抗菌抗病毒杂合多肽及其制备方法与应用

文档序号:10605985阅读:690来源:国知局
抗菌抗病毒杂合多肽及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明涉及抗菌抗病毒杂合多肽及其制备方法与应用,所述多肽的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和2所示。通过将编码所述多肽的基因克隆至表达载体pPICZαA,得到重组表达载体,然后转化毕赤酵母,用甲醇诱导表达,表达产物经纯化得到目标多肽。所述多肽在体外对多种细菌、病毒均具有抑杀作用,且不易产生抗性,可作为理想的抗生素替代品和人畜生物性抗菌抗病毒药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂等。
【专利说明】
抗菌抗病毒杂合多肽及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程及生物制药领域,具体地说,涉及一种新型的抗菌抗病毒杂 合多肽及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 抗生素对于控制、预防和治疗各种感染性疾病具有重要作用。由于抗生素的使用, 到20世纪80年代,人类几乎可以征服大部分的感染类疾病,然而,随着时间的推移以及抗生 素的滥用,耐药菌株愈来愈多。有监测发现,最具代表性的耐药菌株当中,耐药的葡萄球菌 已上升至40%;耐药的凝固酶阴性葡萄球菌则超过77%。现在,已经出现了能对抗所有抗生 素的耐药菌,抗生素耐药问题已严重威胁到人类和动物的安全与健康。解除耐药菌对人类 健康日益严重的威胁成为亟待解决的问题,因此新一类抗微生物物质的发现和研制已经成 为国际上研究的热点,但是同时兼具抗菌及抗病毒的活性肽研究较少。在畜禽和水产动物 养殖中,无论是病原微生物原发性感染或继发感染,最终常会发展为细菌和病毒混合感染, 而且近年来一些由于变异或非典型病毒(如禽流感病毒)和病原菌引发的临床或亚临床感 染越来越多,严重危害动物的生存和健康,我国每年因病死亡畜禽(其中死鸡3亿多只)的直 接经济损失高达400亿元以上,同时因饲料、人工、药物所致的间接损失在1000亿元以上。
[0003] 抗菌肽(Anti-microbial and Virus Peptide,AMVP)是由20~60个氨基酸残基组 成,兼具抗菌和抗病毒的活性肽。自上世纪70年代末Boman等首次从惜古比天蚕中发现天蚕 素以来,抗菌肽因其独特的杀菌机制和优良的理化性质吸引了越来越多专家学者的关注, 并已成为安全绿色抗生素添加剂替代品的理想选择,在畜牧业生产中具有广阔的应用前 景。
[0004] Cecropin A是从惜古比天蚕免疫淋巴中提取的具有a螺旋结构的抗菌肽,由35个 氨基酸残基组成,具有广谱抑菌活性。利用荧光显微镜、电子显微镜和免疫胶体金技术对 Cecropin A进行研究发现,它作用于病原微生物后,可以在微生物细胞膜上形成电势依赖 型孔洞,引起细胞质溢流,最终导致细胞死亡,但其溶血性也比较严重,因此需要将它与其 他抗菌肽组合成新杂合肽使用。LL-37,相对分子质量约5000道尔顿,是迄今在人体中发现 的抗菌肽(〇81:1161;[(^(1;[11)家族中的唯一成员,也是人体内唯一具有双亲性(1螺旋结构的抗 菌肽。其广泛分布在人体的血液细胞和上皮细胞中,具有广谱抗菌作用。抗菌活性依赖其螺 旋构象的形成,通过"地毯样"机制杀灭细菌。此外,LL-37还具有中和内毒素的作用,能与 LPS和CD14结合,中和LPS的生物活性;利用FPRL1作为受体介导趋化作用,招募免疫细胞到 达感染部位,清除病原物;促进血管生成等作用。
[0005] 随着对抗菌肽类结构、功能与杀菌机理研究的深入,研究人员开始尝试利用生物 学方法设计杀菌活力更强、抗菌谱更广的新型抗菌肽。很多研究报道,将不同抗菌肽分子杂 合是获得高抗菌活性低溶血性的新型抗菌肽分子的有效方法。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是提供一种新型的抗菌抗病毒杂合多肽及其制备方法与应用。
[0007] 为了实现本发明目的,本发明人在对Cecropin A和LL-37的序列、结构分析的基础 上,进行杂合优化,获得一种新型的抗菌抗病毒杂合多肽,命名为C-L。与母源肽Cecropin A、LL-37相比,除了具有更强抗菌作用外,还有明显的抗病毒作用。所述多肽的氨基酸序列 如SEQ ID No. 1所示,或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列。
[0008] 例如,将第4位的Leu替换为lie,或者在其末端缺失Leu Arg Asn三个氨基酸,均不 会对蛋白的功能造成太大的影响。因此,本发明的抗菌抗病毒杂合多肽还包括SEQ ID No.1 所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸,形成的具有同等功能的由SEQ ID No. 1衍生的多肽。
[0009] 本发明还提供编码所述抗菌抗病毒杂合多肽的基因。所述基因的核苷酸序列如 SEQIDNo.2**。
[0010] 此外,应理解,考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏好性,本领域技术 人员可以根据需要选择使用适合特定物种表达的密码子。
[0011]本发明还提供含有编码多肽C-L基因的表达盒或表达载体。
[0012] 本发明还提供含有编码多肽C-L基因、或上述表达盒或表达载体的转基因细胞系 及工程菌。
[0013] 可将编码多肽C-L的基因与表达载体可操作地连接,构建得到能够表达多肽C-L的 重组表达载体,进而可以通过诸如热应激和电转化法等转基因方法,将所述表达载体导入 宿主细胞,得到导入了 C-L基因的转化体,例如基因工程菌。
[0014] 本发明还提供制备所述多肽C-L的方法,将构建的含有多肽C-L编码基因的表达载 体转化宿主菌,筛选阳性克隆,诱导表达目标多肽,并分离纯化表达产物。
[0015] 优选地,将编码多肽C-L的基因克隆至表达载体pPICZaA,转化毕赤酵母,筛选阳性 克隆,然后用甲醇诱导表达目标多肽,并分离纯化表达产物。
[0016] 更优选地,将编码多肽C-L的基因克隆至表达载体pPICZaA,得到重组表达载体 pPICZaA-C-L,通过电转化法转化至毕赤酵母GS115中,用甲醇诱导表达目标多肽,表达产物 经Ni-NTA Sepharose色谱柱纯化,分离获得目标多肽。
[0017] 以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、八叠球菌作为指示菌,结果发现该多肽 对这些菌均具有杀灭作用,此外,通过测定表明多肽C-L对病毒、常见细菌均有明显的抑制 作用,可研制出新型高效抗生素替代品。本发明的多肽C-L可用于制备抗菌药物、抗病毒药 物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂等。进而本发明还提供一种含有有效剂量多肽C-L的抗菌 药物、抗病毒药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂等。
[0018] 所述多肽C-L对包括但不限于金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、八叠球菌、大肠杆菌、梭 状芽孢杆菌、酵母、海洋红酵母、米曲霉、蜡状芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、格氏链球菌、嗜 热链球菌、牛链球菌、炭疽杆菌、伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、宋内氏痢疾杆菌、霍乱弧菌、肺炎杆 菌在内的微生物具有抗菌效果;对包括但不限于流感病毒、蓝耳病病毒等在内的病毒具有 抗病毒效果。
[0019] 本发明首次将Cecropin A和LL-37杂合,得到的多肽C-L可提高抑菌效果,且大大 降低了毒性和溶血性,成为理想的抗生素替代品,具有巨大的应用价值。
[0020] 采用本发明方法可以大量、高效地制备所述抗菌抗病毒杂合多肽,所制得的抗生 素替代品具有广谱抗菌、抗病毒的生物学特性,且不易产生耐药性。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明实施例1中重组表达载体pPICZaA-C-L的构建流程图。
[0022]图2为本发明实施例1中多肽C-L(包括组氨酸标签)对应目的基因的PCR扩增产物 凝胶电泳结果:其中,M,DNA分子量标准;1-5为目的片段。
[0023]图3为本发明实施例1中甲醇诱导表达杂合肽C-L经纯化后的SDS-PAGE电泳结果; 其中,M:蛋白质分子量标准;1-4分别为甲醇诱导48h、72h、96h和24h发酵上清液纯化后的目 的蛋白C-L条带;5为对照组。
[0024]图4为本发明实施例4中扫描电镜下观察多肽C-L对大肠杆菌CVCC245和金黄色葡 萄球菌ATCC25923的杀菌效果;其中,A1-A3分别表示杂合肽C-L处理大肠杆菌CVCC245 0、2、 4小时后的菌体形态结构图,B1-B3分别表示杂合肽C-L处理金黄色葡萄球菌ATCC25923 0、 2、4小时后的菌体形态结构图。
[0025] 图5为本发明实施案例6中抗菌抗病毒杂合多肽C-L对模拟胃肠液的稳定性;其中A 为金黄色葡萄球菌CVCC1882,B为金黄色葡萄球菌ATCC43300;图中1为实验组的抑菌圈,2为 对照组的抑菌圈。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例 均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0027] 以下实施例中使用的大肠杆菌感受态细胞Top 10、毕赤酵母GS115和表达载体 pPICZaA均购自 Invitrogen公司。
[0028]实施例1抗菌抗病毒杂合多肽C-L的制备
[0029] 将毕赤酵母GS115单菌落接种于3-5ml YH)(2%胰蛋白胨,2%葡萄糖,1%酵母粉, pH 7.0)液体培养基中,30°C下振荡培养12小时左右,按1:100-1:50的体积比接种于100ml YPD液体培养基中,30°C振荡培养至0D 6QQ= 1.3-1.5左右,停止培养。将培养液转入离心管 中,冰上放置10分钟,然后于4°C下1500g离心5分钟收集菌体。向菌体中加入预冷的无菌水 轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,于4°C 1500g离心5分钟。弃去上清,加入10ml预冷1M 的无菌山梨醇溶液,重悬菌体,即制成感受态细胞悬液。每管200yl分装成备用的毕赤酵母 感受态细胞,立即使用或保存于_70°C。
[0030]根据多肽C-L氨基酸序列(SEQ ID No. 1)和毕赤酵母密码子偏好,设计并合成多肽 C-L的基因序列(SEQ ID No.2),通过与表达载体pPICZaA相连(图1),构建该多肽的大肠杆 菌重组表达载体pP I CZaA-C-L,然后电转化大肠杆菌Top 10感受态细胞。
[0031]按照天根生化科技(北京)有限公司质粒小提试剂盒的操作方法提取重组质粒,作 为模板进行PCR扩增C-L基因,上游引物:5' -GCGAGAAAAGAAAGTGGAAGT-3';下游引物:5'-GAATAATGGTGATGGTGATGGT-3'。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察,鉴定转化结 果,显示有目的条带存在(图2)。测序进一步鉴定目的片段的插入是否正确,并检验插入片 段的保真度。经检验证实该抗菌多肽大肠杆菌重组表达载体pPICZaA-C-L构建成功。
[0032]将阳性克隆中提取的质粒转化毕赤酵母表达菌株GS115,方法如下:
[0033] 线性化的重组质粒5-10yg与200yl已活化毕赤酵母GS115感受态细胞混合,移入电 转杯,冰浴5_30min,冰浴后电转若干秒(电转过程中切忌振荡),然后迅速将混合液置于冰 上,迅速加入lml冰浴的1M山梨醇,使菌体悬浮混匀转至1.5ml EP管中,置于冰上,然后加入 2ml YH)液体培养基,30°C培养3h,使菌株复苏并形成抗性。待重组菌形成抗性后取200yl培 养液涂布含l〇〇μg/ml卡那霉素的YPDS平板,然后倒置平板于30°C过夜培养。挑选上述YPDS 平板上长出的单菌落接种于含l〇〇μg/ml卡那霉素的YPD液体培养基中过夜培养,质粒小提 中量试剂盒提取质粒,然后进行PCR验证。
[0034] 挑选阳性克隆接种于含100μg/ml卡那霉素的BMGY培养基中,30°C、180-200rpm摇 床培养至〇D6QQ为2-6时,低速离心收集菌体,用BMMY培养基重悬菌体至0D6QQ为1,30°C、 200rpm振荡培养,每隔24h添加甲醇至终浓度为5%诱导表达。分别在甲醇诱导0h、24h、48h、 72h、96h时取2ml菌液,12000rpm离心5min,收集上清后-20°C保存。以未经诱导的上清液作 为阴性对照。将收集的上清液进行Tricine-SDS-PAGE电泳,电泳结果显示出有杂合肽C-L表 达,经测定杂合肽表达量可达到190.65mg/L左右。
[0035]由于设计C-L基因序列时,在其C端添加了组氨酸标签(6 XHis),因此表达的目的 蛋白可与Ni-NTA Sepharose色谱柱中Ni离子结合,用不同浓度咪唑洗脱液对发酵上清液洗 脱并对洗脱峰样品进行收集,可实现目的蛋白的分离纯化。目的蛋白的Ni-NTA Sepharose 色谱柱纯化方法参照产品使用说明,收集各洗脱峰样品,通过Tricine-SDS-PAGE电泳检测 纯化效果(图3)。
[0036]实施例2多肽C-L的热稳定性试验
[0037] 取实施例1中纯化的重组蛋白各200y 1分别于40 °C、60 °C、80 °C和100 °C水浴条件下 分别处理10、20、30!^11,用未处理的重组蛋白作为对照,以标准金黄色葡萄球菌为指示菌, 用抑菌圈直径法测定处理前后样品的抑菌效果。实验重复3次,取其平均值作为测定结果 (表 1)。
[0038]表1加热处理后重组目的蛋白C-L对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径
[0040] 结果表明,经过不同加热温度和时间的处理,对重组目的蛋白抑菌效果的影响是 不同的,当加热温度不超过60°C时,随着加热时间的延长,其抑菌圈直径基本没有变化;当 加热温度升高至80_100°C,其抑菌圈直径随温度增加和时间延长略有缩小,但仍表现出良 好的抑菌效果。
[0041 ]实施例3多肽C-L对常见细菌的抑制作用
[0042] 将经过干热灭菌(160°C,2h)的滤纸片(直径6mm),置于重组目的蛋白溶液(50yg/ ml)中充分浸泡24h,用无菌涂布器蘸取供试菌液,均匀地涂在培养基的表面制成含菌平板, 取出经充分浸泡的滤纸片贴在含菌平板上,每一培养皿贴1片,置于37°C的恒温培养箱中培 养24h,观察并测量抑菌圈的直径(表2)。
[0043] 表2杂合肽C-L对各常见细菌的抑菌圈直径
[0045]
[0046] 注:CVCC是指中国兽医微生物菌种保藏管理中心;本实验室是指中国农业大学饲 料生物技术实验室。
[0047] 从表2可以看出,抗菌杂合多肽C-L对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌等 致病菌有较强的抑制作用,而对于真菌如酵母菌、霉菌等也有不同程度的抑制效果,但是对 于益生菌如枯草芽胞杆菌、凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌的抑制作用很小,或基本没有抑制作 用。
[0048] 实施例4扫描电镜下观察多肽C-L的杀菌效果
[0049] 将大肠杆菌CVCC245和金黄色葡萄球菌ATCC25923过夜培养至对数生长期,用培养 基稀释菌液至0.5个麦氏比色单位(约108CFU/ml),然后将多肽C-L加入到稀释后的菌液中 至其终浓度为1 XMIC,37 °C 180rpm振荡培养,分别于Oh、2h、4h取混合液4ml,12000rpm离心 lOmin,弃上清,用PBS缓冲液清洗菌体沉淀3次,加入500y 1 2.5 %戊二醛重悬固定菌体,4 °C 过夜。固定完成后PBS冲洗3次,每次lOmin,锇酸二次固定2h;再用PBS冲洗三次,梯度乙醇 (50 %-100 % )脱水,每次15min,最后用无水乙醇处理2次,每次处理15min;用丙酮处理处理 30min;用纯包埋剂过夜处理样品;70°C过夜加热聚合,用莱卡超薄切片仪切片;用醋酸双氧 铀50%饱和溶液染色15min~lh,双蒸水清洗晾干后置于日立H-7650透射电镜下观察。
[0050]由图4可见,未经抗菌肽处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞表面光滑,呈现出 完整的杆状和葡萄状结构;而经杂合抗菌肽C-L处理2h后,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞 膜表面均出现了很多"孔洞",并且随着作用时间的延长,在处理4h后,视野里能看到很多细 胞的形态发生变化,有的细胞内凹,出现瘪态;有的细胞表面出现丝状物;甚至很多菌体细 胞已经裂解为大量的碎片。这些结果揭示了菌体细胞表面"孔洞"形成是造成菌体细胞裂 解、死亡的主要原因,也是杂合抗菌肽C-L发挥抑菌作用的主要方式。
[0051 ]实施例5多肽C-L对病毒的抑制作用 [0052] 1、药物细胞毒性实验(LD0测定)
[0053] 对多肽C-L进行2倍浓度梯度稀释,共8个稀释度,即100、50、25、12.5、6.25、3.125、 1.563和0.782μg/ml。取各稀释度液体0.2ml加入细胞管中(各稀释度3管),37 °C培养7天,观 察Marc-145细胞病变。结果表明多肽C-L第2管(50μg/ml)至第8管(0.782μg/ml)未出现病 变,故LD0 = 100。
[0054] 2、病毒感染量滴定(TCID50测定)
[0055] (1)流感病毒10倍稀释,共3个稀释度,即HT1、1 (T2、10_3。各稀释度病毒液0.2ml加 入细胞管中(每稀释度5管),37 °C培养7天,观察Marc-145细胞病变。按Reed-Muench法计算 结果:TCID50 = 10-5'7。
[0056] (2)蓝耳病病毒10倍稀释,共3个稀释度,即1〇4、1〇4、1(^3。每稀释度病毒液0.21111 加入细胞管中(各稀释度5管),37 °C孵育lh后吸去病毒液,hand ' s液洗3遍,加入维持液,37 。(:培养7天,观察Marc-145细胞病变。按Reed-Muench法计算结果:TCID50 = 10-4'6。
[0057]实施例6多肽C-L在模拟胃肠消化液中的稳定性
[0058]取0.5mL实施例1制备的含有抗菌抗病毒杂合多肽的上清液加至5mL pH值2.5的人 工模拟胃液中,置于37°C水浴锅中,避光保温消化3h,然后用O.lmol/L氢氧化钠溶液调pH值 至6.8,再加入5mL人工模拟肠液,置于37°C水浴锅中,避光保温消化4h,待消化完成后,迅速 冷却。同时添加与消化液等体积的生理盐水作为对照组。
[0059] 分别以金黄色葡萄球菌ATCC43300和金黄色葡萄球菌CVCC1882为指示菌观察处理 前后杂合多肽C-L的活性变化。分别吸取0.2mL金黄色葡萄球菌ATCC43300与金黄色葡萄球 菌CVCC1882的菌悬液均匀涂布于培养基表面;每个平板等距放入4个牛津杯,每个牛津杯加 入相应处理的杂合多肽C-L 200此,做3个平板重复。置于恒温培养箱中,37°C培养24h。取出 牛津杯,分别测定经胃肠液消化后与加入生理盐水处理的杂合肽C-L的抑菌圈直径,比较其 活性变化。
[0060]抗菌抗病毒杂合多肽C-L经过模拟胃肠液消化后对金黄色葡萄球菌的抑菌效果如 图5所示。结果表明,杂合多肽C-L对于两株指示菌均能保留90%左右的抑菌活力(表3),说 明该多肽在模拟胃肠道环境(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、强酸性pH值2.5)中具有较高的稳定 性。
[00611表3抗菌抗病毒杂合多肽C-L经模拟胃肠液处理后抑菌圈直径
[0063]通过耐高温试验、攻毒保护试验、抗菌实验、抗病毒试验、耐胃肠消化液试验等表 明,本发明的抗菌抗病毒杂合多肽C-L是一种稳定的广谱抗菌肽,而且对革兰氏阳性菌具有 较强的杀伤力,这可能是由抗菌肽的种类和特性决定的。同时,抗菌多肽虽然具有广谱抗菌 活性,但它对于不同的微生物甚至同种菌不同株,在杀伤效率上可能存在差异。
[0064]实验表明,多肽C-L的衍生物也具有与多肽C-L近似的抗菌抗病毒功能,例如将多 肽C-L第4位的Leu替换为lie,或者在其末端缺失Leu Arg Asn三个氨基酸得到的多肽衍生 物。
[0065]虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在 本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种抗菌抗病毒杂合多肽,其特征在于,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所 示,或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2. 编码权利要求1所述多肽的基因。3. 如权利要求2所述的基因,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。4. 含有权利要求2或3所述基因的表达盒或表达载体。5. 含有权利要求2或3所述基因,或权利要求4所述表达盒或表达载体的工程菌。6. 权利要求1所述多肽的制备方法,其特征在于,将权利要求4所述的表达载体转化宿 主菌,筛选阳性克隆,诱导表达目标多肽,并分离纯化表达产物。7. 根据权利要求6所述的方法,其特征在于,将权利要求3所述基因克隆至表达载体 pPICZaA,转化毕赤酵母,筛选阳性克隆,然后用甲醇诱导表达目标多肽,并分离纯化表达产 物。8. 权利要求1所述多肽在制备抗菌药物、抗病毒药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂中 的应用。9. 根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述多肽对包括金黄色葡萄球菌、沙门氏 菌、八叠球菌、大肠杆菌、梭状芽孢杆菌、酵母、海洋红酵母、米曲霉、蜡状芽孢杆菌、嗜热脂 肪芽孢杆菌、格氏链球菌、嗜热链球菌、牛链球菌、炭疽杆菌、伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、宋内氏 痢疾杆菌、霍乱弧菌、肺炎杆菌在内的微生物具有抗菌效果;对包括流感病毒、蓝耳病病毒 在内的病毒具有抗病毒效果。10. 含有权利要求1所述多肽的抗菌药物、抗病毒药物、饲料添加剂、防腐剂或消杀剂。
【文档编号】C07K19/00GK105968214SQ201610450899
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】张日俊, 卫旭彪, 黄燕, 张璐璐, 武如娟, 郑召君, 斯大勇, 廖秀冬
【申请人】中国农业大学
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