一种重组抗病毒蛋白及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种重组抗病毒蛋白、一种编码该重组抗病毒蛋白的核酸、一种包含该核酸的重组表达载体、一种包含该重组表达载体的转化体、一种制备该重组抗病毒蛋白的方法和该重组抗病毒蛋白在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物中的应用。该重组抗病毒蛋白包括共价融合的位于N端的P9肽和位于C端的ISG20蛋白，P9肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的重组抗病毒蛋白可以有效地抑制PRRSV的RNA的合成并阻断PRRSV的复制，具有非常高的抗病毒能力和高度的靶标特异性，同时对细胞的毒性非常低。
【专利说明】
一种重组抗病毒蛋白及其制备方法和应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种重组抗病毒蛋白及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起，是家养 猪的常见病之一，通过损害家猪的免疫系统而使其致病。
[0003] 在之前，已经获得了15个可以抑制PRRSV聚合酶或解旋酶的肽段（Liu et al.， 2012)。在这些肽段中，P9多肽(氨基酸序列为:HRILMRIRQMMT)通过与病毒聚合酶结合而具 有强效抑制病毒的功能。P9是由12个氨基酸组成的肽段，半衰期很短，在临床应用中会被很 快地代谢降解掉。另一方面，P9虽然可以与PRRSV的聚合酶结合，但病毒的突变可大大降低 p9的抗病毒能力。
[0004] 现阶段，商业化的针对PRRSV的疫苗的预防作用并不稳定（Chand et al.，2012; Charerntantanakul ,2012)，特异性的抗PRRSV药物还非常少，效果也达不到治疗该病的目 的。在PRRSV的临床治疗中，急需要一种抗病毒效力高，稳定有效且特异性高、细胞毒性小的 抗病毒试剂（Sun et al ?，2014;Wang and Zhang，2014;Wang et al ? ,2013)。因此，研发一 种新型的治疗手段尤为关键（Sang et al.，2011;Wang and Christopher-Hennings,2012; Yun and Lee,2013)。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在针对PRRSV的疫苗的预防效 果不稳定，而化学抗病毒药物特异性不高、且毒性较大的缺陷，提供了一种重组抗病毒蛋白 及其制备方法和应用。本发明的重组抗病毒蛋白可以有效地抑制PRRSV的复制，具有非常 高的抗病毒能力和靶标特异性，并且对宿主细胞的毒性非常低。
[0006] 本发明人经过深入的研究和反复的试验，发现将特异性靶向PRRSV病毒聚合酶的 P9肽段和具有病毒核酸降解功能的ISG20蛋白融合，能够将两者的抗病毒能力协同地结合 起来。已知ISG20蛋白的抗病毒PRRSV的能力是P9肽的1.37倍，与单独使用ISG20相比，P9-ISG20的抗病毒PRRSV的能力提高了约1.9倍;具有特异性抗PRRSV病毒的优异效果，从而完 成了本发明。
[0007] 因此，本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0008] 本发明的技术方案之一:一种重组抗病毒蛋白，其包括共价融合的位于N端的P9肽 和位于C端的ISG20蛋白，所述P9肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0009] 本发明中，所述P9肽的序列如序列表SEQ ID N0.1所示。所述ISG20蛋白为本领域 常规的IFN诱导基因编码的蛋白，可以为本领域常规物种的ISG20蛋白，例如猕猴(Macaca mulatta)或猪(Sus scrofa)的ISG20蛋白。所述P9肽与所述ISG20蛋白可以通过本领域常规 的可折叠连接序列共价融合，例如地通过3 X GGGGS连接序列共价融合。
[0010] 本发明中，所述重组抗病毒蛋白还可以包括穿膜肽，所述穿膜肽可以共价融合于 所述重组抗病毒蛋白的N端。所述穿膜肽可以为本领域常规的穿膜肽，能够不依赖胞吞作用 将大分子运输到细胞内，包括天然的穿膜肽与人工合成的穿膜肽，例如HIV-1TAT穿膜肽、寡 聚精氨酸穿膜肽、plsl穿膜肽、Transportan穿膜肽和P-alpha穿膜肽，较佳地为HIV-1TAT穿 膜肽。所述HIV-1TAT穿膜肽的序列可以为本领域常规的序列，较佳地如序列表SEQ ID N0.6 所示。所述穿膜肽的拷贝数可以为一个到多个，较佳地为1个拷贝。
[0011] 本发明中，所述重组抗病毒蛋白还可以包括共价融合的蛋白标签，所述蛋白标签 可以为本领域常规的蛋白标签，如c-Myc、6 X Hi s、FLAG或EGFP。所述蛋白标签可以融合于所 述重组抗病毒蛋白的N端、C端或融合于所述重组抗病毒蛋白中的所述P9肽与所述ISG20蛋 白之间。所述蛋白标签与所述重组抗病毒蛋白之间可以通过本领域常规的可折叠连接序列 共价融合，例如通过3 XGGGGS连接序列共价融合。所述蛋白标签的拷贝数可以为一个到多 个，如1个拷贝。
[0012] 在本发明一较佳的实施方案中，所述重组抗病毒蛋白的P9肽和猕猴（Macaca mulatta)ISG20蛋白之间融合有1个拷贝的EGFP蛋白，所述EGFP蛋白通过3XGGGGS连接序列 共价融合。
[0013]在本实施方案中，所述重组抗病毒蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
[0014]在本发明一进一步较佳的实施方案中，所述重组抗病毒蛋白的N端融合有1个拷贝 的HIV-1TAT穿膜肽，所述P9肽和所述猕猴(Macaca mulatta)ISG20蛋白之间融合有1个拷贝 的EGFP蛋白，所述HIV-1TAT穿膜肽与所述EGFP蛋白均通过3 XGGGGS连接序列共价融合。 [0015]在本实施方案中，所述重组抗病毒蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
[0016] 本发明的技术方案之二:一种编码如前所述重组抗病毒蛋白的核酸。
[0017] 本发明中，所述核酸的序列较佳地如序列表SEQ ID N0.4所示，其编码序列如序列 表SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，更佳地如序列表SEQ ID N0.5所示，其编码序列如序列 表SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列。
[0018]本发明技术方案之三:一种包含前述核酸的重组载体。
[0019] 本发明中，所述重组载体可通过本领域常规的方法获得，如将前述核酸分子连接 到各种载体上获得。所述载体较佳地为表达载体，所述表达载体可以为本领域常规的各种 表达载体，如原核表达载体或真核表达载体，如pET28、pCDNA3.1或pIVEX-His Tag，较佳地 为PCDNA3.1或pIVEX-His Tag。
[0020] 本发明技术方案之四：一种包含前述重组载体的转化体。
[0021] 本发明中，所述转化体的制备方法可以为本领域常规的方法，如将前述重组载体 导入宿主细胞中或转化至宿主微生物中制得。所述宿主细胞可以为本领域常规的各种细 胞，如人细胞、小鼠细胞、大鼠细胞或猪细胞，只要能满足使前述重组表达载体稳定地自行 复制、使被编码的所述抗病毒重组蛋白有效表达即可，较佳地为猪细胞MARC-145。所述导入 的方法可以为本领域常规的将载体导入到细胞中的方法，如用转染试剂转染。所述宿主微 生物可以为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使前述重组表达载体稳定地自行复 制、使被编码的所述抗病毒重组蛋白有效表达即可，较佳地为大肠杆菌(E.coli)。所述转化 的方法可以为本领域常规的将载体转化到微生物中的方法，如电转法或化学转化法。
[0022] 本发明技术方案之五:一种制备前述重组抗病毒蛋白的方法，所述方法包括以下 步骤:将含有编码如前所述重组抗病毒蛋白的核酸的表达载体进行表达。
[0023] 本发明中，所述表达可以为本领域常规的表达，如在原核体系中表达、在真核体系 中表达、或在无细胞表达系统中表达，较佳地为在无细胞表达系统中表达。所述无细胞表达 系统可以为本领域常规的无细胞表达系统，较佳地为购自天根生化有限公司的无细胞表达 系统（RTS pIVEX Wheat Germ His6-tag Set)，其包括无细胞表达载体pIVEX-His Tag。
[0024] 本发明技术方案之六:前述重组抗病毒蛋白在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的 药物中的应用。
[0025] 本发明中，所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物包括前述重组抗病毒蛋白和药 学可接受的载体。所述的药学可接受的载体为本领域常规的载体，所述的载体可以为任意 合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较 佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01 ~99.99 %的上述蛋白质和0.01~99.99 %的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的 质量百分比。
[0026] 本发明中，所述药物的给药途径较佳地为肠胃外施用、注射给药或口服给药。所述 注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的 药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体或液体的形式，即可以为水 溶液、非水溶液或混悬液，更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。更佳地为经由 血管内、皮下、腹膜内或肌内施用。较佳地，所述药物组合物还可以作为气雾剂或粗喷雾剂 施用，即经鼻施用;或者，鞘内、髓内或心室内施用。更佳地，所述的药物组合物还可以透皮、 经皮、局部、肠内、阴道内、舌下或经直肠施用。
[0027] 本发明中，所述药物的给药剂量水平可以根据达到所需诊断或治疗结果的组合物 量而调整。施用方案也可以为单次注射或多次注射，或进行调整。所选择的剂量水平和方案 依赖于包括所述药物的活性和稳定性（即，半衰期）、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的 组合、待检测和/或治疗的疾病或病症、以及待治疗的受试者的健康状况和先前医疗史等各 种因素而进行合理地调整。
[0028] 本发明的所述药物的治疗有效剂量可以最初在细胞培养实验或动物模型例如啮 齿类动物、兔、犬、猪和/或灵长类动物中进行估计。动物模型也可以用于测定合适的施用浓 度范围和途径。一般地，施用有效量或剂量的确定和调整以及何时和如何进行此类调整的 评估为本领域技术人员已知。
[0029] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0030] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0031] 本发明的积极进步效果在于:本发明的重组抗病毒蛋白可以有效地抑制PRRSV的 RNA的合成并阻断PRRSV的复制，具有非常高的抗病毒能力，在2pmol的用量水平下即呈现出 非常高的抗PRRSV的效果，并且具有高度的靶标特异性，同时对细胞的毒性非常低。
【附图说明】
[0032] 以下结合【附图说明】本发明的特征和有益效果。
[0033] 图1为重组抗病毒蛋白P9-ISG20克隆的设计图。P9与ISG20之间加入EGFP以及两个 3 X (GGGGS)连接序列，构成P9-ISG20的融合表达框。
[0034] 图2为重组抗病毒蛋白pcDNA-P9-EGFP-ISG20表达载体的结构示意图。
[0035] 图3为重组抗病毒蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20克隆的设计图。P9与ISG20之间加入 EGFP以及两个3 X (GGGGS)连接序列，在端加上HIV-1TAT穿膜肽，构成TAT-P9-EGFP-ISG20的融合表达框。
[0036] 图4为重组抗病毒蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20表达载体的结构示意图。
[0037] 图5 (图5A~图5E)为重组抗病毒蛋白P9-EGFP-ISG20抑制PRRSV感染的结果图。
[0038] 图6为重组抗病毒蛋白P9-EGFP-ISG20和PRRSV聚合酶的免疫荧光共定位图。
[0039] 图7为双分子荧光互补检测重组抗病毒蛋白P9-EGFP-ISG20与PRRSV聚合酶相互作 用结果图。
[0040] 图8为重组抗病毒蛋白P9-ISG20抑制PRRSV正链RNA与负链RNA合成的结果图。
[00411图9为重组抗病毒蛋白TAT-P9-ISG20抑制PRRSV复制及其自身进入细胞能力的检 测结果图。
[0042] 图10为重组抗病毒蛋白P9-ISG20和重组抗病毒蛋白TAT-P9-ISG20的细胞毒性MTT 检测结果图。
【具体实施方式】
[0043] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0044] 本发明所用到的细胞和试剂来源如下：
[0045] MARC-145细胞购自美国ATCC
[0046] 胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司
[0047] P9肽、EGFP和猕猴(Macaca mulatta)ISG20基因由南京金斯瑞公司合成；
[0048] PrimeScript ? reagent Kit反转录试剂盒与SYBR Premix Ex Taq?贝勾自TaKaRa 公司；
[0049] 退火缓冲液:购自碧云天(Beyotime)公司；
[0050]无细胞表达系统:购自天根生化。
[0051]若无特别说明，实施例中的百分比的含义为体积百分比。
[0052]实施例1重组抗病毒蛋白P9-ISG20表达载体的构建
[0053] 本实施例构建一个新的克隆 P9-Linker-EGFP-Linker-ISG20(P9-ISG20)，该克隆 将P9与ISG20相融合，构建于p⑶NA3.1( + )真核表达载体上。为了荧光检测实验，EGFP基因与 ISG20的N端末尾通过两个连接序列3 X (GGGGS)相连接，具体的克隆的设计图如图1所示。构 建方法如下：
[0054] 1)构建pcDNA-P9质粒载体
[0055] 将P9正向和反向引物利用退火结合的方法构建出P9基因，P9正向引物和反向引物 如下所示(其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.7~8所示）：
[0056] P9正向引物：
[0057] 5，-AGCTTCACATCAGGCTGACATTGAGCAGAAATAAGAACACCG-3，
[0058] P9反向引物：
[0059] 5 '-AATTCGGTGTTCTTATTTCTGCTCAATGTCAGCCTGATGTGA-3 '
[0060]使用退火缓冲液根据碧云天退火缓冲液操作说明书进行退火操作，获得P9基因后 通过酶切位点Hindlll与EcoRI将其克隆至载体pCDNA3.1 ( + )即得。
[0061 ] 2)构建 pCDNA-P9-EGFP-ISG20 表达载体
[0062] 用ISG20正向引物与反向引物通过PrimeSTAR PCR根据宝生物公司PrimeSTAR高保 真酶说明书扩增出ISG20基因，ISG20正向引物和反向引物如下所示（其核苷酸序列如序列 表SEQ ID吣.9~10所示）：
[0063] ISG20正向引物：5 ' -AAGCTTATGGCTGGGAGCCGTGAGGT-3 '
[0064] ISG20反向引物：5 ' -GAATTCTCAGTCTGACACAGCCAGGC-3 '
[0065] 根据艾思进生物公司胶回收试剂盒说明书纯化回收目的基因片段，根据同源重 组试剂盒说明书以同源重组方法将目的片段克隆至前述质粒PCDNA-P9中，同源重组时不需 要酶切位点参与，连接后P9-ISG20基因两端酶切位点仍为Hindlll-EcoRI;形成质粒名称为 PCDNA-P9-EGFP-ISG20。
[0066] 3)构建 pcDNA-P9-EGFP-ISG20 表达载体
[0067]用引物F2与R2退火扩增得到片段f2,用F3与R3以pEGFP-Nl为模板扩增得到片段 f3，用F4与R4退火扩增得到片段f 4，用F5与R1以MonkeyCDNA为模板扩增得到片段f 5，将片段 f2、f3、f4与f5混合，根据同源重组试剂盒说明书以同源重组方法进行重组，用F1和R1进行 扩增，同源部分相连得到目的片段。引物？1、1?^2、1?2、？3、1?3、？4、1?4和？5的序列如下所示 (其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 11~19所示）：
[0077]目的片段通过Hindlll与EcoRI位点使用同源重组试剂盒通过同源重组被克隆到 pCDNA3.1 ( + )上，得表达载体pcDNA-P9-EGFP-ISG20，其结构如图2所示。
[0078] 实施例2重组抗病毒蛋白TAT-P9-ISG20表达载体的构建
[0079]以实施例1构建的pcDNA-P9-EGFP-ISG20质粒为模板，设计含有TAT基因序列的引 物，使用同源重组试剂盒通过同源重组方法将TAT连接进入P9-EGFP-ISG20基因 N端，扩增引 物如下(其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 20~21所示）：
[0080] 上游引物：
[0081 ] 5 '-AAGCTTTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACACATCA-3，
[0082]下游引物：
[0083] 5 '-GAATTCTCAGTCTGACACAGCCAGGCGGGGCAGCCCTCGGCGG-3，
[0084] 纯化回收扩增的TAT-P9-EGFP-ISG20基因，以实施例1中同源重组方法将目的基因 TAT-P9-EGFP-ISG20基因克隆至无细胞表达载体pIVEX-HisTag，得到表达载体pIVEX TAT-P9-EGFP-ISG2(LpIVEX-HiS Tag为本发明实施例所用到的无细胞表达系统中所附带的表达 质粒。
[0085]重组抗病毒蛋白TAT-P9-ISG20表达载体的克隆的设计图如图3所示；重组抗病毒 蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20表达载体的结构示意图如图4所示。
[0086] 实施例3重组抗病毒蛋白P9-ISG20对PRRSV病毒感染的抑制
[0087] (1)培养MARC-145细胞，铺细胞至24孔细胞培养板，细胞生长至70%时待用；
[0088] (2)转染实施例1构建的重组抗病毒蛋白P9-ISG20表达载体、作为对照的P9和 ISG20表达载体及空载;具体步骤如下：将50微升1640RIPM无血清培养基与2微升转染试剂 (脂质体2000)混合均匀。将50微升1640RIPM无血清培养基与0.5微克表达质粒载体混合均 匀。将转染试剂和表达质粒载体混合均匀，室温放置5分钟，然后直接加入细胞孔中，37 °C培 养箱中继续培养24小时；
[0089] (3)转染后24小时后，弃去细胞孔内液体，用1640RIPM无血清培养基洗涤细胞3次。 向细胞孔内加入PRRSV病毒(病毒计量MOI 0.1)，37°C培养箱中孵育2小时，孵育完成后弃去 病毒液，用1640RIPM无血清培养基洗涤细胞一次，然后每孔中加入500微升含2 %胎牛血清 的1640RIPM培养基，37 °C培养箱中继续培养24小时，收集细胞样品检测；
[0090] (4)荧光定量PCR法检测抗病毒能力：Trizol法提取细胞内总RNA，用PrimeScript ? reagent Kit进行反转录，GAPDH作为内参。反转录后得到的cDNA样品加入SYBR Premix Ex Taq ?，利用一步法反应，用于实时荧光PCR反应检测。反应结果的荧光相对变化用2_aact 方法进行计算，结果以平均值和标准差的形式体现，实验结果均重复3次。用于荧光实时定 量PCR的引物如表1所示(其核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.22~31所示）；
[0091]表1用于荧光实时定量PCR的引物
[0092]
[0093] (5)通过TCID50法对细胞内病毒的含量进行定量比较，具体为：取96孔细胞培养 板，每个孔大约传8000~10000个细胞。每个孔的细胞长至大约60%即可开始测定实验。在 ep管中用无血清的培养基1〇倍倍比稀释病毒原液，如等，根据病毒大致的 滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。根据接种的孔数稀释病毒，每个稀释 度接种8孔。取细胞培养板，用多道加样器(排枪)吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在 每孔中再轻轻吹打一次。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100微升，37°C培养箱中孵 育2小时，取出细胞板吸去病毒液，加入含2%胎牛血清培养基200微升，继续在37°(：、0) 2培 养箱中培养3-5天后，取出培养板，显微镜下观察细胞病变，记录病变孔，用Reed-Muench公 式计算TCID50值。
[0094] 结果如图5A和图5B所示，图5A和图5B表明重组抗病毒蛋白P9-ISG20对PRRSV具有 非常显著抗病毒能力，与P9和ISG20相比抗病毒效果均有显著提高。
[0095]实施例4重组抗病毒蛋白P9-ISG20对PRRSV的时间依赖效应和剂量依赖效应
[0096] 针对时间依赖效应，按实施例3中的方法进行表达质粒载体转染，然后接种病毒。 接毒后的24小时和48小时分别收样，然后实时定量检测。针对剂量依赖效应，转染时加入每 孔中的表达质粒载体量分为不同剂量，分别是0.1、0.5、1.0、2.0、3.0微克/孔，接毒和培养 方法同前述，接毒后24小时收集细胞样品检测，检测方法同实施例3。
[0097] 结果如图5D和图5E所示，图?表明P9-ISG20在24小时和48小时的时间点内均能够 有效抑制PRRSV病毒的复制，图5E表明重组抗病毒蛋白P9-ISG20对PRRSV的抑制呈现剂量依 赖性，2pmol的剂量下呈现出非常高的抗病毒能力，但进一步提高浓度却并不能提升抗病毒 效果。
[0098]实施例5免疫荧光法间接检测重组抗病毒蛋白P9-ISG20对PRRSV的抑制 [0099]铺2 X 106个细胞至6孔细胞培养板，待细胞长至汇合度为60%开始转染实验。转染 步骤为：混合8微升脂质体2000和2.0微克pcDNA-P9-EGFP-ISG20表达载体，直接加入细胞 中，继续在37°C培养箱中培养24小时。然后将细胞接种病毒(MOI 0.1)，37°C培养箱中孵育2 小时后弃去病毒液，加入含2 %胎牛血清的1640RIPM培养基2毫升，继续培养24小时;取出细 胞培养板，去掉细胞上清，PBS洗涤1次，4% (v/v)多聚甲醛固定细胞1小时。在细胞中加入 PRRSV N蛋白抗体孵育2小时，PBS洗涤细胞3次，加入红色荧光二抗孵育2小时，PBS洗涤细胞 3次，加入DAPI细胞核染料孵育15分钟，PBS洗涤细胞5次，显微镜观察细胞荧光。
[0100] 结果如图5C所示。图5C表明在重组抗病毒蛋白P9-ISG20没有表达的细胞中，病毒N 蛋白的表达量很高;而在重组抗病毒蛋白P9-ISG20过表达的细胞中几乎检测不到任何病毒 N蛋白的表达，说明在重组抗病毒蛋白P9-ISG20过表达的细胞中，PRRSV的复制可以得到抑 制。
[0101] 实施例6重组抗病毒蛋白P9-ISG20与PRRSV聚合酶的共定位
[0102] 铺2X106个细胞至6孔细胞培养板，待细胞长至汇合度为70%开始转染实验。
[0103] 转染步骤为：混合8微升脂质体2000和2.0微克pcDNA-P9-EGFP-ISG20表达载体及 2.0微克pFlag-PRRSV polymerase-mCherry表达质粒，直接加入上述细胞中，继续在37°C培 养箱中培养36小时。PBS洗涤细胞三次，向细胞加入DAPI染色液，染色10分钟，PBS洗涤细胞 五次，焚光显微镜观察。
[0104] 结果如图6中A所示，带EGFP标签的重组抗病毒蛋白P9-ISG20在细胞中发绿色荧光 (上图），带mCherry标签的PRRSV聚合酶在细胞中法红色荧光表达（中图），叠加图显示两者 在细胞质中的荧光呈共定位表达，呈黄色荧光（下图），说明重组抗病毒蛋白P9-ISG20与 PRRSV聚合酶在细胞质中共定位，两者之间有相互作用。
[0105] 实施例7重组抗病毒蛋白P9-ISG20、PRRSV聚合酶与PRRSV病毒RNA的共定位 [0106]铺2 X 106细胞至6T细胞培养板，待细胞长至汇合度为60 %开始转染，转染步骤为： 混合8微升脂质体2000和2.0微克表达质粒载体，直接加入细胞中，继续在37°C培养箱中培 养24小时。将细胞接种病毒(M0I 0.1)，37°C培养箱中孵育2小时，然后弃去病毒液，加入含 2% (w/w)胎牛血清的1640RIPM培养基2毫升，继续培养24小时；取出细胞培养板，去掉细胞 上清，PBS洗涤1次，4%多聚甲醛固定细胞1小时。在细胞中加入带蓝色荧光的PRRSV GP7基 因探针孵育2小时，PBS洗涤细胞5次，显微镜观察细胞荧光。
[0107] 结果如图6中B所示，带EGFP标签的重组抗病毒蛋白P9-ISG20在细胞中发绿色荧 光，带mCherry标签的PRRSV聚合酶在细胞中发红色荧光表达，病毒GP7核酸被探针检测到后 发蓝色荧光，叠加图显示两者在细胞质中的荧光呈共定位表达，呈白色荧光，说明PRRSV聚 合酶在催化病毒核酸复制的时候，P9-ISG20能够结合到PRRSV聚合酶与核酸发生反应的位 置。
[0108] 实施例8双分子荧光互补检测重组抗病毒蛋白P9-ISG20与PRRSV聚合酶的特异性 相互作用
[0109] 双分子焚光互补实验（BiFC)实验步骤如Shimozono，S.，Miyawaki，A.， 2008.Engineering FRET constructs using CFP and YFP.Methods Cell Biol.85,381-393.-文中所述，绿色荧光蛋白Venus被分为N端氨基酸序列（1-173，VN)与C端氨基酸序列 (174-239，￥〇，￥1〇^1?1?￥的聚合酶与螺旋酶相融合，￥(：与重组抗病毒蛋白？9-13620与？9-ISG20的阴性对照Scramble P9-ISG20融合，如图7中A的示意图所示。将MARC-145细胞在六 孔板里培养至60%密度时，将VN、VC与上述融合蛋白的表达载体按图7中B的组合方式用 lipofectamine 2000转入细胞中，转染14小时后将细胞用roS洗涤细胞1次，4%多聚甲醛固 定细胞1小时，然后在荧光显微镜下进行镜检。
[0110] 结果如图7中B所示，VN和VC蛋白在没有连接其他蛋白时，不会发生结合，因此没有 出现绿色荧光。在VN连接病毒的解螺旋酶蛋白和VC连接P9-ISG20蛋白时，以及VN连接病毒 聚合酶蛋白和VC连接无序P9-ISG20蛋白时，都没有出现结合而产生绿色荧光。当VN连接病 毒聚合酶和VC连接P9-ISG20蛋白共同表达于细胞质时，由于P9-ISG20与病毒聚合酶的亲和 力使VN和VC蛋白发生结合，从而组成完整的EGFP蛋白发出绿色荧光。
[0111] 实施例9重组抗病毒蛋白P9-ISG20抑制PRRSV正链与负链RNA的合成
[0112] 本实施例的操作步骤与实施例3的步骤(4)一致，所使用的引物也请见于表1。
[0113] 结果如图8所示，过表达重组抗病毒蛋白P9-ISG20后PRRSV的正链RNA与负链RNA的 水平均有显著下降，说明重组抗病毒蛋白P9-ISG20能够有效抑制PRRSV的正链RNA与负链 RNA的合成。
[0114] 实施例10重组抗病毒蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20对PRRSV病毒感染的抑制
[0115] (1)将MARC-145细胞铺至24孔细胞培养板，长至汇合度为70 %左右，感染PRRSV病 毒(M0I 0.1)，37°C培养箱孵育2小时，换2% (w/w) 1640RIPM培养基，继续培养24小时；
[0116] (2)利用无细胞表达系统根据说明书利用实施例2所构建的无细胞表达载体 口1￥￡父-丁厶1'-?9-￡6卩?-1562〇41￥￡父-丁厶1'、口1￥￡父-?9-￡6卩卩-15620、体外表达不同的目的蛋白， BCA法测定目的蛋白浓度；
[0117] (3)向接毒后的细胞加入不同浓度的上述不同目的蛋白（各目的蛋白的浓度分别 为：10、25、50、100或250μg/ml)，加入蛋白后24小时收集细胞样品，实时定量检测；
[0118] (4)荧光定量PCR法检测抗病毒能力：Trizol法提取细胞内总RNA，用PrimeScript ? reagent Kit进行反转录，GAPDH作为内参。反转录后得到的cDNA样品加入SYBR Premix Ex Taq ?，利用一步法反应，用于实时荧光PCR反应检测。反应结果的荧光相对变化用2_aact 方法进行计算，结果以平均值和标准差的形式体现，实验结果均重复3次。用于荧光实时定 量PCR的引物也参见表1。
[0119] 结果如图9中A所示，对照的TAT蛋白对病毒的复制没有产生显著影响，P9-EGFP-ISG20蛋白在没有TAT转导蛋白帮助时，其抗病毒能力低于TAT-P9-EGFP-ISG20蛋白，TAT-P9-ISG20的抗病毒能力显著高于其他2个对照蛋白，与P9-EGFP-ISG20蛋白相比，带有TAT转 导序列的TAT-P9-EGFP-ISG20抗病毒能力提高了约1 ? 52倍。
[0120] 实施例11重组抗病毒蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20对PRRSV的时间效应和剂量效应
[0121] (1)将MARC-145细胞铺至24孔细胞培养板，长至汇合度为70 %左右，感染PRRSV病 毒(M0I 0.1)，37°C培养箱孵育2小时，换2% (w/w) 1640RIPM培养基，继续培养24小时；
[0122] (2)利用无细胞表达系统体外表达TAT-P9-EGFP-ISG20蛋白和TAT对照蛋白，BCA法 测定目的蛋白浓度，收获目的蛋白溶液放_80°C保存；
[0123] (3)向接毒后的细胞加入不同浓度的TAT-P9-EGFP-ISG20目的蛋白和TAT对照蛋 白，加入蛋白后24小时和48小时分别收集细胞样品，实时定量检测；
[0124] (4)荧光定量PCR法检测抗病毒能力：Trizol法提取细胞内总RNA，用PrimeScript ? reagent Kit进行反转录，GAPDH作为内参。反转录后得到的cDNA样品加入SYBR Premix Ex Taq ?，利用一步法反应，用于实时荧光PCR反应检测。反应结果的荧光相对变化用2_aact 方法进行计算，结果以平均值和标准差的形式体现，实验结果均重复3次。用于荧光实时定 量PCR的引物如表1所示。
[0125] 结果如图9中B和图9中C所示，图9中B表明TAT-P9-EGFP-ISG20蛋白具有长效的抗 病毒的能力，抑制病毒的能力在24小时和48小时均能产生作用；图9中C表明重组抗病毒蛋 白TAT-P9-EGFP-ISG20对PRRSV的抑制呈现剂量依赖性，100μg/ml的剂量下呈现出非常高的 抗病毒能力，但进一步提高浓度却并不能提升抗病毒效果。
[0126] 实施例12免疫荧光法检测重组抗病毒蛋白TAT-P9-EGPF-ISG20细胞进入能力
[0127] (1)利用无细胞表达系统体外表达TAT-P9-EGFP-ISG20蛋白和P9-EGFP-ISG20蛋 白，BCA法测定目的蛋白浓度，收获目的蛋白溶液放-80°C保存；
[0128] (2)将Marc-145细胞铺至24孔细胞培养板，长至汇合度为70%，向细胞内加入100y g/ml或250μg/ml终浓度的表达蛋白，37°C培养箱内孵育1小时后取出细胞，PBS洗涤3次以 去除细胞上清中残留蛋白。
[0129] (3)使用带荧光检测功能的检测仪器检测细胞内EGFP的荧光值，每孔读值3次，计 算平均值。
[0130]结果如图9中D所示，随着重组抗病毒蛋白的剂量的升高，胞内EGFP荧光值也有显 著地上升，表明重组抗病毒蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20进入细胞的量随着蛋白剂量的加大而 升高。HIV-1TAT穿膜肽将重组抗病毒蛋白P9-ISG20进入细胞的能力提高了约1.57倍。
[0131] 实施例13重组抗病毒蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20和P9-EGFP-ISG20的细胞毒性检测
[0132] 本实施例的细胞毒性检测方法按照常规的MTT法进行(Chen et al. ,2008)。按照 前述方法，利用无细胞表达系统表达TAT-P9-EGFP-ISG20和P9-EGFP-ISG20蛋白，用肌^口-(4，5-dimethylthiazol_2-yl )_2，5-diphenyltetrazolium bromide]的方法检测CC50，即 将MARC-145细胞用200ylDMEM培养基在96孔板中培养，接下来将培养基吸掉换成MTT溶液 (PBS中5mg/ml)。处理四个小时之后甲瓒形成，将MTT溶液移除。接下来每个孔中加入DMS0溶 解细胞表面的甲瓒。含有甲瓒的样品用酶标仪测量其在590nm波长的吸光值。
[0133] 结果如图10所示，重组抗病毒蛋白TAT-P9-ISG20的CC5Q = 462.7μg/ml，重组抗病毒 蛋白P9-EGFP-ISG20的CC5〇 = 648.8μg/ml，两者对细胞的毒性都非常低，且重组抗病毒蛋白 TAT-P9-EGFP-ISG20对细胞的毒性比P9-EGFP-ISG20对细胞的毒性更低，说明重组抗病毒蛋 白TAT-P9-EGFP-ISG20可以作为潜在低细胞毒性药物加以应用。
[0134] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对 本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种重组抗病毒蛋白，其特征在于，其包括共价融合的位于N端的P9肽和位于C端的 ISG20蛋白，所述P9肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. 如权利要求1所述重组抗病毒蛋白，其特征在于，所述ISG20蛋白为猕猴(Macaca mulatta)或猪(Sus scrofa)的ISG20蛋白；和/或，所述P9肽与所述ISG20通过3 )(GGGGS连接 序列共价融合。3. 如权利要求1所述重组抗病毒蛋白，其特征在于，所述重组抗病毒蛋白还包括穿膜 肽，所述穿膜肽共价融合于所述重组抗病毒蛋白的N端，所述穿膜肽的序列较佳地如SEQ ID NO.6所示，所述穿膜肽的拷贝数较佳地为1个拷贝。4. 如权利要求1-3中任一项所述重组抗病毒蛋白，其特征在于，所述重组抗病毒蛋白还 包括共价融合的蛋白标签，所述蛋白标签较佳地为6 X His或EGFP，所述蛋白标签较佳地融 合于所述重组抗病毒蛋白的N端、C端或融合于所述重组抗病毒蛋白中的所述P9肽与所述 ISG20蛋白之间。5. 如权利要求4所述重组抗病毒蛋白，其特征在于，所述重组抗病毒蛋白的氨基酸序列 如序列表SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。6. -种编码如权利要求1-5中任一项所述重组抗病毒蛋白的核酸。7. 如权利要求6所述核酸，其特征在于，所述核酸的序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5 所示。8. -种包含如权利要求6或7所述核酸的重组载体。9. 一种包含如权利要求8所述重组载体的转化体。10. -种制备如权利要求1-5中任一项所述重组抗病毒蛋白的方法，其特征在于，所述 方法包括以下步骤:将如权利要求6或7所述核酸的表达载体进行表达。11. 如权利要求10所述方法，其特征在于，所述表达为在无细胞表达系统中表达。12. 如权利要求1-5中任一项所述重组抗病毒蛋白在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒 的药物中的应用。
【文档编号】C07K19/00GK105968211SQ201610340303
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】马志永, 刘珂, 侯凤香, 邵东华, 魏建超, 李蓓蓓, 邱亚峰, 史子学, 缪德年, 马改妮, 郇贝丽, 王飞飞
【申请人】中国农业科学院上海兽医研究所