多个核酸靶标的分析方法

多个核酸靶标的分析方法
【专利摘要】本公开提供即使同时检测的核酸靶标的种类增加，检测荧光的光学系统也不变得复杂，能通过小型、廉价的构成分析多个核酸靶标的方法。本公开涉及的检测装置具备PCR处理部、边界检测部和检测部，所述PCR处理部对在流路中流淌的第1液滴至第4液滴进行PCR处理，所述边界检测部检测从PCR处理后的第1液滴至第4液滴输出的荧光强度，并基于荧光强度，获得在第5流路中流淌的第1液滴至第4液滴各自之间的边界，所述检测部基于荧光强度和第1液滴至第4液滴各自之间的边界，获得具有第1阈值以上的荧光强度的第2液滴和第4液滴的数，并基于第2液滴和第4液滴的数检测对象核酸靶标中是否包含选自第1核酸靶标和第2核酸靶标中的至少1种。
【专利说明】
多个核酸靶标的分析方法
技术领域
[0001 ]本公开涉及核酸靶标的分析方法。
【背景技术】
[0002]作为用于实现核酸靶标分析的基本技术，一般采用以下方法:使用称为PCR(聚合酶链反应)的技术，使DNA、RNA等的核酸中的所希望的核酸靶标扩增至检测所需的量，进行检测。另外，作为其发展形式，一般使用称为qPCR(定量PCR，quantitative PCR)的定量分析技术。这些核酸靶标的定量分析技术被导入到微流路芯片内的小型反应器等中。
[0003]专利文献I中关于对基因进行定量分析的qPCR记载了基本的实现方法。该专利文献I中记载了以下方法:使包含单链DNA的样品，与具有靶标DNA的序列链的第一区域的互补序列的寡核苷酸(长度较短的DNA/RNA的序列)、以及包含相同靶标DNA的序列链的第二区域的互补序列的标记寡核苷酸接触，在发生杂交的条件下形成双链复合体的混合物，通过5’—3’核酸酶活性来切断退火后的标记寡核苷酸而使标记片段游离，检测该游离的标记片段。作为标记寡核苷酸的标记片段，如果使用荧光色素和猝灭剂，则在标记片段游离时才发出荧光，因而通过重复上述工艺，荧光强度越来越强。一般地，发生杂交的条件、产生核酸酶活性的条件等，可通过使样本暴露于一定温度条件来实现。即，重复上述工艺，是指对样本重复规定的温度的升高降低(温度循环)。通过用光检测器来检测该荧光强度的强弱，调整上述工艺的重复次数(温度循环的次数)与荧光强度的强弱的关系，可以分析以怎样的程度含有靶标DNA的所希望的序列链。在对每一样本检测多个部位的靶标的情况下，准备与各个序列链互补的标记寡核苷酸，通过使每个标记寡核苷酸的成为标记的荧光色素的材料、波长不同，可以在光检测器中根据荧光波长的差进行分离分析。
[0004]另外，专利文献2中对于对基因进行定量分析的方法公开了实现方法的一例。特别是公开了使用了乳化技术的高通量检定的改善技术。该方法使用乳化技术，制作出作为生化反应用的独立的反应腔室发挥功能的液滴，使用这些液滴来对各个亚成分(细胞、核酸、蛋白质等)进行处理、检查。
[0005]使包含DNA/RNA等的水滴在油中悬浮，能够制作水进入油中的状态的乳剂。用表面活性剂使该乳剂稳定化，能够使加热、冷却、运输中的液滴的结合减少或消失，由此能够实施在PCR技术等中进行的温度循环。因此，利用了 PCR的液滴中的核酸靶标分子的单拷贝扩增使用乳剂来实施。基于泊松统计来分析这些液滴内对某个靶标为阳性的液滴，能够推定样本中的靶标的浓度。在利用液滴的检定中，使用I种或多种荧光体作为液滴中的标记，从而得知是否发生扩增等反应。通过生成液滴、使其反应、接着测定从各液滴放出的光，从而能够判断液滴中是否存在靶标。如果使能够区分的不同的荧光体分别对应于每个不同的靶标，则能够测定每个液滴中是否存在多个不同的靶标。这样在区别多个不同的靶标的情况下，一般使用以下方法:使用多种荧光体、即发出不同波长的荧光的色素材料，根据其荧光波长来区别。在专利文献2中，公开了使用2种荧光色素，各自区别地检测的方法。设计分别对应于第I色素、第2色素的检测构成(包含光源和检测器)，在液滴通过流路的检测区域时，用对应于第I色素的检测构成和对应于第2色素的检测构成交互地检测液滴，从而实现。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献I:日本特许第2825976号公报
[0009]专利文献2:日本特表2013-524169号公报

【发明内容】

[0010]发明所要解决的课题
[0011 ]然而在现有的构成中，在DNA/RNA等核酸中同时检测作为目标的多个核酸靶标时，需要准备具有与各个核酸靶标的碱基序列互补的碱基序列的引物、探针等的反应药液，将修饰引物、探针等的荧光色素对每个核酸靶标分别变更，从而进行分离检测。另外，需要用于激发各个荧光色素的光源、用于检测各个荧光色素的荧光波长的光学系统。存在随着同时检测的核酸靶标的种类增加，对应的荧光色素的准备、检测荧光的光学系统变得复杂的课题。
[0012]本公开的目的在于提供在同时检测的核酸靶标的种类增加的情况下，检测荧光的光学系统也不变得复杂的、通过小型、廉价的构成来分析多个核酸靶标的方法。
[0013]用于解决课题的技术方案
[0014]本公开的使用微流路芯片来检测第I核酸靶标和第2核酸靶标的检测方法包括:
[0015](a)在检测装置中设置微流路芯片，
[0016]所述检测装置具备PCR处理部、PCR反应器、荧光检测部和检测电路，
[0017]所述微流路芯片具备第I流路、第2流路、第3流路、第4流路和第5流路，
[0018]所述第I流路的一端、所述第2流路的一端以及所述第3流路的一端与所述第4流路连接，
[0019]所述PCR反应器位于所述第4流路和所述第5流路的之间，
[0020](b)通过(i)从所述第I流路的另一端依次供给第I水溶液、第I油和第2水溶液，(? )从所述第2流路的另一端供给样品水溶液，和(m)从所述第3流路的另一端供给第2油，从而使由所述第I水溶液和所述样品水溶液组成的第I液滴、由所述样品水溶液组成的第2液滴、由所述第2水溶液和所述样品水溶液组成的第3液滴以及由所述样品水溶液组成的第4液滴依次通过所述第4流路，
[0021]其中，
[0022]所述第I水溶液具有第1DNA，所述第IDNA具有与所述第I核酸靶标互补的序列、并且被第I荧光色素修饰，所述第2水溶液具有第2DNA，所述第2DNA具有与所述第2核酸靶标互补的序列、并且被第2荧光色素修饰，
[0023](c)将通过所述第4流路到达所述PCR反应器的所述第I液滴至所述第4液滴，通过所述PCR处理部进行PCR处理，使所述PCR处理后的所述第I液滴至所述第4液滴通过所述第5流路，
[0024](d)所述第I液滴至所述第4液滴在所述第5流路中流淌时，通过所述荧光检测部，检测从所述第I液滴至所述第4液滴输出的荧光强度，
[0025](e)基于所述荧光强度，获得在所述第5流路中流淌的所述第I液滴至所述第4液滴各自之间的边界，
[0026](f)通过所述检测电路，基于所述荧光强度、和所述第I液滴至所述第4液滴各自之间的边界，获得具有第I阈值以上的荧光强度的所述第2液滴和所述第4液滴的数量，并且基于所述第2液滴和所述第4液滴的数量，检测所述样品水溶液中是否包含选自所述第I核酸靶标和所述第2核酸靶标中的至少I种。
[0027]发明的效果
[0028]根据本公开的多个核酸靶标的分析方法，在同时检测的核酸靶标增加的情况下，也能够不使微流路芯片的流路构成复杂化，另外，可以使用同一波长的修饰与核酸靶标一对一地反应的反应药液的荧光色素，因此检测荧光的光波导单元能够以简单的构成实现。由此，能够提供小型且廉价的装置构成。
【附图说明】
[0029]图1的上层是显示在微流路芯片的光波导单元的一支流路中流通的多个液滴群的概略图，下层是显示对于多个液滴群测量的输出信号的一例的图。
[0030]图2是显示反应药液库的构成的一例的概略图。
[0031]图3A是切下实施方式I所涉及的微流路芯片的流路的一部分的剖面后的立体图。
[0032]图3B是显示微流路芯片的构成的一例的概略图。
[0033]图4A是显示实施方式I中的流路合流部的构成的一例的概略图。
[0034]图4B是显示实施方式I中的流路合流部的构成的一例的概略图。
[0035]图5是显示PCR用反应器的构成的一例的概略图。
[0036]图6A是显示使用了TaqMan探针的PCR的各过程的概略图。
[0037]图6B是显示使用了TaqMan探针的PCR的各过程的概略图。
[0038]图6C是显示使用了TaqMan探针的PCR的各过程的概略图。
[0039]图7是显示实施方式I中的微流路芯片的光波导单元和核酸靶标分析装置的光学系统的构成的一例的概略图。
[0040]图8的上层是显示在微流路芯片的光波导单元的一支流路中流通的多个液滴群的概略图，下层是显示对于多个液滴群测量的输出信号的一例的图。
[0041 ]图9A是显示实施方式2中的流路合流部的构成的一例的概略图。
[0042]图9B是显示实施方式2中的流路合流部的构成的一例的概略图。
[0043]图10是显示实施例1的液滴的横穿时间的分布的分布图。
[0044]图11是显示实施例1的液滴间的油的横穿时间的分布的分布图。
[0045]图12是显示荧光液滴的比例与液滴中的核酸靶标的平均个数的关系的曲线图。
[0046]图13是显示实施例2的液滴的横穿时间的分布的分布图。
[0047]图14是显示实施例2的液滴间的油的横穿时间的分布的分布图。
[0048]标号的说明
[0049]101包含反应药液的液滴群
[0050]102包含反应药液的液滴群[0051 ]103不包含反应药液的液滴群
[0052]104不包含反应药液的液滴群
[0053]105包含核酸靶标的发出荧光的液滴
[0054]106不发出荧光的液滴
[0055]107来自发出荧光的液滴的光信号
[0056]108来自不发出荧光的液滴的光信号
[0057]109来自不包含反应药液的液滴的光信号
[0058]HO用于对液滴数进行计数的阈值水平
[0059]Hl用于对发出荧光的液滴数进行计数的阈值水平
[0060]112包含反应药液的液滴的横穿时间
[0061]113不包含反应药液的液滴的横穿时间
[0062]201药液罐
[0063]202药液罐的排出口
[0064]203反应药液
[0065]204第I 油
[0066]205空气孔
[0067]301Si基板等基材
[0068]302玻璃板
[0069]303流路
[0070]304微流路芯片
[0071]305前处理单元
[0072]306流路合流部
[0073]307PCR用反应器(核酸扩增单元)
[0074]308光波导单元
[0075]309样本供给口
[0076]310反应药液供给口
[0077]311油供给口
[0078]401第I供给流路
[0079]402第2供给流路
[0080]403第3供给流路
[0081 ]404流路的结合点(第4流路的一端)
[0082]405反应药液
[0083]406第I 油
[0084]407样品溶液
[0085]408第2油
[0086]409包含反应药液的液滴
[0087]410不包含反应药液的液滴
[0088]501PCR用反应器
[0089]502缺口
[0090]503供给口
[0091]504排出口
[0092]505包含反应药液的液滴
[0093]506不包含反应药液的液滴
[0094]601单链核酸
[0095]602单链核酸
[0096]603正向引物
[0097]604反向引物
[0098]605 探针
[0099]606荧光色素
[0100]607猝灭剂
[0101]700微流路芯片
[0102]701 Si基板等基材
[0103]702玻璃板
[0104]703 第5流路
[0105]704 液滴
[0106]705激光器
[0107]706准直仪
[0108]707 二向色镜
[0109]708 物镜
[0110]709滤光器
[0111]710 镜头
[0112]711 针孔
[0113]712 PMT
[0114]801包含反应药液的液滴群
[0115]802包含反应药液的液滴群
[0116]803不包含反应药液的液滴群
[0117]804不包含反应药液的液滴群
[0118]805包含核酸靶标的发出荧光的液滴
[0119]806不发出荧光的液滴
[0120]807来自发出荧光的液滴的光信号
[0121]808来自不发出荧光的液滴的光信号
[0122]809来自不包含反应药液的液滴的光信号
[0123]810用于对液滴数进行计数的阈值水平
[0124]811用于对发出荧光的液滴数进行计数的阈值水平
[0125]812包含反应药液的液滴的横穿时间
[0126]813不包含反应药液的液滴的横穿时间
[0127]901第I供给流路
[0128]902第2供给流路
[0129]903第3供给流路
[0130]904流路的结合点
[0131]905反应药液
[0132]906 第I油
[0133]907样品溶液
[0134]908 第2油
[0135]909包含反应药液的液滴
[0136]910不包含反应药液的液滴
[0137]911流路的结合点
【具体实施方式】
[0138]关于基因的检索方法进行说明。基因是承担生物的遗传信息的主要因子，在所有生物中以DNA、RNA等核酸作为媒介，由其碱基序列编码。近年，由于诊断基因的技术进步，基因的多样性分析、表达分析的进展惊人。特别是在医疗领域，基因信息与疾患的关系受到关注。例如，已经可以通过分析与疾患相关的各个基因信息(特定部位的D N A、R N A的碱基序列)，来进行适合每个患者的治疗、给药(订制医疗)。在订制医疗中，最期望当场诊断，要求POCT(床旁检测，现场即时检测，Point of Care Testing)性高、迅速、简便的方法。因此，强烈要求实现能够从血液等采集样本中提取、扩增包含分析对象基因的DNA、RNA等核酸，迅速、简便地检测其碱基序列信息或者其量的器件。这里，将作为分析对象的核酸称为核酸靶标。作为核酸靶标，包含DNA、RNA的碱基序列的内的一部分，或者血液、体液所含的信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)等这样的短核酸片段。
[0139]作为适应这些需求的单元之一，近年来，称为yTAS(微型全分析系统，yTotalAnalysis Systems)或LoC(芯片实验室，Lab on Chip)的器件受到关注。yTAS或LoC是在基板内设有由微米或者纳米极的微细结构构成的微流路、端口，在其结构内进行物质的混合、提取、纯化、化学反应和分析等各种操作的器件，一部分已经实用化。这样的器件由于各种操作在微细结构内进行，与所谓专门的研究所、分析机关等中使用的常用尺寸的同种装置相比，具有样品、试剂的使用量显著少，分析时间也短，灵敏度也高等特长。另外还能够实现小型的器件构成，不仅能在专门的研究所使用，还能够携带到现场实现当场分析。为了这样的目的而制作的、基板内具有微流路和端口等微细结构、安装了各种功能的结构物，总称为微流路芯片或微流体器件。
[0140]为了使用微流路芯片在短时间内分析样本中的核酸靶标，期望在芯片内整合包含作为检查对象的核酸靶标的核酸的提取、扩增、检测的功能。特别是为了在短时间内获得更多的信息，要求在同一芯片内一次分析多个样本，或者扩增、检测一个样本所含的多个核酸靶标(多元扩增和检测)。另外，根据用途不同，要求还分析样本所含的核酸靶标的量(定量分析)。
[0141]以下，对于本公开的实施方式所涉及的核酸靶标的分析方法和微流路芯片，参考附图进行说明。
[0142](实施方式I)
[0143]对于本公开的实施方式I中的分析多个核酸靶标的微流路芯片，参照图进行说明。图3A是显示实施方式I所涉及的微流路芯片的外观的立体图，图3B是显示微流路芯片的构成的一例的概略图。微流路芯片至少具备用于反应药液和第I油流淌的第I供给流路、用于包含核酸的样品溶液流淌的第2供给流路、用于第2油流淌的第3供给流路、生成包含反应药液的液滴群和不包含反应药液的液滴群的流路合流部、用于生成的液滴群流淌的第4流路、扩增液滴群中的各液滴中可能包含的核酸的核酸扩增单元、用于通过了核酸扩增单元的液滴群流淌的第5流路、能够将第5流路中的液滴群的透射光或反射光取出到外部的光波导单
J L ο
[0144]在流路合流部，第I供给流路、第2供给流路和第3供给流路合流，从而根据从第I供给流路供给的液体的种类，生成包含反应药液的液滴群和不包含反应药液的液滴群。
[0145]反应药液库具有保持多种反应药液(例如，第I反应药液、第2反应药液)的流路。例如，在流路中第I反应药液与第2反应药液之间配置有油，反应药液库分离地保持第I反应药液与第2反应药液。
[0146]多种反应药液分别与不同的核酸靶标一对一地反应，并且被荧光色素修饰。
[0147]此外，微流路芯片可以不一定具备反应药液库。只要根据需要从反应药液库向第I供给流路供给反应药液和第I油即可。
[0148]包含扩增后的核酸的多个液滴按照生成的顺序在一支流路中(第5流路中)流通。另外，第5流路由能够向包含扩增后的核酸的液滴透射来自外部的光、且能够将透射了液滴的透射光或透射所述液滴之后反射的反射光取出到外部的材料制成。
[0149]以下，对于反应药液库和微流路芯片进行说明。
[0150]<反应药液库>
[0151]图2是显示反应药液库的构成的一例的概略图。在分析多个不同的核酸靶标的情况下，需要分别准备包含具有与各个核酸靶标的碱基序列互补的碱基序列的引物、探针、或者用于进行核酸靶标的扩增的酶等的反应药液。药液罐201通过设置于内部的隔壁，而构成一支细的流路向排出口 202连续的形式，该流路中保持有反应药液203。如图所示，为了与不同的核酸靶标反应的多种不同的反应药液(图的阴影部分)彼此不混合，各个反应药液之间封入并保持有油(第I油)204。另外，除了排出口 202之外，还另外设有空气孔205，药液保存时将空气孔205堵住，在实际使用时通过开放该空气孔205，从而将药液罐201内的反应药液、油从排出口 202依次供给至微流路芯片。通过采取该构成，能够从药液罐201的排出口202向位于其前面的微流路芯片不混合地依次供给多种反应药液。即，构成了能够供给多种反应药液的反应药液库。
[0152]通过使用该反应药液库，对连接在排出口202的前面的微流路芯片内所形成的流路，如反应药液A、油、反应药液B、油、反应药液C这样交互地供给不同的多种反应药液和油。在图2中，对于反应药液的种类为A?J的10种的情况进行了描述，但本公开中只要是2种以上的反应药液，则其种类是多少种都可以。通过采取隔着油而分离地保持2种以上的反应药液的构成，即使在反应药液的种类增减的情况下，也能够同样地应对。另外，这里在药液罐201内设置壁而形成一支细的流路，但药液罐201的形状不限于该形状，只要能够交互地保持多种不同的反应药液和油、并能够从药液罐的排出口交互地供给反应药液和油，则即使不是该形状对效果也没有任何影响。例如，也可以是在药液罐内装入一支细的管状的管，在该管内交互地封入反应药液和油的形状。
[0153]<微流路芯片>
[0154]图3A和图3B是显示实施方式I中的微流路芯片的概略的图。图3A是切下微流路芯片的流路的一部分的剖面后的立体图。微流路芯片具有在Si基板301等基材上贴合了玻璃板302等的结构。Si基板301等基材形成了将表面通过蚀刻等技术挖入规定的宽度、深度而成为流淌液体的流路的沟。通过在Si基板301等基材的形成了沟的面上贴合玻璃板302等，从而形成样品、反应药液等流淌的流路303。使用这样制作的流路，能够使血、体液等包含核酸的样品流淌，使从图2所示的药液罐供给的反应药液流淌。另外，通过使这些流路结合、分支，能够将这些液体混合、分离。另外，通过同样的工艺，还可以在基材上形成进行各种处理的反应器等的任意形状。微流路芯片形成这些反应器等要素、连接它们的流路，使用栗、阀，从而能够在小的芯片内一边流淌少量的液体，一边自动进行各种处理。另外，如图3A那样，在贴合于Si基板等基材的板是玻璃板等透光的材料的情况下，能够从玻璃板侧向流路照射激光、灯光，或者测量来自在流路中流淌的液体的反射光、荧光等的光信号。这里，说明了将Si基板与玻璃板贴合的结构，但也可以两方均为玻璃板等，从而能够从两侧对在流路中流淌的反应药液、样品照射光、进行光检测。只要至少一方的板是透射激光、LED等的光、或者来自在流路中流淌的荧光色素的荧光等的材料即可。
[0155]实施方式I中的微流路芯片304如图3B所示，芯片304具有前处理单元305、流路合流部306、PCR用反应器307、光波导单元308。各要素通过液体流淌流路303连接。微流路芯片304具有用于输入血液、体液等样本的样本供给口 309、连接药液罐而供给反应药液库的反应药液供给口 310、供给用于液滴生成的油的油供给口 311。详细在后面叙述。
[0156]在前处理单元305中，从血液、体液等样本准备包含作为检查对象的核酸的样品溶液。为了进行后述的核酸扩增处理(PCR)，前处理单元305通过破坏细胞等而取出核酸。或者，为了仅将检查所需的物质供给后段，前处理单元305进行过滤。在前处理单元305中，只要能将样品溶液纯化到后段能够进行PCR程度，则无论进行怎样的处理，都对本公开的效果没有任何影响。被前处理单元305纯化后的样品溶液，被送液至接下来的流路合流部306。
[0157]在流路合流部306，使用从药液罐供给的反应药液和油而生成液滴和液滴群。此夕卜，关于流路合流部306中的液滴和液滴群的生成在后面叙述。
[0158]在流路合流部306生成的液滴群被供给至接下来的PCR用反应器307。在PCR用反应器307中进行核酸靶标的核酸扩增处理(PCR)。于是，由于仅在包含所希望的核酸靶标的液滴内进行核酸的扩增，因而包含核酸靶标的液滴内变成发出荧光的状态，不包含核酸靶标的液滴内变成不发出荧光的状态。PCR后的液滴群被送液到接下来的光波导单元中ICR用反应器例如可以是腔室和加热器。
[0159]在光波导单元中，对流过一支流路(第5流路)的液滴进行光学检测。例如，对流过的液滴的数量进行光学计数，测量液滴、液滴间的油的横穿时间，或者对液滴照射激发荧光的光，检测从液滴发出的荧光的强度。
[0160]图4A和图4B是显示流路合流部306的构成的一例的概略图。如图4A和图4B所示，第I供给流路401的一端、第2供给流路402的一端与第3供给流路403的一端，通过第4流路的结合点404连接。流路合流部306是指第I供给流路401、第2供给流路402、第3供给流路403以及包含结合点404的第4流路的总称。
[0161]第I供给流路401中，流淌多种反应药液405和位于多种反应药液405之间的第I油406。图4A是显示反应药液405从第I供给流路401流到结合点404时的状态的图。图4B是显示第I油406从第I供给流路401流到结合点404时的状态的图。
[0162]第I供给流路401的另一端与图2所示的药液罐连接。药液罐所含的多种反应药液405以及位于多种反应药液405之间的第I油406从第I供给流路401的另一端供给。具体地，按第I反应药液、第I油406、第2反应药液的顺序依次供给至第I供给流路401。第I反应药液和第2反应药液包含在多种反应药液405中。例如，第I供给流路401可以具有用于供给包含多种反应药液405的液体的栗。第I供给流路401的另一端相当于反应药液供给口 310。
[0163]从第2供给流路402的另一端供给包含作为检查对象的核酸的样品溶液。例如，第2供给流路402可以具有用于供给样品溶液的栗。第2供给流路402的另一端相当于样本供给P 309 ο
[0164]从第3供给流路403的另一端供给第2油408。例如，第3供给流路403可以具有用于供给第2油408的栗。第3供给流路403的另一端相当于油供给口 311。
[0165]第4流路的一端相当于结合点411。各液体从第I供给流路401、第2供给流路402、第3供给流路403分别以一定的流速流出来，在流路的结合点404使各液体合流(冲撞)ο如果水系的样品溶液407和反应药液405、与第I油406和第2油408在流路的结合点404合流，则水系的样品溶液407和反应药液405被第I油406和第2油408撕碎，生成液滴409。液滴409的大小由流路的结合点404的水系的溶液(例如样品溶液407和反应药液405)与油406、408的流量比决定。水系的溶液405、407的流量相对于油406、408的流量的比率越大，则生成的液滴409的大小越大。
[0166]水系的反应药液405与第I油406交互地从第I供给流路401流过来。反应药液405到达流路的结合点404时与第I油406到达时，液滴409的生成条件不同。图4A显示反应药液405到达流路的结合点404时的状态。在流路的结合点404，水系的反应药液405从第I供给流路401流过来，水系的样品溶液407从第2供给流路402流过来，并且第2油408从第3供给流路403流过来，从而合流。此时，第2油408撕碎水系的样品溶液407与反应药液405的混合液，如图4A所示，样品溶液407与反应药液405混合而成的液滴409隔着第2油408生成，构成液滴群。
[0167]图4B显示第I油406从第I供给流路401到达流路的结合点404时的状态。在流路的结合点404，第I油406从第I供给流路401流过来，水系的样品溶液407从第2供给流路402流过来，并且第2油408从第3供给流路403流过来，从而合流。此时，从第I供给流路401流过来的第I油406和从第3供给流路403流过来的第2油408撕碎水系的样品溶液407，如图4B所示，仅由样品溶液407形成的液滴410隔着第I油与第2油的混合液生成，构成液滴群。
[0168]由于各液体分别从第I供给流路401、第2供给流路402和第3供给流路403保持一定的流速流过来，因而在如图4A所示反应药液405从第I供给流路401到达流路的结合点404的状态下，与图4B所示的第I油406从第I供给流路401到达流路的结合点404的状态相比，液滴生成时水系的溶液的流量相对于油的流量的比率变大，因而生成的液滴的大小变大。即，在构成图2那样的药液罐(反应药液库)，使各液体分别保持一定的流速流到图4所示的流路合流部的情况下，包含反应药液的液滴群409与不包含反应药液的液滴群410交互地生成，并且包含反应药液的液滴409的大小与不包含反应药液的液滴410相比较大地生成。
[0169]另外，在如图4A那样反应药液405从第I供给流路401到达流路的结合点404的状态下，与图4B所示的第I油406从第I供给流路401到达流路的结合点404的状态相比，水系的溶液的流量相对于油的流量的比率变大，因而生成的液滴的大小变大，并且相反地液滴间的油的量变少。这取决于流路的结合点404的液滴生成时的水系的溶液与油的量的平衡。即，在图4A条件下生成的包含反应药液405的液滴群409中，与在图4B的条件下生成的不包含反应药液405的液滴群410相比，液滴间的油的量变少。即油部分的大小变小。
[0170]这些由流路的结合点404的液滴生成时的水系的溶液的流量与油的流量的平衡决定，在如图4A和B那样使第I供给流路401、第2供给流路402、第3供给流路403结合而成的流路合流部，如果构成从第I供给流路401交互地流淌反应药液与油的反应药液库，则即使使来自各供给流路的液体的流量为不同的设定，只要使从各个供给流路流过来的液体的流速分别为一定，则必然包含反应药液405的液滴409的大小相对于不包含反应药液405的液滴410的大小变大。另外，包含反应药液405的液滴409群内的油的大小相对于不包含反应药液405的液滴410群内的油的大小变小。
[0171]另外，这里对于图4A和B所示的流路构成进行了说明，但关于流路的结合方法，不限于该图所示的形状，是怎样的结合方法都没关系。例如可以是第I供给流路、第2供给流路与第3供给流路分别彼此具有90度的角度而结合、即结合成十字状等的形状。只要各液体从第I供给流路、第2供给流路和第3供给流路分别保持一定的流速供给，则即使结合的方法改变也不影响效果。
[0172]图5是显示进行核酸靶标的扩增的PCR(聚合酶链反应)用反应器的构成的一例的概略图。在PCR反应器内中，需要在流路合流部生成的液滴群不打乱生成的顺序地流通。因此，如图5所示，PCR反应器内也形成一支流路连续的形状，液滴一个一个地不改变顺序地流过。在该PCR用反应器内，通过PCR进行核酸扩增处理。
[0173]作为该PCR(聚合酶链反应)的一例，图6A?C是显示使用了称为TaqMan探针的荧光探针的利用PCR的核酸扩增处理的各过程的图。血液、体液等样本以在图3B所示的前处理单元中预先进行利用PCR的核酸扩增处理的方式被进行了处理。例如，包含破坏细胞，破坏外来体那样的血液、体液所含的内质网，或者从中通过过滤等技术浓缩高浓度的核酸等处理。为了进行利用PCR的核酸扩增处理，在进行了这些处理之后，需要制成具有某种程度的长度的碱基序列(至少与反应药液中的引物、探针相比充分长的碱基序列)的双链结构，因此，例如，如果以miRNA那样的20个碱基对左右的非常短的核酸片段作为核酸靶标，则需要将该miRNA转换成长的双链DNA的称为逆转录的处理，前处理单元中也包含这样的处理。关于该前处理工序的方法，只要不影响效果，可以采用任何方法。
[0174]如图6A所示，到达PCR反应器内的核酸具有互补排列的碱基序列的双链结构(601、602结合的状态)。将该核酸加热到某种温度，该双链解离，分成单链的核酸(601、602)。对包含该单链的核酸的样品，例如在单链核酸601是想检测的核酸靶标的情况下，使其与具有核酸靶标601的序列链的第一区域的互补序列的引物(603)、和包含相同的核酸靶标的序列链的第二区域的互补序列的荧光探针(用荧光色素标记后的寡核苷酸、605)接触，调整到发生杂交的条件，则引物603、荧光探针605与核酸靶标601形成双链复合体(参照图6A)。另外，使不是核酸靶标的单链DNA602也结合对应的引物604。但是，因为不是想检测的核酸靶标，因而不结合荧光探针605。
[0175]然后，调整到形成5，—3，核酸酶活性的条件，则核酸合成酶开始工作，以结合于单链核酸601和602的引物603和604为基点，核酸的延伸开始(参照图6B)。
[0176]核酸的延伸进行，则使结合于核酸靶标601的荧光探针605游离(参照图6C)。荧光探针605所含的荧光色素606与粹灭剂607在游离之前存在于接近的区域，因而荧光色素不发光，由于核酸的延伸而荧光探针游离，结果荧光色素606与猝灭剂607分离，则荧光能够显色。通过这一系列循环，针对一条核酸靶标，一个荧光色素游离，变得能够发光。另外，通过核酸的延伸，单链核酸分别形成双链核酸，核酸被扩增成2倍。即，通过重复该过程，根据重复次数，核酸的数量被扩增2的乘方倍，另外同样地荧光色素的游离也发生2的乘方倍。在样品中包含作为检测对象的核酸靶标的情况下，通过重复该过程，能够发光的荧光色素的量越来越增加。
[0177]此外，虽然根据引物、荧光探针的种类不同而条件不同，但大多为了使双链核酸分离成单链核酸而加热到90°C前后的温度，为了使引物、荧光探针杂交而加热到60 °C前后的温度，为了形成核酸酶活性而使核酸合成酶工作、进行核酸的延伸而加热到70°C前后的温度。即，利用PCR的核酸扩增处理在这样90°C前后至60°C前后的之间的温度下通过重复加热和冷却的温度循环来进行。PCR用反应器需要高速地重复该温度循环，因而在如实施方式I那样使用Si基板等导热率良好的材料作为基板的情况下，例如将应进行温度循环的反应器的区域与周围的Si部件分开等的隔热单元是有效的。在实施方式I中，也在图5的形成于Si基板的PCR用反应器的反应器501的周围通过蚀刻等方法设置间隙(缺口，gap)502。通过该构成，加热反应器的热不扩散到周围，能够实现非常高速的温度循环。另外，为了对该反应器内的液滴全体进行利用PCR的核酸靶标的扩增处理，也可以以覆盖PCR用反应器全体的方式使?自耳帖元件(Peltier element)等温度控制器件接触，以便能够使PCR反应器全体的温度变化。或者，也可以设计成使珀耳帖元件与导热率高的Cu、Al等的金属板接触，使该金属板与PCR反应器全体接触那样。
[0178]该PCR用反应器中，在前段的流路合流部生成的液滴群从供给口503按照生成的顺序流过来。进行PCR时，为了使液滴群留在该反应器501内，例如关闭设置在PCR反应器的供给口 503和排出口 504附近的阀等。
[0179]另外，包含反应药液的液滴505内包含:包含核酸的样品溶液和引物、探针、酶等反应药液。位于PCR用反应器内的液滴(505或者506)即使进行PCR的温度循环，形状也不倒塌。即，在各个液滴内分别地实施利用PCR的核酸扩增处理。在液滴内包含作为检测对象的核酸靶标的情况下，在该液滴内进行核酸的扩增，游离的荧光色素的量根据温度循环的次数而增加。即，如果照射激发荧光的波长的光，则该液滴发生荧光显色。另外，在液滴内不包含作为检测对象的核酸靶标的情况下，即使进行利用PCR的核酸扩增处理，荧光色素也不游离，即使照射激发荧光的波长的光，该液滴也不发生荧光显色。即，如果针对包含相同种类的反应药液的液滴群的总数计数发生荧光显色的液滴的数量的比例，则能够分析原样品内以怎样程度的比例包含作为检测对象的核酸靶标。
[0180]这里对于图5所示的形状的PCR反应器进行了说明，但只要是生成的液滴的顺序不变、液滴能够一个一个地依次流通，且能够对PCR反应器内全区域实现PCR的温度循环的构成，则即使不是图5所示的形状对效果也没有任何影响。
[0181]图7是显示实施方式I中的微流路芯片700的光波导单元和核酸靶标分析装置的光学系统的构成的一例的概略图。
[0182]微流路芯片700的光波导单元是通过在Si基板701等的基材上形成数百μπι的沟，在其上通过阳极键合等方法贴合玻璃板702，从而构成的。通过贴合玻璃板702，沟变成液滴流淌的流路703。在由该沟形成的流路703内，PCR后的液滴704拍成一列连续且以规定的一定速度流过。对液滴704照射激发荧光色素的光，另外，需要检测由此而发光的荧光。在该构成的芯片中通过玻璃面，进行光的输入输出。将PCR用反应器中扩增的液滴所流淌的流路703表述为第5流路。
[0183]为了有效地激发荧光色素，光源多使用荧光色素的吸收光谱的最大吸收波长附近的波长的激光器或LED等。特别是作为光学系统优选尽量小型且高输出，作为光源优选半导体激光器等。实施方式I中，使用例如波长650nm的半导体激光器705。
[0184]从半导体激光器705发射出的激光通过准直透镜706变成平行光，被二向色镜707反射。二向色镜是能够根据波长选择反射、透射的镜头，在实施方式I中使用截止波长660nm的二向色镜。该二向色镜反射波长短于660nm的光，透射波长长于660nm的光。
[0185]反射的激光通过物镜708而被集光到第5流路703中的液滴通过位置。包含核酸靶标的液滴704通过PCR而形成大量的荧光色素在液滴中游离的状态，因而通过该激光器照射而焚光色素被激发，从而发出焚光。将从液滴704发出的焚光中的一部分通过物镜708而取出到荧光检测器侧。物镜708需要尽量高效地收进荧光，因而优选开口数(NA)大的镜头。在实施方式I中，使用ΝΑ0.85的物镜。透射过物镜708的荧光透射二向色镜707。然后，通过透射荧光波长的光的滤光器709，抑制除荧光以外的光(例如激发光的漏入、从其他材料发出的自发荧光等)的强度后，通过镜头710集光到荧光检测器。通过在由镜头集光的点设置聚集的光正好透射的尺寸的针孔711，能够从聚集在传感器芯片的激光中截掉从焦点以外的区域反射来的杂散光成分。并且，仅透射针孔的荧光被输入荧光检测器712。
[0186]荧光检测器一般需要高灵敏度且高速地检测大小为激发光的I万分之一到10万分之一左右的荧光，因而使用光电倍增管(PMT)、雪崩光电二极管(APD)、光电二极管(PD)等高灵敏度检测器。特别优选灵敏度好、应答速度快的PMT。在实施方式I中使用电流输出型的PMT0
[0187]通过边界检测部，基于荧光强度来获得在第5流路中流淌的第I液滴至第4液滴各自之间的边界。检测部基于荧光强度、和第I液滴至第4液滴各自之间的边界获得具有第I阈值以上的荧光强度的第2液滴和第4液滴的数量，并且基于第2液滴和第4液滴的数量来检测对象核酸靶标中是否包含选自第I核酸靶标和第2核酸靶标中的至少I种。
[0188]在本公开中，边界检测部和检测部也可以通过包含半导体装置、半导体集成电路(1C)、或LSI(大规模集成电路，large scale integrat1n)的一个或一个以上的电子电路来实行。LSI或IC既可以集成于一个芯片，也可以由多个芯片组合构成。例如，除记忆元件以外的功能块也可以集成于一个芯片。这里，虽然称为LS1、IC，但根据集成的程度叫法可以变化，也可能称为系统LS1、VLSI(超大规模集成电路，very large scale integrat1n)、或者ULSI (特大规模集成电路，ultra large scale integrat1n)。为了相同的目的，也可以使用在LSI制造后编程的现场可编程门阵列(Field Programmable Gate Array，FPGA)、或能够再构成LSI内部的接合关系或建立LSI内部的电路区划的可重构逻辑器件(reconfigurable logic device)ο
[0189]<多个核酸靶标的分析方法>
[0190]以下，分离检测包含多种不同的反应药液的液滴群，对多个核酸靶标的分析方法进行说明。
[0191]如使用图4A和B所说明的那样，在流路合流部，包含反应药液的液滴群和不包含反应药液的液滴群交互地生成。另外，包含反应药液的液滴的大小相对于不包含反应药液的液滴必然较大地生成。在流路合流部生成的液滴通过PCR用反应器，不打乱生成的顺序地流过一支细的流路，依次通过光波导单元的流路中的液滴通过位置。
[0192]图1的上层是显示在微流路芯片的光波导单元的一支流路中流通的多个液滴群的概略图，图1的下层是显示对于图1的上层的多个液滴群测量的输出信号的一例的图。即，图1的上层显示光波导单元的第5流路中的液滴通过位置附近的液滴的状态。如图1的上层所示，包含反应药液的液滴群101或者102、不包含反应药液的液滴群103或者104交互地出现。图1的上层显示不包含反应药液的液滴群103、包含反应药液的液滴群101、不包含反应药液的液滴群104、包含反应药液的液滴群102依次流过的样子。将该第5流路中的一点定为液滴通过位置，对该固定的位置用物镜聚集并照射荧光激发光，由于液滴与油的折射率不同，而在液滴与油的边界部分，通过物镜而被收入的荧光波长附近的反射光的强度变化。即，通过物镜将荧光激发光聚集成与液滴的尺寸同等、优选比液滴的尺寸小，并照射液滴通过位置，则每当液滴通过液滴通过位置，荧光检测器(例如PMT的电流输出)中都显现如图1的下层所示那样的信号的强弱。另外，由于液滴保持一定的流速流过，因而根据液滴的大小不同，横穿液滴通过位置时的横穿时间变化。例如如果在荧光检测器的输出水平设定阈值，获得阈值110与信号交差的位置的信息，则能够测量一个一个液滴的横穿时间(112、113)。包含反应药液的液滴与不包含反应药液的液滴相比，由于液滴的大小变大，因而横穿时间也变长。即包含反应药液的液滴在液滴通过位置流淌的期间，长度比较长的脉冲状的信号图形107、108按照液滴的个数连续。然后，因为不包含反应药液的液滴流过液滴通过位置，所以长度短的脉冲状的信号图形109按照液滴的个数连续。如果测量液滴的横穿时间，则能够判定长度长的脉冲状信号与长度短的脉冲状信号的边界。通过边界检测部进行这些处理。即，通过边界检测部，基于荧光强度，来获得在第5流路中流淌的第I液滴至第4液滴各自之间的边界。
[0193]另外，包含反应药液的液滴群之中，有时含有包含作为检测对象的核酸靶标的液滴。包含作为检测对象的核酸靶标的液滴通过PCR用反应器中的核酸扩增处理而变成多个荧光色素游离的状态，通过照射的荧光激发光而荧光色素被激发，从液滴发出荧光。即在液滴群中，从不包含核酸靶标的液滴仅能检测到弱的信号108，从包含核酸靶标的液滴检测到更大的信号107。根据超过或不超过某阈值来分离该荧光检测器的输出信号的强度，通过计算而求出发出荧光的液滴的数量相对于包含相同的反应药液的液滴群的总个数的比例。在图1的下层，在检测到超过阈值111的信号的情况下，判断为是包含核酸靶标的荧光液滴。即，计数超过阈值110的液滴，则测量出总液滴数，计数超过阈值111的液滴则测量出荧光液滴、即包含核酸靶标的液滴的数量。通过检测部进行这些处理。即，检测部基于荧光强度、和第I液滴至第4液滴各自之间的边界，获得具有第I阈值以上的荧光强度的第2液滴和第4液滴的数量，并且基于第2液滴和第4液滴的数量，来检测对象的核酸靶标中是否包含选自第I核酸靶标和第2核酸靶标中的至少I种。
[0194]对于使用图2所示的反应药液库的情况，关于光波导单元和多个核酸靶标的分析方法中的处理的方法进行说明。
[0195]首先，大小较大(横穿时间长)的包含反应药液A的液滴群流过。例如，设包含反应药液A的液滴100个连续流过。在光波导单元中，如图1的下层那样，每当液滴通过，则荧光检测器的输出信号上下起伏。将该上下起伏的信号用某第I阈值110进行比较，通过对穿过第I阈值110的次数进行计数，能够掌握液滴的数量。因为液滴流过来100个，所以该脉冲状的信号100个连续出现。然后，大小较小(横穿时间短)的不包含反应药液的液滴群流过。设该不包含反应药液的液滴50个连续流过。因为在包含反应药液A的液滴群与不包含反应药液的液滴群的边界部分，荧光检测器所检测的脉冲状的信号的长度(横穿时间)变化，所以通过监视该信号的长度，能够判断包含反应药液A的液滴群在第100个结束。在包含反应药液A的100个液滴内、包含数个检测到强的荧光强度的液滴，设其数为10个。如果该10个液滴通过液滴通过位置，则与其他液滴流过时的荧光检测器的输出信号相比，检测到非常强的信号。将此信号与比第I阈值110强度强的第2阈值111进行比较，能够检测出检测到强的荧光强度的液滴的数量。即，可知在该例的情况下，与反应药液A—对一地反应的核酸靶标相对于包含反应药液A的液滴的总数100个为刚好1个。从荧光液滴的数量相对于该总液滴数的比例，能够计算原样品溶液以怎样程度的比例包含与反应药液A—对一地反应的核酸靶标。
[0196]但是，虽然将样品溶液稀释、进行浓度调整使得I个液滴中进入约I个核酸分子，但未必I个液滴中各进入I个核酸分子。例如，可能某个液滴没有核酸分子进入，或者某个液滴有2个核酸分子进入。但是，这能够概率统计地进行处理，可以以泊松分布(Poissondistribut1n)的思考方式推定。通过适应泊松分布的思考方式，从焚光液滴相对于总液滴数的比例求出液滴中所含的核酸分子数的平均值。设荧光液滴相对于总液滴数的比例为P，则液滴中所含的核酸分子数的平均值能够以-ln(l-p)的算式求出，例如在之前的例子中，相对于总液滴数100个，荧光液滴数为10个，因而荧光液滴相对于总液滴数的比例为0.1。从泊松分布的思考方式，因为一个液滴中所含的核酸分子数的平均值为0.11，所以能够推定总液滴100个分量的体积的样品溶液中进入了 11个核酸靶标分子。这样如果能够将包含相同种类的反应药液的液滴群与包含其他反应药液的液滴群明确地区别，对液滴数和荧光液滴数进行计数，则能够定量分析样品溶液所含的核酸靶标的量。
[0197]不包含反应药液的液滴50个流过之后，接着包含反应药液B的大小较大(横穿时间长)液滴群流过。在不包含反应药液的液滴群与包含反应药液B的液滴群的边界部分，荧光检测器所检测的脉冲状的信号的长度(横穿时间)变化，所以通过监视该信号的长度，能够确认包含反应药液B的液滴群的最初的液滴的位置。如果对于包含反应药液B的液滴群，也用与对于包含反应药液A的液滴群所进行的相同的方法，对包含反应药液B的液滴的总数和超过第2阈值的荧光液滴的数量进行计数，则能够计算在原样品溶液中以怎样的程度的比例包含与反应药液B—对一地反应的核酸革巴标。
[0198]以后为上述的重复。如图2那样，在10种反应药液(反应药液A?J)被保持在药液罐中的情况下，该包含反应药液的液滴群与不包含反应药液的液滴群的重复发生10次。只要能够确认荧光检测器所检测的脉冲状的信号的长度(横穿时间)的变化，就能够掌握包含反应药液的液滴群的最初和最后，因而如果对于每种反应药液各自对相对于液滴数的荧光液滴的数量进行计数，则能够对于1种核酸革E标依次进行分析。
[0199]在该实施方式I中，例如，第I油与第2油使用相同的材料。第I油与第2油只要能够明确地与水系的溶液分离，则即使不一定是相同的材料也没问题，但在流路合流部将第I油与第2油混合时，由相同的材料构成的情况下，混合时药液的稳定性、液滴生成条件不变化。因此，更优选第I油与第2油使用相同的材料。
[0200]另外，在实施方式I中，例如，多种不同的反应药液所含的焚光色素使用相同的一种荧光色素。荧光色素不一定必须是一种，但对全部反应药液使用发出相同波长的荧光的荧光色素的情况下，光波导单元和多个核酸靶标的分析装置的光学系统的构成变得非常简单，因而效果更大。
[0201]另外，在图1的下层，通过液滴的大小的信息(液滴的横穿时间)112、113，来判定包含反应药液的液滴群101、102与不包含反应药液的液滴群103、104的边界。不限于此，例如，如图8的上层和下层那样，通过测量包含反应药液的液滴群801、80 2内的油的横穿时间812、和不包含反应药液的液滴群803、804内的油的横穿时间813，也能够判定边界。图8与图1同样，是说明光波导单元所检测的信号的图形、和对包含多种不同的反应药液的液滴群进行分离检测的方法的图。如使用图4所说明的那样，在流路合流部，包含反应药液的液滴群801、802与不包含反应药液的液滴群803、804交互地生成。另外，包含反应药液的液滴群801、802内的油部分的大小相对于不包含反应药液的液滴群803、804内的油部分的大小必然较小地生成。在流路合流部生成的液滴通过PCR用反应器，不打乱生成的顺序地流过一支细的流路，依次通过光波导单元的流路中的液滴通过位置。图8的上层显示光波导单元的流路中的液滴通过位置附近的液滴的状态。如图8的上层所示，包含反应药液的液滴群801或者802、与不包含反应药液的液滴群803或者804交互地出现。在图8的上层，显示不包含反应药液的液滴群803、包含反应药液的液滴群801、不包含反应药液的液滴群804、包含反应药液的液滴群802依次流过的样子。与先前同样地，液滴群内的油部分的横穿时间对于包含反应药液的液滴群与不包含反应药液的液滴群是不同的，因而能够基于该信息来掌握包含反应药液的液滴群的最初与最后。基于该信息对于每个种类的反应药液分离液滴群，相对于包含相同种类的反应药液的液滴群的总数，计数超过第2阈值的荧光液滴的数量，从而能够计算原样品溶液中以怎样程度的比例包含核酸靶标。
[0202](实施方式2)
[0203]在本公开的实施方式2中，仅生成液滴的流路合流部的结构与实施方式I不同。对于其他的构成，由于与实施方式I相同，因而省略说明。
[0204]图9A是显示实施方式2中的流路合流部的构成的一例的概略图，是显示反应药液从第I供给流路流到结合点904的状态的图，图9B是显示第I油从第I供给流路流到结合点904的状态图。
[0205]如图所示，实施方式2中的生成液滴的流路合流部与图2所示的药液罐的排出口连接，多种反应药液与第I油交互地流过的第I供给流路901、与流过包含核酸的样品溶液的第2供给流路902通过结合点904结合，所述第2供给流路902与从血液、体液等样本制作包含作为检查对象的核酸的样品溶液的前处理单元连接。形成该结合流路与第2油流过的第3供给流路903通过结合点911结合的形状。各液体从第I供给流路、第2供给流路、第3供给流路分别以一定的流速流过来，在流路的结合点904和结合点911，各液体合流。如果水系的样品溶液907、反应药液905与油906、908在流路的结合点合流，则水系的样品溶液907、反应药液905被油撕碎而生成液滴909 ο该液滴909的大小由流路的结合点的水系的溶液(例如样品溶液、反应药液)与油的流量比决定。水系的溶液的流量相对于油的流量的比率越大，则生成的液滴的大小越大。
[0206]水系的反应药液905与第I油906从第I供给流路901交互流过来。反应药液905到达流路的结合点904时与第I油906到达时，液滴的生成条件不同。图9A显示反应药液905到达流路的结合点904时的状态。在流路的结合点904，水系的反应药液905从第I供给流路901流过来，水系的样品溶液907从第2供给流路902流过来，从而合流。由于两者均是水系的溶液，因而两者一边混合一边向接下来的结合点911流淌。然后，与从第3供给流路903流过来的第2油908在结合点911合流。在结合点911，反应药液905与样品溶液907混合而成的混合溶液被第2油908撕碎，如图所示，样品溶液与反应药液混合而成的液滴群909隔着第2油908生成。
[0207]图9B显示第I油906从第I供给流路901到达流路的结合点904时的状态。在流路的结合点904，第I油906从第I供给流路901流过来，水系的样品溶液907从第2供给流路902流过来，从而合流。此时，水系的样品溶液907被从第I供给流路901流过来的第I油906撕碎，如图所示，仅由样品溶液构成的液滴群910隔着第I油906生成。然后，与从第3供给流路903流过来的第2油908在结合点911合流，但已经形成小的液滴910的样品溶液907不被从第3供给流路903流来过的第2油908撕碎，以由于液滴间的第I油与第2油的混合油而液滴之间被撑开的状态流过去。如图所示，仅由样品溶液构成的液滴群910隔着第I油与第2油的混合液而生成。
[0208]各液体分别从第I供给流路901、第2供给流路902、和第3供给流路903保持一定的流速流过来。关于从各供给流路流过来的各液体的流量设定，一般多设定为如下的比率。为了在后段的核酸扩增处理中扩增核酸靶标，一般需要对包含核酸的样品溶液使用大量的反应药液(引物、探针、酶等)，因而进行来自第I供给流路901的流量相对于第2供给流路902较大的流量设定。例如，可考虑设定成10倍?15倍左右。另外，为了稳定的液滴生成，可考虑从第3供给流路供给与在结合点904混合后的混合溶液为同程度的流量的第2油。即，如果设从第2供给流路902流过来的样品溶液907的每单位时间的流量为I，则流量为15的反应药液905或者第I油906从第I供给流路901流过来，流量为16的第2油908从第3供给流路903流过来。这样一般设想相对于样品溶液，反应药液、第I油、和第2油的流量设定得较大。如图9A那样，在反应药液905从第I供给流路901到达流路的结合点904、其混合溶液到达结合点911的状态下，混合溶液与第2油的流量比大致为1:1，如果考虑图9B所示的第I油906从第I供给流路901到达流路的结合点904的状态下的流路的结合点904的样品溶液与第I油的流量比为I: 15，则液滴群909与液滴群910相比，各液滴的大小变大。即，在构成图2那样的药液罐(反应药液库)、使各液体分别保持一定的流速流到图9所示的流路合流部的情况下，包含反应药液的液滴群909与不包含反应药液的液滴群910交互地生成，且包含反应药液的液滴的大小与不包含反应药液的液滴相比较大地生成。
[0209]另外，在图9A的状态下生成的液滴群909内的液滴间的油的量，与在图9B的状态下生成的液滴群910内的液滴间的油的量相比变少。即油部分的大小变小。
[0210]这些由流路的结合点904、结合点911的液滴生成时的水系的溶液的流量与油的流量的平衡决定。即，如图9A那样构成流路合流部，如果反应药液、第I油、第2油比样品溶液的流量大，则即使将来自各供给流路的液体的流量设定得不同，只要使从各个供给流路流过来的液体的流速分别为一定，则必然包含反应药液的液滴909的大小相对于不包含反应药液的液滴910的大小变大。另一方面，包含反应药液的液滴909群内的油的大小相对于不包含反应药液的液滴910群内的油的大小变小。
[0211]在本实施方式2中，因为包含反应药液的液滴群与不包含反应药液的液滴群交互地流淌，且包含反应药液的液滴的大小相对于不包含反应药液的液滴的大小较大，另外包含反应药液的液滴群内的油的大小相对于不包含反应药液的液滴群内的油的大小变小，因而也能够通过与本实施方式I中所说明的同样的方法，使用光波导单元，进行不同的种类的核酸革E标的定量分析。
[0212]另外，这里对于图9所示的流路构成进行了说明，但关于流路的结合的方法，不限于该图所示的形状，采用怎样的结合的方法都可以。例如，第I供给流路与第2供给流路具有90度的角度而结合、另外第3供给流路具有90度的角度而结合的形状也是可以的。只要各液体分别从第I供给流路、第2供给流路和第3供给流路保持一定的流速供给，那么即使结合的方法变化对效果也没有影响。
[0213](实施例1)
[0214]在实施例1中，对于使用图4所示的流路合流部的具体例进行说明。药液罐中隔着油保持有种类的不同的3种反应药液A、B、C。油使用B1rad公司的Oil Mix。另外，反应药液以B1rad公司的Master Mix为基础，人工制作适合所希望的核酸革El标的引物和焚光标记探针，将其混合。另外，关于荧光标记探针，人工制作适合各个核酸靶标的规定的碱基序列，将它们混合，修饰的荧光色素均使用相同的Cy5色素而制作。
[0215]微流路芯片通过将Si基板与Pyrex(注册商标)玻璃通过阳极键合进行贴合而构成，并构成了在Si基板上挖入的约30μπι宽度、20μπι深度的流路。形成了从样本供给口到光波导单元由相同的大小的流路连接的构成。从样本供给口注入血液，在前处理单元中与包含缓冲溶液等的溶剂混合之后，通过加热处理来破坏细胞，提取成为检查对象的核酸。包含提取的核酸的样品溶液使用设置于外部的栗，通过流路合流部的第2供给流路供给至流路合流部。样品溶液以5nL/min的一定的流速从第2供给流路供给。
[0216]药液罐的排出口与微流路芯片的反应药液供给口连接，通过设置于外部的栗以一定的流速通过流路合流部的第I供给流路供给反应药液。流速设定为75nL/min。
[0217]从微流路芯片的油供给口，使用设置于外部的栗供给与封入药液罐内的油相同的油材料。流速设定为7 5nL/m i η。
[0218]向图4所示的结构的流路合流部，从3个供给流路分别供给各自的液体，在流路的结合点依次生成液滴。
[0219]首先，反应药液A被供给至流路的结合点。此时，在流路的结合点，反应药液A从第I供给流路以75nL/min的流速流过来，样品溶液从第2供给流路以5nL/min的流速流过来，油从第3供给流路以75nL/min的流速流过来，它们合流。此时生成的液滴包含样品溶液与反应药液A的混合液，生成了约1000个液滴群。在流路中流淌的包含反应药液A的液滴的长度为约87±4μπι，位于液滴间的油部分的长度为约23±1μπι。根据流路中的液滴的长度来计算包含反应药液A的液滴的体积，则形成了 52 ± 2pL的大小的液滴群。
[0220]接着，从第I供给流路向流路的结合点供给油。此时在流路的结合点，油从第I供给流路以75nL/min的流速流过来，样品溶液从第2供给流路以5nL/min的流速流过来，油从第3供给流路以75nL/min的流速流过来，它们合流。此时生成的液滴仅包含样品溶液，不包含任何反应药液。该由样品溶液组成的不包含反应药液的液滴生成约100个。在流路中流淌的不包含反应药液的液滴的长度为约30 ± 2m，位于液滴间的油部分的长度为约80 ± 3μηι。根据流路中的液滴的长度来计算液滴的体积，则形成了 18 ± IpL的大小的液滴群。
[0221 ]此后，同样地，从第I供给流路按照反应药液B、油、反应药液C、油的顺序依次向流路的结合点以75nL/min的流速供给液体。在反应药液B、C到达流路的结合点时，与反应药液A的时候同样地，形成约50pL左右的液滴群，在油到达流路的结合点时，形成约20pL左右的液滴群。
[0222]在流路合流部生成的液滴按照生成的顺序流过流路，被供给至PCR用反应器。在本实施例1中，使用在3mmX6mm的范围形成的PCR用反应器。PCR用反应器内如图5所示，以30μπι宽度的流路隔开20μπι的间隔折叠的方式配置。反应器内形成约3mm的长度的流路排列120支那样的形状。该PCR用反应器中，使用了 2个3mmX3mm的面积的珀耳帖元件的温度控制器件从Si基板侧接触，能够高速地进行加热冷却。在流路合流部生成的液滴群按照生成的顺序充满该PCR用反应器内。在液滴充满PCR用反应器内的时刻，将设置于PCR用反应器的入口和出口的阀关闭，进行利用PCR的核酸扩增处理。这里，以90 °C5秒、57 V5秒、68 V 5秒作为I个循环，进行40个循环的核酸扩增处理。通过该工艺，仅在包含所希望的核酸靶标的液滴中进行核酸扩增处理，荧光色素游离到液滴中。在不包含所希望的核酸靶标的液滴中，不发生荧光色素的游离。
[0223]然后，打来PCR用反应器的入口、出口的阀，使用栗将液滴按照生成的顺序送入接下来的光波导单元中。
[0224]本实施例1的光波导单元是使用波长650nm的半导体激光器作为光源、使用电流输出型PMT作为荧光检测器而构成的。来自PMT的电流输出使用D/A转换器进行数字转换，将数据输入计算机。从获得的数据分析液滴的横穿时间、荧光强度，进行液滴数的计数、发出荧光的液滴的计数等，定量地分析核酸靶标的含量。固定物镜使得激光照射到液滴通过位置。
[0225]对光波导单元中的液滴数进行计数时，利用设置于外部的栗以约400nL/min的流速使液滴流淌。这是能够对每秒100个液滴进行计数的流速。
[0226]图10是显示通过了液滴通过位置的液滴的横穿时间的分布的分布图。液滴的横穿时间如图1所说明那样，在获得的荧光检测器的输出信号中，设定阈值水平110，通过测量液滴通过时信号一边上升一边穿过阈值110的时刻、和一边下降一边穿过的时刻之间的时间来获得。如图10所示，横穿时间明确地分为3毫秒以下的集团和7毫秒以上的集团而被检测至IJ。具有7毫秒以上的横穿时间的液滴是包含反应药液的液滴，具有3毫秒以下的横穿时间的液滴是不包含反应药液的液滴。由于液滴不打乱生成的顺序地通过液滴通过位置，因而可知横穿时间的大的变化点是包含反应药液的液滴群与不包含反应药液的液滴群的边界部分。基于该横穿时间的变化点，能够将包含反应药液A的液滴群、包含反应药液B的液滴群、包含反应药液C的液滴群各自分离地进行分析，通过分析各个液滴群内的荧光液滴的数量相对于总液滴数的比例，能够对原样品判断含有多少核酸靶标。
[0227]另外，图11是显示通过了液滴通过位置的液滴间的油部分的横穿时间的分布图。油的横穿时间与液滴的情况相反，如图8所示，通过测量一边降低一边穿过阈值810的时刻、和一边上升一边穿过的时刻之间的时间来获得。如图11所示，油的横穿时间也明确分为6毫秒以上的集团和3毫秒以下的集团而分布。根据油的横穿时间，也能够将包含反应药液A的液滴群、包含反应药液B的液滴群、包含反应药液C的液滴群明确地分离而分析。
[0228]另外，各反应药液逐个的分析如下进行。图10中，在从测量开始约50个附近出现液滴横穿时间的变化点。能够判断从该变化点到接下来的变化点(从测量开始约1 5 O个附近)的液滴是包含反应药液A的液滴群。对此间的约1000个液滴的测量数据使用图1所示的阈值110和阈值111的2个阈值水平进行液滴的计数。通过对一边上升一边穿过阈值110的次数进行计数，能够获得包含反应药液A的总液滴数。其中，通过对一边上升一边穿过阈值111的次数进行计数，能够获得发出荧光的液滴、即包含作为检测对象的能与反应药液A反应的核酸靶标的液滴的数量。在本实施例1中，包含反应药液A的液滴的总数为1005个，其中发出荧光的液滴的数量为54个。从液滴数求出比例，则可知5.4 %是包含核酸靶标的液滴。但是，由于不知道是否I个液滴中包含I个核酸靶标，因而适应泊松分布的考虑，概率上推定I个液滴所含的核酸靶标的个数。图12是显示荧光液滴的比例与液滴中的核酸靶标的平均个数的关系的图。如图12所示，在泊松分布的考虑下，能够从荧光液滴相对于总液滴数的比例，推定I个液滴所含的核酸靶标的数量。在荧光液滴的比例为5.4%的情况下，能够推定I个液滴所含的核酸靶标的数量为0.056个。由于包含反应药液A的总液滴数为1005个，因而可知核酸靶标的数量为1005 X 0.056 = 55.8个。即可知有55.8个与反应药液A反应的核酸靶标进入了用于生成1005个液滴的样品溶液的体积中。
[0229]通过如以上那样，对反应药液B和反应药液C也进行同样的工艺，能够测定与各个反应药液反应的核酸革E标的量。
[0230]此外，这里用反应药液A、B、C的3种反应药液进行了实验，但即使反应药液比3种增加，也能够通过同样的工艺对各自进行分离检测。
[0231](实施例2)
[0232]在本实施例2中，对于使用了图9所示的流路合流部的具体例进行说明。除了流路合流部以外，在与实施例1中所说明的同样的条件下进行测定。与实施例1同样地，测量液滴的横穿时间和液滴间的油部分的横穿时间。图13是显不液滴的横穿时间的分布的分布图。图14是显示液滴间的油部分的横穿时间的分布的分布图。图13、图14中横穿时间的分布均可见明确的变化点。该变化点是包含反应药液的液滴群与不包含反应药液的液滴群的边界，通过获得该横穿时间的信息，能够对每种反应药液的液滴群进行分离检测。关于每种反应药液各自的核酸靶标的定量分析，可以通过与实施例1同样的工艺来进行。
[0233](各方式所涉及的方法)
[0234]第I方式所涉及的多个核酸靶标的分析方法，是使用微流路芯片来分析多个核酸靶标的方法，
[0235]所述微流路芯片具备第I供给流路、第2供给流路、第3供给流路、第4流路、核酸扩增单元、第5流路和光波导单元，
[0236]所述第I供给流路用于流淌被荧光色素修饰、并且与不同的核酸靶标一对一地反应的第I反应药液和第2反应药液、以及第I油，
[0237]所述第2供给流路用于流淌包含核酸的样品溶液，
[0238]所述第3供给流路用于流淌第2油，
[0239]所述第4流路的一端是与所述第I供给流路的一端、所述第2供给流路的一端以及所述第3供给流路的一端连接的结合部，
[0240]所述核酸扩增单元与所述第4流路的另一端连接、进行扩增所述核酸的处理，
[0241]所述第5流路与所述核酸扩增单元连接，流淌扩增所述核酸后的液滴，
[0242]所述光波导单元能够将透射过在所述第5流路中流淌的液滴的透射光或在透射所述液滴之后反射的反射光取出到外部，
[0243]从所述第I流路的另一端依次供给所述第I反应药液、所述第I油、所述第2反应药液，从所述第2供给流路的另一端供给包含所述核酸的样品溶液，并且从所述第3供给流路的另一端供给所述第2油，从而对所述第4流路至少依次供给包含所述第I反应药液和所述样品溶液的第I液滴、所述样品溶液的第2液滴、包含所述第2反应药液和所述样品溶液的第3液滴、所述样品溶液的第4液滴，
[0244]在所述第4流路中流淌并到达所述核酸扩增单元所述第I液滴至第4液滴被所述核酸扩增单元扩增，
[0245]被所述核酸扩增单元扩增后的所述第I液滴至第4液滴在第5流路中流淌时，通过所述光波导单元检测所述液滴群内的液滴的大小和所述液滴的荧光的强度，
[0246]基于检测的所述液滴群内的液滴的大小，来识别包含具有规定以上的大小的包含所述反应药液的第I液滴和第3液滴的液滴群，
[0247]基于检测的所述液滴的荧光的强度，来分析所述样品溶液是否包含与包含所述反应药液的第I液滴和第3液滴中发出规定的阈值以上的强度的荧光的液滴所含的反应药液对应的靶标。
[0248]第2方式所涉及的多个核酸靶标的分析方法包括以下工序:
[0249]供给工序:从反应药液库将反应药液和第I油交互地供给至第I供给流路，将包含核酸的样品溶液供给至第2供给流路，将第2油供给至第3供给流路，所述反应药液库在由一支流路构成的药液罐中将被荧光色素修饰、并且与不同的核酸靶标一对一地反应的多种所述反应药液按照每种所述反应药液的种类隔着所述第I油分离地保持，
[0250]液滴生成工序:使所述第I供给流路、所述第2供给流路和所述第3供给流路合流成一支流路，根据从所述第I供给流路供给的液体的种类生成包含所述反应药液的液滴群和不包含所述反应药液的液滴群，
[0251 ]核酸扩增工序:导入所述液滴，扩增所述液滴中的核酸，
[0252]荧光检测工序:检测来自流通的液滴群的荧光，从而检测所述液滴群内的液滴的大小和所述液滴的荧光的强度，
[0253]边界检测工序:基于检测的所述液滴群内的液滴的大小，识别包含所述反应药液的液滴群内的液滴和不包含所述反应药液的液滴群内的液滴，获得包含所述反应药液的液滴群与不包含所述反应药液的液滴群的边界，
[0254]计数工序:对通过所述边界而被分离检测的包含所述反应药液的液滴群内的总液滴数和发出规定的阈值以上的强度的荧光的液滴的数量进行计数。
[0255]第3方式所涉及的多个核酸靶标的分析方法包括以下工序:
[0256]供给工序:从反应药液库将反应药液和第I油交互地供给至第I供给流路，将包含核酸的样品溶液供给至第2供给流路，将第2油供给至第3供给流路，所述反应药液库在由一支流路构成的药液罐中将被荧光色素修饰、并且与不同的核酸靶标一对一地反应的多种所述反应药液按照每种所述反应药液的种类隔着所述第I油分离地保持，
[0257]液滴生成工序:使所述第I供给流路、所述第2供给流路和所述第3供给流路合流成一支流路，根据从所述第I供给流路供给的液体的种类生成包含所述反应药液的液滴群和不包含所述反应药液的液滴群，
[0258]核酸扩增工序:导入所述液滴，扩增所述液滴中的核酸，
[0259]荧光检测工序:检测来自流通的液滴群的荧光，从而检测划分所述液滴群内的液滴的油的大小以及所述液滴的荧光的强度，
[0260]边界检测工序:基于检测的划分所述液滴群的液滴的油的大小，识别划分包含所述反应药液的液滴群内的液滴的所述第2油、和划分不包含所述反应药液的液滴群内的液滴的所述第I油与所述第2油的混合液，获得包含所述反应药液的液滴群与所述不包含反应药液的液滴群的边界，
[0261]计数工序:对通过所述边界而被分离检测的包含所述反应药液的液滴群内的总液滴数和发出规定的阈值以上的强度的荧光的液滴的数量进行计数。
[0262]第4方式所涉及的多个核酸靶标的分析方法包括以下工序:
[0263]供给工序:从反应药液库将反应药液和第I油交互地供给至第I供给流路，将包含核酸的样品溶液供给至第2供给流路，将第2油供给至第3供给流路，所述反应药液库在由一支流路构成的药液罐中将被荧光色素修饰、并且与不同的核酸靶标一对一地反应的多种所述反应药液按照每种所述反应药液的种类隔着所述第I油分离地保持，
[0264]液滴生成工序:使所述第I供给流路与所述第2供给流路合流，然后进一步与所述第3供给流路合流成一支流路，根据从所述第I供给流路供给的液体的种类生成包含所述反应药液的液滴群和不包含所述反应药液的液滴群，
[0265]核酸扩增工序:导入所述液滴，扩增所述液滴中的核酸，
[0266]荧光检测工序:检测来自流通的液滴群的荧光，从而检测所述液滴群内的液滴的大小和所述液滴的荧光的强度，
[0267]边界检测工序:基于检测的所述液滴群内的液滴的大小，识别包含所述反应药液的液滴群内的液滴和不包含所述反应药液的液滴群内的液滴，获得包含所述反应药液的液滴群与不包含所述反应药液的液滴群的边界，
[0268]计数工序:对通过所述边界而被分离检测的包含所述反应药液的液滴群内的总液滴数和发出规定的阈值以上的强度的荧光的液滴的数量进行计数。
[0269]第5方式所涉及的多个核酸靶标的分析方法，在上述第2或第4方式中，在所述荧光检测工序中，可以根据流通的所述液滴群内的液滴的通过时间来检测所述液滴的大小。
[0270]第6方式所涉及的多个核酸靶标的分析方法包括以下工序:
[0271]供给工序:从反应药液库将反应药液和第I油交互地供给至第I供给流路，将包含核酸的样品溶液供给至第2供给流路，将第2油供给至第3供给流路，所述反应药液库在由一支流路构成的药液罐中将被荧光色素修饰、并且与不同的核酸靶标一对一地反应的多种所述反应药液按照每种所述反应药液的种类隔着所述第I油分离地保持，
[0272]液滴生成工序:使所述第I供给流路与所述第2供给流路合流，然后进一步与所述第3供给流路合流成一支流路，根据从所述第I供给流路供给的液体的种类生成包含所述反应药液的液滴群和不包含所述反应药液的液滴群，
[0273]核酸扩增工序:导入所述液滴，扩增所述液滴中的核酸，
[0274]荧光检测工序:检测来自流通的液滴群的荧光，从而检测划分所述液滴群内的液滴的油的大小以及所述液滴的荧光的强度，
[0275]边界检测工序:基于检测的划分所述液滴群的液滴的油的大小，识别划分包含所述反应药液的液滴群内的液滴的所述第2油、和划分不包含所述反应药液的液滴群内的液滴的所述第I油与所述第2油的混合液，获得包含所述反应药液的液滴群与所述不包含反应药液的液滴群的边界，
[0276]计数工序:对通过所述边界而被分离检测的包含所述反应药液的液滴群内的总液滴数和发出规定的阈值以上的强度的荧光的液滴的数量进行计数。
[0277]第7方式所涉及的多个核酸靶标的分析方法，在上述第3或第6方式中，在所述荧光检测工序中，可以根据划分流通的所述液滴群内的液滴的油的通过时间来检测所述油的大小。
[0278]第8方式所涉及的多个核酸靶标的分析方法，在上述第I?第7的任一方式中，所述第I油和所述第2油可以由同一材料构成。
[0279]第9方式所涉及的多个核酸靶标的分析方法，在上述第I?第8的任一方式中，所述反应药液库内的所述荧光色素可以由单一种类的材料构成。
[0280]第10的方式所涉及的多个核酸靶标的分析方法，在上述第I?第9的任一方式中，可以进一步包含光照射工序:对在所述一支流路中按照生成的顺序流通的包含所述扩增后的核酸的液滴照射光。
[0281]第11的方式所涉及的微流路芯片具备流路的合流部、核酸扩增单元和光波导单元，
[0282]所述流路的合流部使从反应药液库交互地供给反应药液和第I油的第I供给流路、供给包含核酸的样品溶液的第2供给流路和供给第2油的第3供给流路合流成一支流路，根据从所述第I供给流路供给的液体的种类生成包含所述反应药液的液滴群和不包含所述反应药液的液滴群，所述反应药液库在由一支流路构成的药液罐中将被荧光色素修饰、并且与不同的核酸靶标一对一地反应的多种所述反应药液按照每种所述反应药液的种类隔着所述第I油分离地保持，
[0283]所述核酸扩增单元导入所述液滴群，扩增所述液滴群内的液滴中的核酸，
[0284]所述光波导单元能够对在所述一支流路中按照生成的顺序流通的包含所述扩增后的核酸的液滴透射来自外部的光，并能够将透射过所述液滴的透射光或透射所述液滴之后反射的反射光取出到外部。
[0285]第12方式所涉及的核酸靶标分析装置，是检测来自包含样品溶液和反应药液的液滴的荧光，从而检测核酸靶标的核酸靶标分析装置，所述样品溶液包含核酸，所述反应药液被荧光色素修饰、并且与不同的核酸靶标一对一地反应，
[0286]该核酸靶标分析装置具备荧光检测单元、边界检测单元和计数单元，
[0287]所述荧光检测单元检测来自在一支流路内流通的包含所述反应药液的液滴群和不包含所述反应药液的液滴群的荧光，从而检测所述液滴群内的液滴的大小和所述液滴的荧光的强度，
[0288]所述边界检测单元基于检测的所述液滴群内的液滴的大小，识别包含所述反应药液的液滴群内的液滴和不包含所述反应药液的液滴群内的液滴，获得包含所述反应药液的液滴群与不包含所述反应药液的液滴群的边界，
[0289]所述计数单元对通过所述边界而被分离检测的包含所述反应药液的液滴群内的总液滴数和发出规定的阈值以上的强度的荧光的液滴的数量进行计数。
[0290]产业上的可利用性
[0291]本公开所涉及的核酸靶标的分析方法能够在从血液等采集样本对分析对象核酸靶标的量进行定量分析的微流路器件中灵活运用。特别是在同时分析多个分析对象核酸靶标的含量时是有用的。通过本公开，即使在同时分析多个核酸靶标的情况下，也能够以非常简单的构成实现微流路器件的流路构成和进行荧光检测的光学检测系系统，因而能够在订制医疗的现场利用，作为迅速、简便的诊断装置是特别有用的。
【主权项】
1.一种检测方法，是使用微流路芯片来检测第I核酸靶标和第2核酸靶标的检测方法，包括: (a)在检测装置中设置微流路芯片， 所述检测装置具备PCR处理部、PCR反应器、荧光检测部和检测电路， 所述微流路芯片具备第I流路、第2流路、第3流路、第4流路和第5流路， 所述第I流路的一端、所述第2流路的一端以及所述第3流路的一端与所述第4流路连接， 所述PCR反应器位于所述第4流路和所述第5流路的之间， (b)通过(i)从所述第I流路的另一端依次供给第I水溶液、第I油和第2水溶液，(??)从所述第2流路的另一端供给样品水溶液，和(iii)从所述第3流路的另一端供给第2油，从而使由所述第I水溶液和所述样品水溶液组成的第I液滴、由所述样品水溶液组成的第2液滴、由所述第2水溶液和所述样品水溶液组成的第3液滴以及由所述样品水溶液组成的第4液滴依次通过所述第4流路， 其中， 所述第I水溶液具有第1DNA，所述第IDNA具有与所述第I核酸靶标互补的序列、并且被第I荧光色素修饰，所述第2水溶液具有第2DNA，所述第2DNA具有与所述第2核酸靶标互补的序列、并且被第2荧光色素修饰， (c)将通过所述第4流路到达所述PCR反应器的所述第I液滴至所述第4液滴，通过所述PCR处理部进行PCR处理，使所述PCR处理后的所述第I液滴至所述第4液滴通过所述第5流路， (d)所述第I液滴至所述第4液滴在所述第5流路中流淌时，通过所述荧光检测部，检测从所述第I液滴至所述第4液滴输出的荧光强度， (e)基于所述荧光强度，获得在所述第5流路中流淌的所述第I液滴至所述第4液滴各自之间的边界， (f)通过所述检测电路，基于所述荧光强度、和所述第I液滴至所述第4液滴各自之间的边界，获得具有第I阈值以上的荧光强度的所述第2液滴和所述第4液滴的数量，并且基于所述第2液滴和所述第4液滴的数量，检测所述样品水溶液中是否包含选自所述第I核酸靶标和所述第2核酸靶标中的至少I种。2.根据权利要求1所述的检测方法， 在所述工序(b)中，(iv)在所述第I流路中流淌的所述第I水溶液、所述第I油和所述第2水溶液的流速，(V )在所述第2流路中流淌的所述样品水溶液的流速，以及(vi)在所述第3流路中流淌的所述第2油的流速是一定的。3.根据权利要求1所述的检测方法， 所述第4流路的一端与所述第I流路的一端、所述第2流路的一端以及所述第3流路的一端连接。4.根据权利要求1所述的检测方法， 所述第4流路的一端与所述第I流路的一端以及所述第2流路的一端连接， 所述第3流路的一端与所述第4流路的所述一端和另一端之间连接。5.根据权利要求1所述的检测方法， 在所述工序(d)中检测多个荧光强度的变化，其中，所述多个荧光强度的变化是第2阈值以上的所述荧光强度的变化， 在所述工序(e)中，基于各个检测到所述多个荧光强度的变化的位置，作为选自(Vii)所述第I液滴与所述第2液滴之间的边界、(vi)所述第2液滴与所述第3液滴之间的边界、(k)所述第3液滴与所述第4液滴之间的边界和(X )所述第4液滴与所述第I液滴之间的边界中的至少I个边界而获得，从而获得多个边界。6.根据权利要求5所述的检测方法， 所述多个荧光强度的变化包含第I荧光强度的变化和第2荧光强度的变化， 在所述工序(e)中，基于检测到所述第I荧光强度的变化的时刻和检测到所述第2荧光强度的变化的时刻之间的时间间隔，确定所述第2液滴和所述第4液滴，从而获得所述第I液滴至所述第4液滴各自之间的边界。7.根据权利要求6所述的检测方法， 在所述工序(e)中，在所述时间间隔为规定时间以上的情况下，获得与所述第2荧光强度的变化对应的边界，作为(vi)所述第2液滴与所述第3液滴之间的边界或(X )所述第4液滴与所述第I液滴之间的边界。8.根据权利要求6所述的检测方法， 在所述工序(e)中，在所述时间间隔比规定时间短的情况下，获得与所述第2荧光强度的变化对应的边界，作为(vii)所述第I液滴与所述第2液滴之间的边界或(k)所述第3液滴与所述第4液滴之间的边界。9.根据权利要求1所述的检测方法， 所述第I油与所述第2油是相同的材料。10.根据权利要求1所述的检测方法， 所述第I荧光色素与所述第2荧光色素是相同的材料。11.根据权利要求1所述的检测方法， 进一步在所述工序(c)与所述工序(d)之间，通过光源，对在所述第5流路中流淌的所述第I液滴至所述第4液滴照射光。12.一种检测装置，是使用了微流路芯片的检测装置， 所述流路流淌由第I水溶液和样品水溶液组成的第I液滴、由所述样品水溶液组成的第2液滴、由第2水溶液和所述样品水溶液组成的第3液滴和由所述样品水溶液组成的第4液滴， 其中，所述样品水溶液包含对象核酸靶标， 所述第I水溶液具有第1DNA，所述第IDNA具有与第I核酸靶标互补的序列、并且被第I荧光色素修饰，所述第2水溶液具有第2DNA，所述第2DNA具有与第2核酸靶标互补的序列、并且被第2荧光色素修饰， 该检测装置具备PCR反应器、焚光检测部和检测电路， 所述PCR反应器对在所述流路中流淌的所述第I液滴至所述第4液滴进行PCR处理， 所述荧光检测部检测从所述PCR处理后的所述第I液滴至所述第4液滴输出的荧光强度， 所述检测电路(xi)基于所述荧光强度，获得在第5流路中流淌的所述第I液滴至所述第4液滴各自之间的边界，(X ? )基于所述荧光强度和所述第I液滴至所述第4液滴各自之间的边界，获得具有第I阈值以上的荧光强度的所述第2液滴和所述第4液滴的数量，并且(xiii)基于所述第2液滴和所述第4液滴的数量，来检测所述对象核酸靶标中是否包含选自所述第I核酸靶标和所述第2核酸靶标中的至少I种。13.—种检测方法，是使用微流路芯片来定量第I核酸靶标和第2核酸靶标的定量方法，包括: (a)在定量装置中设置微流路芯片， 所述定量装置具备PCR处理部、PCR反应器、荧光检测部和定量电路， 所述微流路芯片具备第I流路、第2流路、第3流路、第4流路和第5流路， 所述第I流路的一端、所述第2流路的一端以及所述第3流路的一端与所述第4流路连接， 所述PCR反应器位于所述第4流路和所述第5流路的之间， (b)通过(i)从所述第I流路的另一端依次供给第I水溶液、第I油和第2水溶液，(??)从所述第2流路的另一端供给样品水溶液，和(iii)从所述第3流路的另一端供给第2油，从而使由所述第I水溶液和所述样品水溶液组成的第I液滴、由所述样品水溶液组成的第2液滴、由所述第2水溶液和所述样品水溶液组成的第3液滴以及由所述样品水溶液组成的第4液滴依次通过所述第4流路， 其中， 所述第I水溶液具有第1DNA，所述第IDNA具有与所述第I核酸靶标互补的序列、并且被第I荧光色素修饰，所述第2水溶液具有第2DNA，所述第2DNA具有与所述第2核酸靶标互补的序列、并且被第2荧光色素修饰， (c)将通过所述第4流路到达所述PCR反应器的所述第I液滴至所述第4液滴，通过所述PCR处理部进行PCR处理，使所述PCR处理后的所述第I液滴至所述第4液滴通过所述第5流路， (d)所述第I液滴至所述第4液滴在所述第5流路中流淌时，通过所述荧光检测部，检测从所述第I液滴至所述第4液滴输出的荧光强度， (e)基于所述荧光强度，获得在所述第5流路中流淌的所述第I液滴至所述第4液滴各自之间的边界， (f)通过所述定量电路，基于所述荧光强度、和所述第I液滴至所述第4液滴各自之间的边界，获得具有第I阈值以上的荧光强度的所述第2液滴和所述第4液滴的数量，并且基于所述第2液滴和所述第4液滴的数量，定量所述样品水溶液中所包含的所述第I核酸靶标的量和所述第2核酸靶标的量。
【文档编号】C12M1/34GK105969655SQ201610094710
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年2月19日
【发明人】佃雅彦
【申请人】松下知识产权经营株式会社