用于制备生物有机肥的组合物或复合菌剂的制作方法
【专利摘要】用于制备生物有机肥的组合物或复合菌剂。本申请提供一种组合物、复合菌剂及其应用。所述组合物或复合菌剂包含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌，其应用包括制备生物有机肥。
【专利说明】
用于制备生物有机肥的组合物或复合菌剂
技术领域
[0001] 本申请属于农业技术领域。具体地，本申请涉及用于制备生物有机肥的组合物或 复合菌剂。
【背景技术】
[0002] 木质纤维素是植物的主要成分，自然界产生的数量最大的有机物，由木质素和纤 维素物质相互缠绕覆盖构成。农业日常生产中产生的各类秸杆等废料，均富含木质纤维素， 在自然条件下降解缓慢，占据大面积的场地，焚烧则会引发大气污染，但含碳有机物丰富， 经过微生物发酵分解后，能产生植物可利用的小分子营养物质。动物粪便堆积，会恶臭难 闻，且含大量病原体，污染土壤、饮水，但氮元素丰富，适合作为氮源，弥补富含木质纤维农 副废料氮素匮乏的缺点，有助于微生物发酵降解较难分解的木质纤维素。将二者适当配比， 调配有利于微生物生活的碳氮比，并接种优选的降解菌，可促使废弃物发酵转化为有机肥 料，有机肥料能用于改良土壤。由于堆肥发酵属于生化过程，反应温和，无有害气体产生，又 能将无用的废料转化为具有较高附加价值的有机肥，具有环境、经济双重效益。
【发明内容】
[0003] -方面，本申请提供一种组合物，包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣 芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)和黄抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)〇
[0004] 另一方面，本申请提供一种复合菌剂，其活性成分包含枯草芽孢杆菌(Baci 1 lus subtilis)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)和黄抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)〇
[0005] 在一个实施方案中，所述复合菌剂由上述三种菌株组成。
[0006] 在一个实施方案中，所述复合菌剂包含上述三株菌株的培养物。
[0007] 另一方面，本申请还涉及一种复合菌剂的制备方法，包括：
[0008] 将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)和黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)分别进行培养；以及
[0009] 获得所述菌株的各自的培养物，并将所述培养物按照上述组合进行混合。
[0010]任选地，上述培养为固体培养、半固体培养或液体培养。
[0011] 另一方面，本申请还涉及一种制备或辅助制备生物有机肥的方法，包括：
[0012] 将上述组合物或上述复合菌剂投入发酵原料中进行发酵处理至少10天、至少15 天、至少20天，至少25天、至少30天、至少35天，至少40天、至少45天、至少50天，至少55天或 者至少60天；
[0013]所述发酵原料包括含植物纤维性物质。
[0014]在一个实施方案中，将上述组合物或上述复合菌剂投入发酵原料中进行发酵处理 至少34天或至少52天。
[0015] 发酵时间与环境温度相关，当环境温度较高时，发酵时间短，温度较低时，发酵时 间会延长。
[0016] 在一些实施方案中，冬季发酵时间较长，当环境温度为至少-10°C、至少_5°C、至 少_3°C、至少0°C、至少1 °C或至少3°C时，发酵时间为至少45天、至少50天、至少55天或至少 60天，优选地当环境温度为至少_3°C时，发酵时间为52天;夏季发酵时间较短，当环境温度 为至少25°C、至少30°C或至少35°C时，发酵时间为至少20天、至少25天，至少30天或至少35 天，优选地当环境温度为至少35°C时，发酵时间34天，以相关指标达到国家相关标准为准。
[0017] 在一个实施方案中，所述发酵原料包括含植物纤维性物质和动物粪便。
[0018]任选地，所述含植物纤维性物质为含木质素和/或纤维素和/或半纤维素的物质， 例如植物秸杆、果壳、木肩、竹肩或中药材废弃物。
[0019] 在一些实施方案中，所述复合菌剂相对于所述发酵原料的接种量为至少1 %、至少 2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%或者至少7%w/w。
[0020] 在一个实施方案中，所述复合菌剂相对于所述发酵原料的接种量为至少2%或至 少 3%w/w〇
[0021] 在一些实施方案中，所述发酵原料中的碳氮比为至少10:1、至少15:1、至少20:1、 至少25:1、至少30:1、至少35:1、至少40:1、至少45:1或至少50:1。
[0022]在一个实施方案中，所述发酵原料中的碳氮比为至少30:1。
[0023] 在一些实施方案中，所述发酵原料的含水量为至少10%、至少15%、至少20%、至 少25 %、至少30 %、至少35 %、至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少 65 % 或至少70 % w/w。
[0024]在一个实施方案中，所述发酵原料的含水量为至少50%。
[0025]另一方面，本申请还涉及用本文公开的方法处理发酵原料后得到的生物有机肥在 作为植物肥料或改良土壤中的应用。
[0026] 详述
[0027] 提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普 通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用 的所有专利文献、学术论文及其他公开出版物，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
[0028] 定义
[0029] 如本文所用术语"组合物"，是指包含两种或两种以上微生物菌种的混合物，或者 由所述微生物菌种组成。如果需要，所述组合物还可以包括其他的有利于所述菌株存放或 活性的物质，例如，培养基、微量元素、维生素、氨基酸、肉汤等。
[0030] 如本文所用术语"复合菌剂"，是指包含两种或两种以上且互不拮抗的微生物菌种 制成的微生物制剂，所述复合菌剂以所述菌种为活性成分，还可以另外包含载体或赋形剂， 也可以包含其他的有利于所述菌株存放或活性的物质例如，培养基、微量元素、维生素、氨 基酸、肉汤等。在一个实施方案中，所述菌剂一般配伍合理。
[0031] 如本文所用术语"菌落形成单位"，是指在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成 团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，以其表达活菌的数量。
[0032] 如本文所用术语"培养物"，是指在特定工艺条件控制下由微生物菌种在特定的培 养基上经过发酵后形成的微生物制品，它主要包含经过发酵后微生物菌种细胞群、微生物 菌种细胞外代谢产物和培养基。
[0033]如本文所用术语"植物纤维"，是指广泛分布在于种子植物中的一种厚壁组织，它 的细胞细长，两端尖锐，具有较厚的次生壁，壁上常有单纹孔，成熟时一般没有活的原生质 体，在植物体中主要起机械支持作用，是一种不能被消化的物质，包括纤维素、半纤维素、木 质素、果胶质、树胶质和一些非纤维素糖。
[0034]如本文所用术语"木质素"，是指一种广泛存在于植物体中的无定形的、分子结构 中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物。
[0035] 如本文所用术语"纤维素"，是指由葡萄糖组成的大分子多糖，不溶于水及一般有 机溶剂，是植物细胞壁的主要成分，纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占 植物界碳含量的50%以上。
[0036] 如本文所用术语"半纤维素"，是指几种不同类型的单糖构成的异质多聚体，这些 糖是五碳糖和六碳糖，包括木糖、阿拉伯糖和半乳糖等，半纤维素木聚糖在木质组织中占总 量的50%，它结合在纤维素微纤维的表面，并且相互连接，这些纤维构成了坚硬的细胞相互 连接的网络。
[0037] 如本文所用术语"植物秸杆"，是指成熟农作物茎叶(穗)部分的总称，通常指小麦、 水稻、玉米、薯类、油菜、棉花、甘蔗和其它农作物(通常为粗粮)在收获籽实后的剩余部分， 农作物光合作用的产物有一半以上存在于秸杆中，秸杆富含氮、磷、钾、钙、镁和有机质等， 是一种具有多用途的可再生的生物资源。
[0038]如本文所用术语"中药材废弃物"，是指中药材提取有效活性成分后剩余的废弃 物。
[0039]如本文所用术语"碳氮比"，是指有机物中碳的总含量与氮的总含量的比值。
[0040] 如本文所用术语"有效活菌数"，是指所有在高氏1号培养基上生长的放线菌，在牛 肉膏蛋白胨培养基上生长的细菌和在察氏培养基上生长的真菌的有效活菌数之和。
[0041] 如本文所用术语"有机质"，是指含碳的有机化合物，包括动植物残渣，微生物以及 其分解合成的化合物。
[0042] 如本文所用术语"粪大肠菌"，是指生长于人和温血动物肠道中的一组肠道细菌， 随粪便排出体外，约占粪便干重的1 /3以上，故称为粪大肠菌群。
[0043]如本文所用术语"生物有机肥"，是指特定功能微生物与主要以动植物残体(如畜 禽粪便、农作物秸杆等)为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的一类兼具微生 物肥料和有机肥效应的肥料。
[0044] 如本文所用术语"肥料"，是指提供一种或一种以上植物必需的营养元素，改善土 壤性质、提高土壤肥力水平的一类物质。
[0045] 如本文所用术语"干基"，是指以单位质量无水固体为基准表示湿固体中的水分。
【具体实施方式】
[0046] -方面，本申请提供一种组合物，包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣 芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)和黄抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)〇
[0047] 另一方面，本申请提供一种复合菌剂，其活性成分包含枯草芽孢杆菌(Baci 1 lus subtilis)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)和黄抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)〇
[0048] 在一个实施方案中，所述复合菌剂由上述三种菌株组成。
[0049] 在一个实施方案中，所述复合菌剂包含上述三株菌株的培养物。
[0050] 在一些实施方案中，所述组合物中或所述复合菌剂中上述三种菌株的总有效活菌 数为（1 X 1〇8~1 X l〇n)cfu/g，优选地上述三种菌株的总有效活菌数为（1 X 109~1 X 101Q) cfu/g，更优选地上述三种菌株的总有效活菌数为9.707 X 109cfu/g或9.404 X 109cfu/g。
[0051] 在一些实施方案中，以菌落形成单位计，所述组合物中或所述复合菌剂中枯草芽 孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌以菌落形成单位计的比例为：（2~8): (2~8): (1 ~4);优选上述菌株之间以菌落形成单位计的比例为2:2:1。
[0052]另一方面，本申请还涉及一种复合菌剂的制备方法，包括：
[0053] 将枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)和黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)分别进行培养；以及 [0054]获得所述菌株的各自的培养物，并将所述培养物按照上述组合进行混合。
[0055]任选地，上述培养为固体培养、半固体培养或液体培养。
[0056]在一些实施方案中，所述复合菌剂的制备方法中，以菌落形成单位计，混合后枯草 芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌以菌落形成单位计的比例为：（2~8): (2~8): (1~4);优选上述菌株之间以菌落形成单位计的比例为2:2:1;
[0057]任选地，所述复合菌剂中上述三种菌株的总有效活菌数为（1 X 108~1 X 10n)cfu/ g，优选地上述三种菌株的总有效活菌数为（1 X 1〇9~1 X 1〇1()) cfu/g，更优选地上述三种菌 株的总有效活菌数为9.707 X 109cfu/g或9.404 X 109cfu/g。
[0058] 本申请所用菌种均为已知菌种，可通过常规筛选、商业手段或其它途径获得。
[0059] 在一个实施方案中，枯草芽孢杆菌可通过常规筛选获得，例如在甘蔗渣-猪粪或锯 末-牛粪堆肥结束后的腐熟剂中采集样本，无菌操作，取lg样本，装入高压蒸汽灭菌后的 100mL无菌水中，充分振荡，再用无菌水梯度稀释，得到适当浓度菌液，稀释涂布至羧甲基纤 维素钠平板上，32°C培养2天，以刚果红染色，用水解圈法进行初步筛选，得到水解圈/菌落 直径比值较大的菌，然后将之接种至以滤纸为唯一碳源的PCS培养基中，50 °C下培养，测定3 天后滤纸降解率，得到降解率80 %以上的菌株，进行菌种鉴定，得到枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)。
[0060] 在一个实施方案中，地衣芽孢杆菌可通过常规筛选获得，例如在甘蔗渣-猪粪或锯 末-牛粪堆肥结束后的腐熟剂中采集样本，无菌操作，取lg样本，装入高压蒸汽灭菌后的 100mL无菌水中，充分振荡，再用无菌水梯度稀释，得到适当浓度菌液，稀释涂布至羧甲基纤 维素钠平板上，32°C培养2天，以刚果红染色，用水解圈法进行初步筛选，得到水解圈/菌落 直径比值较大的菌，然后将之接种至以滤纸为唯一碳源的PCS培养基中，50 °C下培养，测定3 天后滤纸降解率，得到降解率80 %以上的菌株，进行菌种鉴定，得到地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)。
[0061 ]在一个实施方案中，黄孢原毛平革菌可通过常规筛选获得，例如在甘蔗渣-猪粪或 锯末-牛粪堆肥结束后的腐熟剂中采集样本，无菌操作，取lg样本，装入高压蒸汽灭菌后的 100mL无菌水中，充分振荡，再用无菌水梯度稀释，得到适当浓度菌液，稀释涂布至羧甲基纤 维素钠平板上，32°C培养2天，以刚果红染色，用水解圈法进行初步筛选，得到水解圈/菌落 直径比值较大的菌，然后将之接种至以滤纸为唯一碳源的PCS培养基中，50 °C下培养，测定3 天后滤纸降解率，得到降解率80 %以上的菌株，进行菌种鉴定，得到黄孢原毛平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)〇
[0062] 在一些实施方案中，用于培养所述菌种的固体培养的培养基可为麸皮培养基、米 糠培养基、马铃薯培养基、豆饼粉培养基或花生饼粉培养基。
[0063] 在一些实施方案中，用于培养所述菌种的液体培养的培养基可为牛肉膏蛋白胨液 体培养基、PDA液体培养基或LB液体培养基。
[0064] 在一些实施方案中，用于培养所述菌种的半固体培养的培养基可为在液体培养基 中加入少量的凝固剂(如〇. 2 %~0.5 %的琼脂)制备而成。
[0065] 培养物主要由微生物菌种细胞外代谢产物(例如酶、多糖、脂类、有机酸等）、经过 发酵后变异的培养基和微生物菌种细胞群构成。
[0066] 在一个实施方案中，复合菌剂的制备方法包括以下至少一种方法或步骤：
[0067] 1)将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌分别平板活化进行平板活 化，枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌均采用牛肉膏蛋白胨固体培养基在36~38°C培养36小 时，黄孢原毛平革菌采用Η)Α固体培养基在32~34°C培养3天，分别获得枯草芽孢杆菌活化 菌种、地衣芽孢杆菌活化菌种和黄孢原毛平革菌活化菌种。
[0068] 2)将步骤1)中的枯草芽孢杆菌活化菌种、地衣芽孢杆菌活化菌种和黄孢原毛平革 菌活化菌种分别进行摇瓶培养，枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌均采用牛肉膏蛋白胨液体培 养基在36~38°C培养36小时，黄孢原毛平革菌采用TOA液体培养基在32~34°C培养3天，分 别获得枯草芽孢杆菌摇瓶菌种、地衣芽孢杆菌摇瓶菌种和黄孢原毛平革菌摇瓶菌种。
[0069] 3)将步骤2)中的枯草芽孢杆菌摇瓶菌种、地衣芽孢杆菌摇瓶菌种和黄孢原毛平革 菌摇瓶菌种分别进行种子罐培养，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌均采用牛肉膏蛋白胨液体 培养基在pH 7~8,30~35°C培养2天，黄孢原毛平革菌采用PDA液体培养基在pH 5,27~30 °C培养5天，分别获得枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液和黄孢原毛平革菌种子 液;上述菌株均采用液体好氧培养，各菌株种子液中的菌落形成单位为多1 X 109cfu/mL。
[0070] 4)将步骤3)中枯草芽孢杆菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液和黄孢原毛平革菌种子 液按2%重量百分比的接种量接种到分别接入麸皮培养基(组成为麸皮，如小麦麸皮）中进 行固体培养，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌均在pH 7~8,30~35°C培养2~3天，黄孢原毛 平革菌在pH5,27~30 °C培养5天，分别获得枯草芽孢杆固体培养物、地衣芽孢杆菌固体培养 物和黄孢原毛平革菌固体培养物；
[0071] 枯草芽孢杆菌固体培养物中含有枯草芽孢杆菌细胞群、枯草芽孢杆菌代谢产物 (例如蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶、乳酸等)和发酵后的麸皮培养基;地衣芽孢杆菌 固体培养物中含有地衣芽孢杆菌细胞群、地衣芽孢杆菌代谢产物(例如纤维素酶、漆酶、蛋 白酶、脂肪酶、淀粉酶)和发酵后的麸皮培养基;黄孢原毛平革菌固体培养物中含有黄孢原 毛平革菌细胞群、黄孢原毛平革菌代谢产物(例如，蛋白酶、漆酶、木质素酶、纤维素酶)和发 酵后的麸皮培养基。上述各菌株固体培养物中的含水量均为50~60%，各菌株的有效活菌 数均为彡lX10 9cfu/g。
[0072] 将上述枯草芽孢杆菌固体培养物、地衣芽孢杆菌固体培养物和黄孢原毛平革菌固 体培养物进行干燥，干燥可为喷粉干燥、真空干燥或流化床干燥，分别得到枯草芽孢杆菌固 体菌剂、地衣芽孢杆菌固体菌剂和黄孢原毛平革菌固体菌剂;枯草芽孢杆菌固体菌剂中枯 草芽孢杆菌的有效活菌数为多1 X 109cfu/g，地衣芽孢杆菌固体菌剂中地衣芽孢杆菌的有 效活菌数为多IX 109cfu/g，黄孢原毛平革菌固体菌剂中黄孢原毛平革菌的有效活菌数为 多1X109cfu/g。
[0073] 将枯草芽孢杆菌固体菌剂、施氏假单胞菌固体菌剂和约氏不动杆菌固体菌剂进行 混合得到复合菌剂，复合菌剂中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌以菌落形 成单位计的比例为：（2~8): (2~8): (1~4)，复合菌剂中上述三种菌株的总有效活菌数为 (lX109~lX1010)cfu/g。
[0074] 在一个实施方案中，枯草芽孢杆菌固体菌剂中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为1.2 X 101()Cfu/g、地衣芽孢杆菌固体菌剂中地衣芽孢杆菌的有效活菌数为1.1 X lO'fu/g，黄 孢原毛平革菌固体菌剂中黄孢原毛平革菌的有效活菌数为0.6X101()Cfu/g，将枯草芽孢杆 菌固体菌剂、地衣芽孢杆菌固体菌剂和黄孢原毛平革菌固体菌剂按照0.323:0.353:0.323 的干重比进行混合，得到复合菌剂;复合菌剂中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平 革菌的菌落形成单位比为2:2:1，复合菌剂中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平革 菌的总有效活菌数为9.707 X 109cfu/g。
[0075] 在一个实施方案中，枯草芽孢杆菌固体菌剂中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为0.9 X101()Cfu/g、地衣芽孢杆菌固体菌剂中地衣芽孢杆菌的有效活菌数为1.2X101()Cfu/g，# 孢原毛平革菌固体菌剂中黄孢原毛平革菌的有效活菌数为0.7X10 1()Cfu/g，将枯草芽孢杆 菌固体菌剂、地衣芽孢杆菌固体菌剂和黄孢原毛平革菌固体菌剂按照0.417:0.314:0.269 的干重比进行混合，得到复合菌剂;复合菌剂中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平 革菌的菌落形成单位比为2:2:1，复合菌剂中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平革 菌的总有效活菌数为9.404 X 109cfu/g。
[0076] 另一方面，本申请还涉及一种制备或辅助制备生物有机肥的方法，包括：
[0077] 将上述组合物或上述复合菌剂投入发酵原料中进行发酵处理至少10天、至少15 天、至少20天，至少25天、至少30天、至少35天，至少40天、至少45天、至少50天，至少55天或 者至少60天；
[0078]所述发酵原料包括含植物纤维性物质。
[0079]在一个实施方案中，将上述组合物或上述复合菌剂投入发酵原料中进行发酵处理 至少34天或至少52天。
[0080] 发酵时间与环境温度相关，当环境温度较高时，发酵时间短，温度较低时，发酵时 间会延长。
[0081] 在一些实施方案中，冬季发酵时间较长，当环境温度为至少-10°C、至少_5°C、至 少_3°C、至少0°C、至少1 °C或至少3°C时，发酵时间为至少45天、至少50天、至少55天或至少 60天，优选地当环境温度为至少_3°C时，发酵时间为52天;夏季发酵时间较短，当环境温度 为至少25°C、至少30°C或至少35°C时，发酵时间为至少20天、至少25天，至少30天或至少35 天，优选地当环境温度为至少35°C时，发酵时间34天，以相关指标达到国家相关标准为准。
[0082] 任选地，所述含植物纤维性物质为含木质素和/或纤维素和/或半纤维素的物质， 例如植物秸杆、果壳、木肩、竹肩或中药材废弃物。
[0083] 在一个实施方案中，植物秸杆可为小麦秸杆、玉米秸杆、水稻秸杆、高粱秸杆或谷 子秸杆;果壳可为花生壳、核桃壳或棉花壳；中药材废弃物可为柴胡废弃物、当归废弃物、赤 芍废弃物或白芷废弃物。
[0084] 在一些实施方案中，植物秸杆、果壳、中药材废弃物可直接进行发酵，或粉碎后进 行发酵，粉碎物的大小为20目。
[0085] 在一些实施方案中，动物粪便可为鸡粪、牛粪、猪粪、羊粪、鸭粪、马粪等，动物粪便 用于补充氮源。
[0086] 在一些实施方案中，所述复合菌剂相对于所述发酵原料的接种量为至少1 %、至少 2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%或者至少7%w/w。
[0087] 在一个实施方案中，所述复合菌剂相对于所述发酵原料的接种量为至少2%或至 少 3%w/w〇
[0088] 在一些实施方案中，经重铬酸钾检测法和凯式定氮检测后确认物料基本性质，使 得发酵原料中的碳氮比为至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少35:1、 至少40:1、至少45:1或至少50:1。
[0089] 在一个实施方案中，经重铬酸钾检测法和凯式定氮检测后确认物料基本性质，使 得发酵原料中的碳氮比为至少30:1。
[0090] 在一些实施方案中，所述发酵原料的含水量为至少10%、至少15%、至少20%、至 少25 %、至少30 %、至少35 %、至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少 65 % 或至少70 % w/w。
[0091 ]在一个实施方案中，所述发酵原料的含水量为至少50%。
[0092]在一个实施方案中，复合菌剂的加入方式为一层发酵原料，一层复合菌剂，依次再 铺上发酵原料和复合菌剂，然后用旋耕机或翻堆机进行搅拌混合。复合菌剂的添加量为至 少2%或至少3%;发酵的高温期温度多50°C时需要进行每日翻堆处理，散热通氧，并在每日 正午进行多点温度监测，待温度降至50°C以下后，适当降低翻堆强度，待温度进一步下降， 放置直至温度与环境完全一致，完成发酵。
[0093] 对发酵获得的生物有机肥进行效果检测，分别测定生物有机肥中有效活菌数、有 机质含量、pH值、粪大肠杆菌个数、蛔虫卵存活率及干基状态的重金属含量(砷、镉、铅、铬或 汞)。
[0094] 指标测定方法依据《粪便无害化卫生要求》GB7959-2012中给定方法测定。其中，有 效活菌数采用使用稀释涂布平板法测定;有机质含量采用马沸炉高温灼烧物料，物料处理 前质量减去处理后残余的灰分，即为有机质含量;pH值测定通过多处采样，混合后采用5倍 体积的去离子水充分振荡，4000r/min离心10min，取上清液用酸碱计测定;奠大肠杆菌数和 蛔虫卵存活率计算方法根据我国《粪便无害化卫生要求》GB7959-2012中给定方法测定;汞 含量采用DMA80型测汞仪测定;砷、镉、铅和铬含量的测定采用8300DV型电感耦合等离子体 光谱仪进行测定。
[0095] 上述各指标在农业部生物有机肥标准要求(NY884-2012)中的标准值如下：
[0098] 另一方面，本申请还涉及用本文公开的方法处理发酵原料后得到的生物有机肥在 作为植物肥料或改良土壤中的应用。
[0099] 因此，本申请提供的用于制备生物有机肥的组合物或复合菌剂，具有以下至少一 种优势：
[0100] (1)本申请的组合物或复合菌剂中，各菌株能适应自然环境，接种到秸杆或中药材 废弃物中，所选育菌株均可以存活，进行代谢活动和原料发酵。
[0101] (2)本申请的组合物或复合菌剂中，各菌株能快速生长繁殖，能够达到快速发酵、 节省处理时间的目的。
[0102] (3)本申请的组合物或复合菌剂中，各菌株均为优势菌株，能适应原料的发酵环 境，其代谢产物，例如乳酸、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等能够抑制其他杂菌的生长， 更有利于发酵的进行。
[0103] (4)本申请的组合物或复合菌剂中，各菌株配比合理，能够发挥各自的降解优势。
[0104] (5)本申请的组合物或复合菌剂中，各菌株快速分解农副废料，相对于自然怄肥， 降解速度增快，缩短场地占用周期，节约用地。
[0105] (6)本申请利用微生物资源为降解单位，以农业废料为原材料，全程利用生物资 源，转化为具备较高价值的生物有机肥，具备环保、经济双重效益。
[0106] (7)本申请发酵堆肥依据的原理是生化反应，过程温和，相对于废料常见的焚烧处 理，避免产生大量有害气体和悬浮颗粒造成的环境污染。
[0107] (8)本申请发酵获得的生物有机肥各指标均达到或超过农业部NY884-2012有机肥 行业标准。
[0108] (9)本申请获得的生物有机肥可应用于农作物、蔬菜或其他经济作物的肥料，对改 良土壤结构也具有重要作用。
[0109] 在一些实施方案中，本申请提供的用于制备生物有机肥的组合物或复合菌剂，获 得以下至少一种效果：
[0110] (1)使用本申请的组合物或复合菌剂制备的生物有机肥的各项指标均优于对照组 生物有机肥，具体数据参见实施例。其中，实验组生物有机肥的pH值在7.8~8.1，说明堆体 中水溶性氨含量较低，氮素损失更小;蛔虫卵死亡率更高，比对照组升高至少20%;粪大肠 杆菌含量更低，比对照组降低至少80%。
[0111] (2)使用本申请的组合物或复合菌剂制备的生物有机肥相对于对照组生物有机 肥，实验组中各重金属含量均显著降低，各重金属含量降低至少15%，具体数据参见实施 例。其中，相对于对照组，实验组中砷含量降低至少15%，镉含量降低至少20%，汞含量降低 至少30 %。
[0112] (3)使用本申请的组合物或复合菌剂制备的生物有机肥相对于对照组生物有机 肥，可成形的残体数量明显减少，发酵程度更高，恶臭气味明显减少。
[0113] 以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。
[0114] 实施例1
[0115] 时间地点：2014年7月4日至8月6日，河南省平顶山近郊湛河区。室外温度30~38 °C，处理地点在地面干燥的棚下。
[0116] 枯草芽孢杆菌固体菌剂中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为1.2X101()Cfu/g，地衣芽 孢杆菌固体菌剂中地衣芽孢杆菌的有效活菌数为1.1 X l〇1()cfu/g，黄孢原毛平革菌固体菌 剂中黄孢原毛平革菌的有效活菌数为0.6 X101()Cfu/g，将枯草芽孢杆菌固体菌剂、地衣芽孢 杆菌固体菌剂和黄孢原毛平革菌固体菌剂按照0.323:0.353:0.323的干重比进行混合，得 到复合菌剂;复合菌剂中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌的菌落形成单位 比为2:2:1，复合菌剂中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌的总有效活菌数为 9.707X10 9cfu/g。
[0117] 堆制过程:预备完成对24吨麦秸杆的无害化处理和资源化还田，用鸡粪补充氮源。 经重铬酸钾检测法和凯式定氮检测后确认物料基本性质。鸡粪:总碳23.4%，总氮1.43%， 碳氮比16.36。麦秸杆:总氮41.7%，有机碳0.41，碳氮比101.7。
[0118]将鸡粪与麦秸杆适当混合，调节碳氮比为30:1，含水量为50%，得到发酵物料。实 验组按发酵物料的2 %的重量比例接种复合菌剂，复合菌剂的加入方式为一层发酵物料，一 层复合菌剂，依次再铺上发酵物料和复合菌剂，然后用翻堆机进行搅拌混合，得到实验组发 酵原料。由于夏季环境温度较高（35°C以上），经过2天即进入高温期（彡50°C)，随每日适当 翻堆，散热通氧，并在每日正午进行多点温度监测，待温度降至50°C以下后，适当降低翻堆 强度，待温度进一步下降，放置直至温度与环境完全一致。由于夏季室外气温较高，因此本 次堆肥周期较短，只用了34天，得到实验组生物有机肥。对照组为与实验组发酵原料相同重 量的上述发酵物料，不加入复合菌剂，在与实验组相同的发酵条件下发酵34天，得到对照组 生物有机肥。
[0119]堆制效果：堆制完成后，经多点采样检测，按照农业部有机肥标准要求(NY884-2012)中的指标对实验组生物有机肥和对照组生物有机肥进行测定，结果如表1和表2所示： [0120]表1主要技术指标
[0122]表2重金属含量
[0125]从上述结果可以看出，实验组的生物有机肥的各项指标均优于对照组生物有机 肥。其中，实验组的可成形的残体数量明显小于对照组，且可成形的残体，用手轻轻按压即 散碎，而对照组则需较大力度方可散碎，说明实验组明显促进了纤维素的降解。实验组生物 有机肥有机质降解程度更高，说明实验组中的菌群的活动强度更高;pH值更小，说明堆体中 水溶性氨含量较低，氮素损失更小;粪大肠杆菌含量更低，比对照组降低80.60 % ;蛔虫卵死 亡率更高，比对照组升高22.4%;各重金属含量均低于国家相关标准值，降低了生物毒性。 实验组生物有机肥中重金属含量均低于对照组生物有机肥，说明复合菌剂中的菌株加强了 对各重金属的钝化作用;其中，相对于对照组，实验组生物有机肥中总砷含量降低15.65%， 总锦含量降低23.53 %，总铅含量降低22.96 %，总络含量降低16.38 %，总萊含量降低 30.77 %。实验组生物有机肥比对照组生物有机肥发酵程度更高，有机质被降解程度更高， 而且实验组有机肥的恶臭气味明显小于对照组生物有机肥。
[0126] 实施例2
[0127] 时间地点：2015年1月2日至2月22日，山东临沂益源环保公司废料处理场地内。室 外温度-1~3°C之间，处理地点在地面干燥的棚下。
[0128] 枯草芽孢杆菌固体菌剂中枯草芽孢杆菌的有效活菌数为0.9X101()Cfu/g，地衣芽 孢杆菌固体菌剂中地衣芽孢杆菌的有效活菌数为1.2 X101()Cfu/g，黄孢原毛平革菌固体菌 剂中黄孢原毛平革菌的有效活菌数为〇. 7 X 101()Cfu/g，将枯草芽孢杆菌固体菌剂、地衣芽孢 杆菌固体菌剂和黄孢原毛平革菌固体菌剂按照0.417:0.314:0.269的干重比进行混合，得 到复合菌剂;复合菌剂中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌的菌落形成单位 比为2:2:1，复合菌剂中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌的总有效活菌数为 9.404X10 9cfu/g。
[0129] 堆制过程:预计完成对70吨压榨蒸煮后中药材柴胡的堆制(木质纤维素），用牛粪 补充氮源。经重铬酸钾检测法和凯式定氮检测后确认物料基本性质。牛粪:总碳16.7 %，总 氮1.07%，碳氮比15.6。中药材柴胡药渣:总氮0.43%，有机碳39.2%，碳氮比91.2。
[0130]将牛粪与中药材柴胡药渣适当混合，调节碳氮比为30:1，含水量为50%，得到发酵 物料。实验组按发酵物料的3%重量比例接种复合菌剂，复合菌剂的加入方式为一层发酵物 料，一层复合菌剂，依次再铺上发酵物料和复合菌剂，然后用翻堆机进行搅拌混合，得到实 验组发酵原料。由于环境温度较低（-3 °C左右），经过5天方进入高温期（多50°C)，随每日适 当翻堆，散热通氧，并在每日正午进行多点温度监测，待温度降至50°C以下后，适当降低翻 堆强度，以不使温度降至35°C以下为准。待温度进一步下降，放置直至温度与环境完全一 致。由于冬季室外气温较低，因此本次堆肥周期较长，持续52天，得到实验组生物有机肥。对 照组为与实验组发酵原料相同重量的上述发酵物料，不加入复合菌剂，在与实验组相同的 发酵条件下发酵52天，得到对照组生物有机肥。
[0131] 堆制效果：堆制完成后，经多点采样检测，按照农业部有机肥标准要求(NY884-2012)中的指标对实验组生物有机肥和对照组生物有机肥进行测定，结果如表3和表4所示：
[0132] 表3主要技术指标
[0135] 表4重金属含量
[0137] 从上述结果可以看出，实验组的生物有机肥的各项指标均优于对照组生物有机 肥。其中，实验组的可成形的残体数量明显小于对照组，且可成形的残体，用手轻轻按压即 散碎，而对照组则需较大力度方可散碎，说明实验组明显促进了纤维素的降解。实验组生物 有机肥有机质降解程度更高，说明实验组中的菌群的活动强度更高;pH值更小，说明堆体中 水溶性氨含量较低，氮素损失更小;粪大肠杆菌含量更低，比对照组降低80.68 % ;蛔虫卵死 亡率更高，比对照组升高31.7%;各重金属含量均低于国家相关标准值，降低了生物毒性。 实验组生物有机肥中重金属含量均低于对照组生物有机肥，说明复合菌剂中的菌株加强了 对各重金属的钝化作用；其中，相对于对照组，实验组生物有机肥中总砷含量降低24.65%， 总锦含量降低45.24%，总铅含量降低27.46 %，总络含量降低36.92 %，总萊含量降低 37.04%。实验组生物有机肥比对照组生物有机肥发酵程度更高，有机质被降解程度更高， 而且实验组有机肥的恶臭气味明显小于对照组生物有机肥。
[0138] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种组合物，包含枯草芽孢杆菌（Baci llus subtilis)、地衣芽孢杆菌（Bacil lus licheniformis)和黄抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium) 〇2. -种复合菌剂，其活性成分包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)和黄抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium);优选地 由上述三种菌株组成;或者包含上述三株菌株的培养物。3. 如权利要求2所述复合菌剂，其中所述复合菌剂中上述三种菌株的总有效活菌数为 (1 X 108~1 X 10n)cfu/g，优选地上述三种菌株的总有效活菌数为（1 X 109~1 X 101Q)cfu/ g，更优选地上述三种菌株的总有效活菌数为9.707 X 109cfu/g或9.404 X 109cfu/g; 或者，以菌落形成单位计，所述复合菌剂中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平 革菌以菌落形成单位计的比例为：（2~8): (2~8): (1~4);优选上述菌株之间以菌落形成 单位计的比例为2:2:1。4. 一种复合菌剂的制备方法，包括： 将枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)和 黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)分别进行培养；以及 获得所述菌株的各自的培养物，并将所述培养物按照上述组合进行混合，得到所述复 合菌剂； 任选地，上述培养为固体培养、半固体培养或液体培养。5. 如权利要求4所述的方法，其中以菌落形成单位计，混合后所述复合菌剂中枯草芽孢 杆菌、地衣芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌以菌落形成单位计的比例为：（2~8): (2~8): (1~ 4);优选上述菌株之间以菌落形成单位计的比例为2:2:1; 任选地，所述复合菌剂中上述三种菌株的总有效活菌数为（1 X 1〇8~1 X l〇n)cfu/g，优 选地上述三种菌株的总有效活菌数为（1 X 109~1 X 101())cfu/g，更优选地上述三种菌株的 总有效活菌数为 9 · 707 X 109cfu/g或 9 · 404 X 109cfu/g。6. -种制备或辅助制备生物有机肥的方法，包括： 将权利要求1所述组合物，或权利要求2或3所述复合菌剂投入发酵原料中进行发酵处 理至少10天、至少15天、至少20天，至少25天、至少30天、至少35天，至少40天、至少45天、至 少50天，至少55天或者至少60天； 所述发酵原料包括含植物纤维性物质； 优选地，所述发酵原料包括含植物纤维性物质和动物粪便； 任选地，所述含植物纤维性物质为含木质素和/或纤维素和/或半纤维素的物质，例如 植物秸杆、果壳、木肩、竹肩或中药材废弃物。7. 如权利要求6所述的方法，其中所述组合物或所述复合菌剂相对于所述发酵原料的 接种量至少1 %、至少2 %、至少3 %、至少4%、至少5 %、至少6 %或者至少7 %w/w，优选为至 少2%或至少3%￥/\￥。8. 如权利要求6或7所述的方法，其中所述发酵原料中的碳氮比为至少10:1、至少15:1、 至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少35:1、至少40:1、至少45:1或至少50:1，优选地为至少 30:1； 所述发酵原料的含水量为至少10 %、至少15 %、至少20%、至少25%、至少30%、至少 35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%或至少70%￥/^，优选 地为至少50 %。9. 权利要求6-8中任一所述的方法制备的生物有机肥。10. 权利要求6-8中任一所述的方法制备的生物有机肥在作为植物肥料或改良土壤中 的应用。
【文档编号】C12R1/125GK105969684SQ201610307583
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】陈五岭, 马玮超
【申请人】福建美家园生物科技股份有限公司