,将所述蛋白溶液A浓缩至原体积的1/5,然后进行超滤,置换缓冲液,至于缓冲液I中,其中缓冲液I: 1nmol Hepes缓冲液中加1.5moI NaCl。其中,浓缩是为了进一步置换缓冲液,置换了缓冲液更利于下一步的蛋白在柱子上的吸附。
[0018]在上述任一方案中优选的是,所述置换时,所用所述缓冲液I的体积为蛋白溶液A浓缩后的8倍体积,置换后溶液体积不变。
[0019]在上述任一方案中优选的是,所述缓冲液I的pH值用氢氧化钠或盐酸为7.5±0.2。
[0020]在上述任一方案中优选的是,所述超滤采用10KD的聚醚砜膜。
[0021]在上述任一方案中优选的是,步骤(3)还包括含蛋白溶液B的超滤步骤,将所述蛋白溶液B进行超滤,置换缓冲液,至于缓冲液2中,其中缓冲液2:10 nmol Tris缓冲液。
[0022]在上述任一方案中优选的是,所述置换时,所用所述缓冲液2的体积为蛋白溶液B浓缩后的8倍体积,置换后溶液体积不变。
[0023]在上述任一方案中优选的是,所述缓冲液2的pH值用氢氧化钠或盐酸调节为7.5土0.2。
[0024]在上述任一方案中优选的是,所述超滤采用1KD的聚醚砜膜。
[0025]在上述任一方案中优选的是,步骤(3)中使用的填料Phenyl Sepharose 6 FastFlowChigh sub)采用再生液2再生,所述再生液2:1Onmol Hepes缓冲液。
[0026]在上述任一方案中优选的是,所述再生液的pH值用氢氧化钠或盐酸调节为pH7.5±0.2。
[0027]在上述任一方案中优选的是,步骤(4)还包括含蛋白溶液C的浓缩和超滤步骤,将所述蛋白溶液C浓缩至原体积的I/5,然后进行超滤,置换缓冲液,至于缓冲液3中,其中缓冲液3: 0.15 mo I乙酸铵溶液。
[0028]所述置换时,所用所述缓冲液3的体积为蛋白溶液C浓缩后的8倍体积,置换后溶液体积不变。
[0029]在上述任一方案中优选的是,所述缓冲液3的pH值用氨水或乙酸调节为5.5 土0.2。
[0030]在上述任一方案中优选的是,所述超滤采用1KD的聚醚砜膜。
[0031 ] 在上述任一方案中优选的是,步骤(4)中使用的填料DEAE Sepharose Fast Flow采用再生液3再生,所述再生液3: 10 nmol Tris缓冲液中加I mol NaCl。
[0032]在上述任一方案中优选的是,所述再生液3的pH值用氢氧化钠或盐酸为7.5±0.2。
[0033]在上述任一方案中优选的是,所述平衡液1、所述洗杂液1、所述洗脱液1、所述平衡液2、所述平衡液3、所述洗脱液3的PH均为7.5±0.2。
[0034]在上述任一方案中优选的是,所述平衡液1、所述洗杂液I和所述洗脱液I的pH均用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。
[0035]在上述任一方案中优选的是,所述平衡液2的pH用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。
[0036]在上述任一方案中优选的是,所述平衡液3和所述洗脱液3的pH均用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。
[0037]在上述任一方案中优选的是,步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)进行层析的线性流速为150-250cm/h。优选200cm/h。
[0038]在上述任一方案中优选的是,所述方法进行纯化的温度为室温。
[0039]本发明优化了纯化工艺,使纯化过程简单化,收率明显提高,效价高于现有工艺,另外设备占地面积缩小,车间耗能变小。本发明中,预处理后绒促性素的效价为200iu/mg左右,而经三次层析处理后绒促性素的效价可达10000iu/mg左右,效价显著提高。
【具体实施方式】
[0040]为了进一步了解本发明的技术特征,下面结合具体实施例对本发明进行详细地阐述。实施例只对本发明具有示例性的作用,而不具有任何限制性的作用,本领域的技术人员在本发明的基础上做出的任何非实质性的修改,都应属于本发明的保护范围。
[0041]本发明中使用填料均优选为GE公司生产、销售。绒促性素粗品购于沂南华欣生物制品有限公司。
[0042]本发明采用了以下技术,来解决现有技术的问题:
一种绒促性素纯化方法,采用三次层析进行纯化,所述三次层析依次为亲和层析、疏水层析和离子交换层析,最终得到高纯度绒促性素固体。
[0043]进一步地,所述亲和层析的填料为capto blue (high sub)、所述疏水层析的填料为Phenyl Sepharose 6 Fast FlowChigh sub)、所述离子交换层析的填料为DEAESepharose Fast Flow。
[0044]更进一步地,包括以下各步骤:
(1)预处理:绒促性素粗品溶于溶解液中,再加入乙醇溶液至混合溶液中存在低浓度乙醇后沉淀、取上清液,所述上清液再加入乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇,取沉淀得固体;
(2)第一步层析:步骤(I)得到的固体进行captoblue (high sub)亲和层析得蛋白溶液A;
(3)第二步层析:步骤(2)得到的蛋白溶液A经PhenylSepharose 6 Fast FlowChighsub)疏水层析得蛋白溶液B;
(4)第三步层析:将步骤(3)得到的蛋白溶液B经DEAESepharose Fast Flow离子交换层析得蛋白溶液C;
(5)后处理:步骤(4)得到的蛋白溶液C加乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇,沉淀后收集固体,即得绒促性素固体。
[0045]更进一步地,步骤(I)预处理:绒促性素粗品溶于溶解液中,加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为45-55%,搅拌、沉淀后取上清液,所述上清液加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为80-90%,取沉淀,离心,常温减压干燥,得固体。
[0046]更进一步地,步骤(2)第一步层析:将步骤(I)得到的固体溶于平衡液I,进行captoblue (high sub)亲和层析得蛋白溶液A,以平衡液I平衡、洗杂液I洗杂、洗脱液I洗脱;其中,
平衡液1:50 nmol tris缓冲液中加10nmol NaCl ;
洗杂液1: 50 nmol tris缓冲液中加500 nmol NaCl,再加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为5%;
洗脱液1:50 nmol tris缓冲液中加2 mol NaCl,再加浓度为100%浓度的乙醇至溶液中乙醇浓度为20%。
[0047]更进一步地,步骤(3)第二步层析:将步骤(2)得到的蛋白溶液A经Pheny ISepharose 6 Fast FlowChigh sub)疏水层析得蛋白溶液B,以平衡液2平衡;
其中,平衡液2:1Onmol Hepes缓冲液中加I.5 mol NaCl0
[0048]更进一步地,步骤(4)第三步层析:将步骤(3)得到的蛋白溶液B经DEAE SepharoseFast Flow离子交换层析得蛋白溶液C,以平衡液3平衡,洗脱液3洗脱;其中,
平衡液3: 10 nmol Tris缓冲液;
洗脱液3: 10 nmol Tris缓冲液中加150 nmol NaCl。
[0049]更进一步地,步骤(5)后处理:步骤(4)得到的蛋白溶液C加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为80-90%,沉淀过夜,再用3500-4000rpm离心20min收集固体,减压常温干燥得高纯度绒促性素固体。
[0050]更进一步地,步骤(I)中所述溶解液为1%浓度的乙酸钠溶液。
[0051]更进一步地,步骤(2)还包括蛋白溶液A的浓缩和超滤步骤,将所述蛋白溶液A浓缩至原体积的1/5,然后进行超滤,置换缓冲液,至于缓冲液I中,其中缓冲液I: 1nmol Hepes缓冲液中加1.5mol NaCl0
[0052]更进一步地,所述置换时,所用所述缓冲液I的体积为蛋白溶液A浓缩后的8倍体积,置换后溶液体积不变。
[0053]更进一步地,所述缓冲液I的pH值用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。
[0054]更进一步地,所述超滤采用1KD的聚醚砜膜。
[0055]更进一步地,步骤(3)还包括含蛋白溶液B的超滤步骤,将所述蛋白溶液B进行超滤,置换缓冲液,至于缓冲液2中,其中缓冲液2:10 nmol Tris缓冲液。
[0056]更进一步地,所述置换时,所用所述缓冲液2的体积为蛋白溶液B浓缩后的8倍体积,置换后溶液体积不变。
[0057]更进一步地,所述缓冲液2的pH值用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。
[0058]更进一步地,所述超滤采用1KD的聚醚砜膜。
[0059]更进一步地,步骤(3)中使用的填料PhenylSepharose 6 Fast FlowChigh sub)采用再生液2再生,所述再生液2:1Onmol Ifepes缓冲液。
[0060]更进一步地,所述再生液2的pH值用氢氧化钠或盐酸调节为pH7.5±0.2。
[0061]更进一步地,步骤(4)还包括含蛋白溶液C的浓缩和超滤步骤,将所述蛋白溶液C浓缩至原体积的1/5,然后进行超滤,置换缓冲液,至于缓冲液3中,其中缓冲液3: 0.15 mol乙酸铵溶液。
[0062]更进一步地,所述置换时,所用所述缓冲液3的体积为蛋白溶液C浓缩后的8倍体积,置换后溶液体积不变。
[0063]更进一步地,所述缓冲液3的pH值用氨水或乙酸调节为5.5±0.2。
[0064]更进一步地,所述超滤采用1KD的聚醚砜膜。
[0065]更进一步地,步骤(4)中使用的填料DEAE Sepharose Fast Flow采用再生液3再生,所述再生液3: 10 nmol Tris缓冲液中加I mol NaCl0
[0066]更进一步地,所述再生液3的pH值用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。
[0067]更进一步地,所述平衡液1、所述洗杂液I和所述洗脱液I的pH均用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。
[0068]更进一步地,所述平衡液2的pH用氢氧化钠或盐酸调节为7.5 ± 0.2。
[0069]更进一步地,所述平衡液3和所述洗脱液3的pH均用氢氧化钠或盐酸调节为7.5±0.2。
[°07°] 更进一步地,进行层析的线性流速为150-250cm/h。
[0071 ] 更进一步地,所述方法进行纯化的温度为室温。
[0072] 实施例1:
一种绒促性素纯化方法,包括以下各步骤: (I)绒促性素粗品溶于1%浓度的乙酸钠溶液,搅拌后加100%浓度酒精调节酒精浓度为50%,搅拌沉淀后取上清,上清加100%酒精调节酒精浓度为85%,取沉淀,离心,常温减压干燥,得固体,效价为200iu/mg左右。
[0073](2)第一步层析:固体溶于平衡液I,经GE capto blue (high sub)亲和层析初步获得蛋白溶液A。
[0074]平衡液1:50 nmol tris+ 100 nmol NaCl ,pH 7.5;
洗杂液1:50 nmol tris+ 500 nmol NaCl+100%浓度的乙醇使终浓度为5%,PH 7.5; 洗脱液1:50 nmol tris+ 2 mol NaCl+100%浓度的乙醇使终浓度为20%,PH 7.5; 平衡液I平衡,样品上柱,平衡液I再平衡,洗杂液I洗杂,洗脱液I洗脱收集。
[0075](3)浓缩和超滤:
将GE capto blue (high sub)层析后蛋白溶液A进行液浓缩至原体积的1/5,然后进行超滤,置换缓冲液,即使用8倍体积的缓冲液I,置换后溶液体积不变。
[0076]缓冲液1: 10 nmol Hepes+ 1.5 mol NaCl,pH7.5;
超滤夹具:密理博;
膜:10KD的聚醚砜膜。
[0077](4)第二步层析:超滤后样品溶液经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)获得蛋白溶液B。采用平衡液2,收集流份,在利用再生液2将填料再生。
[0078]平衡液2:1OnmoI Hepes+ 1.5 mol NaCl,pH7.5;
再生液2:1Onmol Hepes,pH7.5。
[0079](5)超滤:将Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)层析后蛋白溶液B进行超滤,置换缓冲液,即使用8倍体积的缓冲液2,置换后溶液体积不变。
[0080]缓冲液2:10 nmol Tris, pH 7.5;
超滤夹具:密理博;
膜:10KD的聚醚砜膜。
[0081 ] (6)第三步层析:超滤后的样品溶液经DEAE Sepharose Fast Flow层析,获得最终高纯度蛋白溶液C。采用平衡液3平衡,洗脱液3洗脱,再生液3再生。
[0082]平衡液3:10 nmol Tris ,pH 7.5;
洗脱液3: 10 nmol Tris+ 150 nmol NaCl ,pH 7.5;
再生液3: 10 nmol Tris+ I mol NaCl ,pH 7.5。
[0083](7)浓缩和超滤:将DEAE Sepharose Fast Flow层析后溶液蛋白C进行浓缩至1/5倍体积,浓缩后进行超滤,置换缓冲液,即使用8倍体积缓冲液3,置换后溶液体积不变。
[0084]缓冲液3:0.15 mol乙酸铵溶液,pH 5.5;
超滤夹具:密理博;
膜:10KD的聚醚砜膜
(8)沉淀、离心、干燥
将步骤(7)得到的蛋白溶液加100%浓度的酒精溶液调节至酒精浓度85%,沉淀过夜,4000rpm离心20min收集固体,减压常温干燥获得高纯度绒促性素固体,效价约为1000iu/
mg ο
[0085]实验环境室温,全程线性流速200cm/h。
[0086]实施例2:
一种绒促性素纯化方法,包括以下各步骤:
(I)绒促性素粗品溶于1%浓度的乙酸钠溶液,搅拌后加100%浓度酒精调节酒精浓度为50%,搅拌沉淀后取上清,上清加100%酒精调节酒精浓度为85%,取沉淀,离心,常温减压干燥,得固体,效价为200iu/mg左右。
[0087](2)第一步层析:固体溶于平衡液I,经GE capto blue (high sub)亲和层析初步获得蛋白溶液。
[0088]平衡液1:50 nmol tris+ 100 nmol NaCl ,pH 7.5;
洗杂液1:50 nmol tris+ 500 nmol NaCl+100%浓度的乙醇使终浓度为5%,pH 7.5; 洗脱液1:50 nmol tris+ 2 mol NaCl+100%浓度的乙醇使终浓度为20%,pH 7.5; 平衡液I平衡,样品上柱,平衡液I再平衡,洗杂液I洗杂,洗脱液I洗脱收集。
[0089](3)浓缩和超滤:
将GE capto blue (high sub)层析后蛋白溶液进行液浓缩至原体积的1/5,然后进行超滤,置换缓冲液,即使用8倍体积缓冲液I,置换后溶液体积不变。
[0090]缓冲液1:10 nmol Hepes+ 1.5 mol NaCl,pH7.5;
超滤夹具:密理博;
膜:10KD的聚醚砜膜。
[0091 ] (4)第二步层析:超滤后样品溶液经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)获得蛋白溶液。采用平衡液2,收集流份,在利用再生液2将填料再生。
[0092]平衡液2:1Onmol Hepes+ 1.5 mol NaCl,pH7.5;
再生液2:1Onmol Hepes,pH7.5。
[0093](5)超滤:将Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)层析后溶液蛋白进行超滤,置换缓冲液,即使用8倍体积缓冲液3,置换后溶液体积不变。
[0094]缓冲液3:0.15 mol乙酸铵溶液,pH 5.5;
超滤夹具:密理博;
膜:10KD的聚醚砜膜。
[0095](6)沉淀、离心、干燥
将步骤(6)得到的蛋白溶液加100%浓度的酒精溶液调节至酒精浓度85%,沉淀过夜,3500-4000rpm离心20min收集固体,减压常温干燥获得高纯度绒促性素固体,效价约为6000iu/mgo
[0096]实验环境室温,全程线性流速150cm/h。
[0097]实施例3:
一种绒促性素纯化方法,包括以下各步骤:
(I)绒促性素粗品溶于1%浓度的乙酸钠溶液,搅拌后加100%浓度酒精调节酒精浓度为50%,搅拌沉淀后取上清,上清加100%酒精调节酒精浓度为85%,取沉淀,离心,常温减压干燥,得固体,效价为200iu/mg左右。
[0098](2)第一步层析:固体溶于平衡液I,经GE capto blue (high sub)亲和层析初步获得蛋白溶液。
[0099]平衡液1:50 nmol tris+ 100 nmol NaCl,PH 7.5; 洗杂液1:50 nmol tris+ 500 nmol NaCl+100%浓度的乙醇使终浓度为5%,PH 7.5; 洗脱液1:50 nmol tris+ 2 mol NaCl+100%浓度的乙醇使终浓度为20%,PH 7.5; 平衡液I平衡,样品上柱,平衡液I再平衡,洗杂液I洗杂,洗脱液I洗脱收集。
[0100](3)浓缩和超滤:
将GE capto blue (high sub)层析后蛋白溶液进行液浓缩至原体积的1/5,然后进行超滤,置换缓冲液,即使用8倍体积的缓冲液2,置换后溶液体积不变。
[0101]缓冲液2:10nmol Tris, pH 7.5;
超滤夹具:密理博;
膜:10KD的聚醚砜膜。
(4)第二步层析:超滤后的样品溶液经DEAE Sepharose Fast Flow层析,获得最终高纯度蛋白溶液。采用平衡液3平衡,洗脱液3洗脱,再生液3再生。
[0103]平衡液3:10 nmol Tris ,pH 7.5;
洗脱液3: 10 nmol Tris+ 150 nmol NaCl ,pH 7.5;
再生液3: 10 nmol Tris+ I mol NaCl, pH 7.5。
[0104](5)浓缩和超滤:将DEAE Sepharose Fast Flow层析后溶液蛋白进行浓缩至1/5倍体积,浓缩后进行超滤,置换缓冲液,即使用8倍体积缓冲液3,置换后溶液体积不变。
[0105]缓冲液3: 0.15 mol乙酸铵溶液,pH 5.5;
超滤夹具:密理博;
膜:10KD的聚醚砜膜
(6)沉淀、离心、干燥
将步骤(5)得到的蛋白溶液加100%浓度的酒精溶液调节至酒精浓度85%,沉淀过夜,3500-4000rpm离心20min收集固体,减压常温干燥获得高纯度绒促性素固体,效价约为6000iu/mgo
[0106]实验环境室温,全程线性流速250cm/h。
[0107]实施例4:
一种绒促性素纯化方,包括以下各步骤:
(I)绒促性素粗品溶于1%浓度的乙酸钠溶液,搅拌后加100%浓度酒精调节酒精浓度为50%,搅拌沉淀后取上清,上清加100%酒精调节酒精浓度为85%,取沉淀,离心,常温减压干燥,得固体,效价为200iu/mg左右。
[0108](2)第一步层析:固体溶于平衡液2,经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (highsub)获得蛋白溶液。采用平衡液2,收集流份,在利用再生液2将填料再生。
[0109]平衡液2:1Onmol Hepes+ 1.5 mol NaCl, pH7.5 ;
再生液2:1Onmol Hepes, ρΗ7.5。
[0110](3)超滤:将Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)层析后蛋白溶液进行超滤,置换缓冲液,即使用8倍体积缓冲液2,置换后溶液体积不变。
[0111]缓冲液2:10 nmol Tris, pH 7.5;
超滤夹具:密理博;
膜:10KD的聚醚砜膜。
[0112](4)第二步层析:超滤后的样品溶液经DEAE Sepharose Fast Flow层析,获得最终高纯度蛋白溶液。采用平衡液3平衡,洗脱液3洗脱,再生液3再生。
[0113]平衡液3:10 nmol Tris, pH 7.5;
洗脱液3: 10 nmol Tris+ 150 nmol NaCl, pH 7.5;
再生液3: 10 nmol Tris+ I mol NaCl ,pH 7.5。
[0114](5)浓缩和超滤:将DEAE Sepharose Fast Flow层析后溶液蛋白进行浓缩至1/5倍体积,浓缩后进行超滤,置换缓冲液,即使用8倍体积缓冲液3,置换后溶液体积不变。
[0115]缓冲液3: 0.15 mol乙酸铵溶液,pH 5.5;
超滤夹具:密理博;
膜:10KD的聚醚砜膜
(6)沉淀、离心、干燥
将步骤(5)得到的蛋白溶液加100%浓度的酒精溶液调节至酒精浓度85%,沉淀过夜,3500-4000rpm离心20min收集固体,减压常温干燥获得高纯度绒促性素固体,效价约为6000iu/mgo
[0116]实验环境室温,全程线性流速150-250cm/h。
【主权项】
1.一种绒促性素纯化方法,采用三次层析进行纯化,所述三次层析依次为亲和层析、疏水层析和离子交换层析,最终得到高纯度绒促性素固体。2.根据权利要求1所述的绒促性素纯化方法,其特征在于:所述亲和层析的填料为capto blue (high sub)、所述疏水层析的填料为Phenyl Sepharose 6 Fast FlowChighsub)、所述离子交换层析的填料为DEAE Sepharose Fast Flow。3.根据权利要求2所述的绒促性素纯化方法,其特征在于:包括以下各步骤: (1)预处理:绒促性素粗品溶于溶解液中,再加入乙醇溶液至混合溶液中存在低浓度乙醇后沉淀、取上清液,所述上清液再加入乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇,取沉淀得固体; (2)第一步层析:步骤(I)得到的固体进行captoblue (high sub)亲和层析得蛋白溶液A; (3)第二步层析:步骤(2)得到的蛋白溶液A经PhenylSepharose 6 Fast Flow (highsub)疏水层析得蛋白溶液B; (4)第三步层析:将步骤(3)得到的蛋白溶液B经DEAESepharose Fast Flow离子交换层析得蛋白溶液C; (5)后处理:步骤(4)得到的蛋白溶液C加乙醇溶液至混合溶液中存在高浓度乙醇,沉淀后收集固体,即得绒促性素固体。4.根据权利要求3所述的绒促性素纯化方法,其特征在于:步骤(I)预处理:绒促性素粗品溶于溶解液中,加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为45-55%,搅拌、沉淀后取上清液,所述上清液加浓度为100%乙醇至混合溶液中乙醇浓度为80-90%,取沉淀,离心,常温减压干燥,得固体。5.根据权利要求4所述的绒促性素纯化方法,其特征在于:步骤(2)第一步层析:将步骤(1)得到的固体溶于平衡液I,进行captoblue (high sub)亲和层析得蛋白溶液A,以平衡液I平衡、洗杂液I洗杂、洗脱液I洗脱;其中, 平衡液1:50 nmol tris缓冲液中加10nmol NaCl ; 洗杂液1:50 nmol tris缓冲液中加500 nmol NaCl,再加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为5%; 洗脱液1:50 nmol tris缓冲液中加2 mo I NaCl,再加浓度为100%浓度的乙醇至溶液中乙醇浓度为20%。6.根据权利要求5所述的绒促性素纯化方法,其特征在于:步骤(3)第二步层析:将步骤(2)得到的蛋白溶液A经PhenylSepharose 6 Fast Flow (high sub)疏水层析得蛋白溶液B,以平衡液2平衡; 其中,平衡液2:1Onmol Hepes缓冲液中加I.5 mo I NaCl。7.根据权利要求6所述的绒促性素纯化方法,其特征在于:步骤(4)第三步层析:将步骤(3)得到的蛋白溶液B经DEAESepharose Fast Flow离子交换层析得蛋白溶液C,以平衡液3平衡,洗脱液3洗脱;其中, 平衡液3: 10 nmol Tris缓冲液; 洗脱液3: 10 nmol Tris缓冲液中加150 nmol NaCl。8.根据权利要求7所述的绒促性素纯化方法,其特征在于:步骤(5)后处理:步骤(4)得到的蛋白溶液C加浓度为100%的乙醇至溶液中乙醇浓度为80-90%,沉淀过夜,再用3500-4000rpm离心20min收集固体,减压常温干燥得高纯度绒促性素固体。9.根据权利要求3所述的绒促性素纯化方法,其特征在于:步骤(I)中所述溶解液为1%浓度的乙酸钠溶液。10.根据权利要求5所述的绒促性素纯化方法,其特征在于:步骤(2)还包括蛋白溶液A的浓缩和超滤步骤,将所述蛋白溶液A浓缩至原体积的1/5,然后进行超滤,置换缓冲液,至于缓冲液I中,其中缓冲液I = 1nmol Hepes缓冲液中加I.5mol NaCl。
【文档编号】C07K1/18GK105968185SQ201610572482
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月20日
【发明人】夏星辉, 胡晶锦, 王群芳
【申请人】宁波人健药业集团股份有限公司
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