重组减毒炭疽芽胞杆菌及其应用

重组减毒炭疽芽胞杆菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了重组减毒炭疽芽胞杆菌及其应用。本发明提供了重组菌，为降低和/或抑制炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCCNO.4912中mntA蛋白和nos蛋白活性得到的菌。本发明的实验证明，本发明炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431 CGMCC NO.12321毒力较现有疫苗株A16R大降低，无抗生素抗性标记，能够在菌体的S层表面稳定表达保护性抗原，且该菌株能够形成芽胞。本发明构建的菌株为新型疫苗的研究打下基础。CGMCC NO. 1232120160330CGMCC NO.491220110526
【专利说明】
重组减毒炭疽芽胞杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及重组减毒炭疽芽胞杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)是一种G+菌，它引起的炭疽是一种烈性传染 病，在我国列为乙类传染病，已经列入国家的计划免疫。现批准使用的炭疽疫苗A16R株仍保 留有编码毒素的大质粒PX01，具有一定的残留毒性。因此研究更加安全有效的新型炭疽杆 菌疫苗就显得非常有必要。
[0003] 减毒炭疽杆菌作为宿主进行保护性抗原表达是研究新型炭疽杆菌疫苗的一种重 要策略，相关研究也已有报道，但由于其培养过程中要求使用抗生素而限制了其使用。因 此，利用减毒炭疽杆菌为宿主，通过基础重组技术，采用靶基因整合到染色体实现目标基因 稳定表达构建新型的疫苗候选株。其次，采用表面呈现的方法进行抗原表达一直被认为是 一种比较理想的外源抗原表达，利于其免疫后机体相关免疫进行抗原提呈。另外考虑到重 组菌作为疫苗安全性问题，对菌株的毒力相关基因进行缺失突变也是构建活载体疫苗一种 常用的方法。总之，通过一系列基因操作，构建和研究一种新型的炭疽芽胞杆菌疫苗。

【发明内容】

[0004] 本发明一个目的是提供了一种重组减毒炭疽芽胞杆菌。
[0005] 本发明提供的重组菌，为降低和/或抑制炭疽芽胞杆菌4?429 061〇：^).4912中 mntA蛋白和nos蛋白活性得到的菌。
[0006] 上述重组菌中，所述降低和/或抑制炭疽芽胞杆菌六?429 061〇：勵.4912中111拉八蛋 白和nos蛋白活性为沉默炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCC N0.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋 白编码基因的表达。
[0007] 上述重组菌中，所述沉默炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCC N0.4912中mntA蛋白编码基 因和nos蛋白编码基因的表达为敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCC N0.4912中mntA蛋白编码 基因和nos蛋白编码基因。
[0008] 上述重组菌中，所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCC N0.4912中mntA蛋白编码基 因和nos蛋白编码基因均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行。
[0009] 上述重组菌中，所述同源重组为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组 或自杀质粒介导的同源重组。
[0010] 所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCC N0.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋白编 码基因包括如下步骤：
[0011] 1)将质粒PSS4332导入宿主菌中，得到表达质粒pSS4332的宿主菌；
[0012] 2)将表达mntA蛋白编码基因上游同源臂、mntA蛋白编码基因的下游同源臂、壮观 霉素和I-Scel识别位点的重组载体A导入表达质粒pSS4332的宿主菌中，得到中间菌A;质粒 PSS4332表达的归巢内切酶I-scel将转化入细胞内的的带I-scel酶切位点的重组载体A进 行切割，促进重组载体A与基因组的同源重组；
[0013] 3)将中间菌A进行不加卡那霉素传代培养，使质粒pSS4332丢失，得到敲除mntA蛋 白编码基因的重组菌A;
[0014] 4)将质粒PSS4332导入重组菌A中，得到表达PSS4332的重组菌A;
[0015] 5)将表达nos蛋白编码基因上游同源臂、nos蛋白编码基因的下游同源臂、壮观霉 素和I-Scel识别位点的重组载体B导入表达pSS4332的重组菌A中，得到中间菌B;质粒 PSS4332表达的归巢内切酶I-scel将转化入细胞内的的带I-scel酶切位点的重组载体B进 行切割，促进重组载体B与基因组的同源重组；
[0016] 6)将所述中间菌B进行不加卡那霉素传代培养，使质粒PSS4332丢失，得到敲除 mntA和nos蛋白编码基因的重组菌Bacillus anthracis AP429AmntAAnos〇
[0017] 上述重组菌中，所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCCN0.4912中mntA蛋白编码基因 采用的同源重组的mntA蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列1第1-958位；
[0018] 所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCCN0.4912中mntA蛋白编码基因采用的同源重 组的mntA蛋白编码基因的下游同源臂的核苷酸序列为序列1第1895-2875位；
[0019] 所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCCN0.4912中nos蛋白编码基因采用的同源重组 的nos蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列2第1-805位；
[0020] 所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429 CGMCCN0.4912中nos蛋白编码基因采用的同源重组 的nos蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为序列2第1872-2680位。
[0021] 上述重组菌中，所述重组菌保藏号为CGMCC N0.12321。
[0022] 将炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431于2016年3月30日保藏于中国微生 物菌种保藏管委理员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路）， 保藏号为CGMCC N0.12321，分类命名为炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)。
[0023] 上述的重组菌在制备如下1)或2)产品中的应用也是本发明保护的范围：
[0024] 1)、炭疽杆菌疫苗；
[0025] 2)、预防和/或治疗炭疽杆菌引发的疾病的产品。
[0026] 本发明的另一个目的是提供一种如下1)或2)产品。
[0027] 本发明提供的产品，其活性成分为其活性成分为A或B;
[0028] A为上述的重组菌；
[0029] B为表达mntA蛋白编码基因上游同源臂和mntA蛋白编码基因的下游同源臂的重组 载体和表达nos蛋白编码基因上游同源臂和nos蛋白编码基因的下游同源臂的重组载体；
[0030] 1)、炭疽杆菌疫苗；
[0031] 2)、预防和/或治疗炭疽杆菌引发的疾病的产品。
[0032] 本发明表达保护性抗原的重组菌株可以用作炭疽杆菌疫苗，所述免疫制剂优选为 灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程疫苗。
[0033] 本发明的实验证明，本发明炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431 CGMCC NO. 12321毒力较现有疫苗株A16R大降低，无抗生素抗性标记，能够在菌体的S层表面稳定表 达保护性抗原，且该菌株能够形成芽胞。本发明构建的菌株为新型疫苗的研究打下基础。
【附图说明】
[0034]图1为mntA基因敲除的过程示意图。
[0035]图2为mntA基因敲除株PCR鉴定结果。
[0036] 图3为nos基因敲除株PCR鉴定结果。
[0037] 图4为重组炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431免疫印迹分析结果。
[0038] 图5为炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431流式细胞术分析结果。
[0039]图6为炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431的芽胞形成能力分析结果。
[0040] 图7为重组炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431小鼠毒力评价结果。
[0041 ] 图8为炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431小鼠免疫评价实验结果。
[0042] 图9为炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431小鼠免疫保护实验结果。
【具体实施方式】
[0043] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045] 13.3111:11瓜(^84?429于2011年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通 微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路），保藏号为CGMCC N0.4912，分 类命名为炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)。
[0046] 实施例1、减毒炭疽芽胞杆菌突变株AP431的获得
[0047] 一、mntA基因的敲除 [0048] 1、通用质粒改造
[0049] 设计带有两个LoxP位点及BamHI、SalI、HindIII、MluI、EcoRI、I-Scel和Ncol等酶 切位点的DNA序列，交由苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成和克隆到质粒pUC57， 最后得到的质粒命名为pUC-Scel。具体序列如下：
[0050] GGATCCCGCGTCGACGCATGCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGCTTATAACTTC GTATAGCATACATTATACGAAGTTATGCATGCACGCGTCGGAATTCTAGGGATAACAGGGTAATCCATGG
[0051] 以质粒 pSET4s(Daisuke Takamatsu ,Makoto Osaki , and Tsutomu Sekizaki.Thermosensitive Suicide Vectors for Gene Replacement in Streptococcus suis .Plasmid,200,146,140-148，中国人民解放军军事医学科学院生物工 程研究所已保存)为模板，以引物spcF和spcR扩增出两端均为Hindlll切点的spc抗性元件。 该片段用Hindlll单切后纯化回收，再与同样经Hindlll单切的质粒pUC-Scel连接转化 E.coli DH5,并在含壮观霉素的LB平板上进行筛选，得到的阳性克隆即为连接正确的克隆， 将鉴定表明正确的重组质粒命名为pSpc-Scel。其中，引物spcF和spcR的序列为：
[0052] spcF:CCCAAGCTTGTTCGTGAATACATGTTATA
[0053] spcR:CCCAAGCTTGTTTTCTAAAATCTGAT
[0054] 质粒pSpc-Scel用BamHI和EcoRI双酶切，切胶回收1500bp左右的片段。质粒pMAD (Arnaud M,Chastanet A,and De7 barbouille M.New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable,low-GC-content, gram-positive bacteria.Appl Environ Microb,2004,70( 11):6887~6891，中国人民解放军军事医学科 学院生物工程研究所已保存）同样用BamHI和Ncol双酶切，纯化回收。上述两个片段经T4连 接酶连接后转化接转化E. coli DH5，并在含壮观霉素的LB平板上进行筛选连接正确的克 隆，最后将鉴定表明正确的重组质粒命名为pMAD-Spc-Scel。
[0055] pMAD-Spc-Scel为将序列表中序列3所不的DNA分子插入质粒pMAD的BamHI和EcoRI 酶切位点间得到的载体。
[0056] 序列表中序列3所示的DNA分子包括Spc基因（序列3第62-1191位)和1-3〇〇1识别位 点（序列3第1252-1269位）。
[0057] 2、打靶质粒构建
[0058] 根据GenBank登录的Bacillus anthracis sterne株mntA序列及其上下游序列，其 中序列号为BAS2964，设计两对特异性引物mn t AuF&mn t AuR和mn t AdF&mn t AdR。
[0063] 以Bacillus anthracis A16R株(董梅，庄汉澜，王希良，炭疽芽孢杆菌A16R株无菌 培养滤液的蛋白质组学分析，军事医学科学院院刊2009年2月第33卷第1期，6-9页。中国人 民解放军军事医学科学院生物工程研究所已保存)基因组DNA为模板，用mntAuF/mntAuR和 mntAdF/mntAdR分别扩增，得到约95Obp mntA基因上游同源臂(序列1第1 -958位核苷酸）和 约980bp mntA基因下游同源臂(序列1第1895-2875位核苷酸）。
[0064] 用BamHI和Sail双酶切mntA基因上游同源臂和pMAD-Spc-Scel质粒，然后在22°C条 件下连接后再转化DH5a，取连接正确的中间质粒进行测序;再用Mlul和Ecorl双酶切测序正 确的中间质粒和mntA基因下游同源臂后，在22°C条件下连接后再转化DH5a，取连接正确的 重组质粒进行测序。得到的重组质粒再电转化E.coli SCS110。从SCS110中提取质粒得到去 甲基化的打靶用质粒，命名为pMAD-mnt A。
[0065] 重组质粒pMAD-mntA为将序列1第1-958位所示的mntA基因上游同源臂插入pMAD-Spc-Scel载体的BamHI和Sail酶切位点间，且将序列1第1895-2875位所示的mntA基因下游 同源臂插入pMAD-Spc-Scel载体的Mlul和Ecorl的酶切位点间得到的载体。
[0066] 其中，序列1所示的DNA分子由mntA基因上游同源臂（序列1第1-958位）、mntA基因 (序列1第959-1894位)和mntA基因下游同源臂(序列1第1895-2875位)组成。
[0067] 2、mntA基因的无痕敲除
[0068] mntA基因敲除的大致过程如图1所示。
[0069] 从-70°C保存的B.anthracisAP429菌种中划线分离单菌落，接种于5mL BHIG(HBI 培养基加〇. 5%甘油)培养基中，37°C过夜培养。将过夜培养物按1 %的比例接种到100mL新 的BHIG培养基（Bacto? Brain Heart Infusion，BHI，BD公司，货号237500,使用时添加 0.5 %甘油）中，37 °C剧烈振荡培养。当0D600值达到0.5-0.6时(约2小时），从摇床中取出，离 心收集菌体，用10%甘油洗三次，最后用1/10体积10%甘油重悬菌体，分装得到电转化感受 ??τ 〇
[0070] 每40yL感受态细胞加5yL(约 1 · 5yg)质粒pSS4332 (Plaut RD and St ibi tz S. Improvements to a Markerless Allelic Exchange System for Bacillus.PLoS ONE 10(12) :e0142758.中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所已保存），混合后于 0.1cm电击杯中冰浴5分钟，然后用Bio-Rad电转仪进行电转化，条件为：1.8kV、200Q和25μ F。电击完毕后立即加入lmL冰冷的LB培养基，30度孵育2.5小时。分别取200和800yL涂布于 含卡那霉素（50yg/mL)的LB平板上，37°C过夜培养。得到转化子AP429/pSS4332。由于质粒 PSS4332能够表达归巢内切酶I-scel，所以菌株AP429/pSS4332能够将转化入细胞内的的带 I-scel酶切位点的质粒进行切割，从而在一定程度上促进相关的打靶质粒与基因组的同源 重组。质粒PSS4332在传代过程中如果不加卡那霉素，极易丢失。
[0071] 取转化子AP429/PSS4332接种于5mL BHIG含卡那霉素 (50yg/mL)培养基，37°C过夜 培养。然后按上述方法制备感受态。
[0072] 质粒pMAD-mntA按上述方法电转化入AP429/pSS4332中，最后取200yL涂布于含壮 观霉素（300yg/mL)和卡那霉素（50yg/mL)的LB平板上，30°C过夜培养，得到转化子。挑取转 化子一个菌落，接种到5mL含卡那霉素(50yg/mL)LB培养基中，42°C培养，然后每12小时按1: 100的比例转接一次，连续传代4-5次后，取5yL培养物梯度稀释，取10- 2和ΚΓ3稀释液各100μ L涂布于含壮观霉素(300yg/mL)的LB平板上，42 °C过夜培养。
[0073] 选50-100个菌落，每个菌落均一一对应点种到含壮观霉素(300yg/mL)和红霉素(5 yg/mL)的LB平板上，42 °C过夜培养。选只在壮观霉素平板上生长的菌落为Bacillus anthracis AP429AmntA: :spc(壮观霉素抗性基因替代了mntA基因）。
[0074] 用PCR的方法鉴定Bacillus anthracis AP429 AmntA: :spc，上下游引物分别为 MntAiF和MntAiR。对PCR产物连接到T载体后进行测序鉴定。
[0075] MntAiF:TATGGGGAAGTACGACAAGTG
[0076] MntAiR:GATAACCACCATCTAATAAAACCAT
[0077] 上步鉴定发生重组的菌Bacillus anthracis AP429 Δ mntA: : spc在无抗生素存在 的条件下传5代，通过抗生素抗性分析证明不再有红霉素抗性和卡那霉素抗性后，按照前述 方法制备感受态，转入质粒pHY-Cre(王艳春.炭疽杆菌芽胞疫苗载体的探索性研究.[博士 学位论文].北京:军事医学科学院，2009，表达Cre重组酶，通过Cre重组酶识别spc元件两端 的LoxP位点，去除抗性标记），方法同样采用电转化，条件同前述。电击完毕后立即加入lmL 冰冷的BHIG培养基，30度孵育2.5小时.取50yL涂布于含红霉素（5yg/mL)的LB平板上，30°C 过夜培养。
[0078]得到的重组菌在含红霉素(5yg/mL)的LB液体培养基中30°C传两代后，再在无抗生 素存在的条件下37°C传三代，再用PCR的方法鉴定抗性基因去除情况，结果。最终通过一系 列实验，得到不含质粒的mntA基因敲除的菌株，命名为Bacillus anthracis AP429 AmntA。
[0079] Bacillus anthracis AP429 AmntA进行PCR鉴定（引物为MntAiF和MntAiR)，结果 如图2所示，泳道M为分子量Marker，泳道1为Bacillus anthracisAP429扩增结果，泳道2为 Bacillus anthracis AP429AmntA::spc扩增结果，泳道3为Bacillus anthracis ΑΡ429Δ mntA扩增结果;从PCR结果看，重组菌株Bacillus anthracis AP429 Δ mntA的mntA基因敲除 成功。
[0080] 重组菌Bacillus anthracis ΑΡ429ΔmntA为将Bacillus anthracis AP429基因 组中的mntA基因敲除得到的菌。
[0081] 二、nos基因的敲除 [0082]与mntA基因敲除方法相同。
[0083] 1、打靶质粒构建
[0084] 根据GenBank登录的Baci 1 lus anthracissterne株nos基因的序列，序列号为 BAS5299，设计两对特异性引物 nosuF&nosuR 和 nosdF&nosdR。
[0091 ] 以Bacillus anthracis A16R株(董梅，庄汉澜，王希良，炭疽芽孢杆菌A16R株无菌 培养滤液的蛋白质组学分析，军事医学科学院院刊2009年2月第33卷第1期，6-9页。中国人 民解放军军事医学科学院生物工程研究所已保存）基因组DNA为模板，用nosuF/nosuR和 nosdF/nosdR分别扩增，得到约800bp nos基因上游同源臂（序列2第1-805位核苷酸）和约 800bp nosA基因下游同源臂(序列2第1872-2679位核苷酸）。
[0092] 用BamHI和Sail双酶切上游同源臂和质粒pMAD-Spc-Scel质粒，然后在22°C条件下 连接后再转化DH5a，取连接正确的中间质粒进行测序;再用Mlul和Ecorl双酶切测序正确的 中间质粒和下游同源臂后，在22°C条件下连接后再转化DH5a，取连接正确的重组质粒进行 测序。得到的重组质粒再电转化E.coli SCS110。从SCS110中提取质粒得到去甲基化的打靶 用质粒，命名为pMAD-nos。
[0093] 重组质粒pMAD-nos为将序列2第1-805位所示的nos基因上游同源臂片段插入质粒 pMAD-Spc-Scel的BamHI和Sail酶切位点，且将序列2第1872-2680位nos基因下游同源臂片 段插入质粒pMAD-Spc-Scel的Mlul和Ecorl的酶切位点间得到的载体。
[0094] 序列2所示的DNA分子由nos基因上游同源臂片段(序列2第1-805位）、nos基因（序 列2第801-1871位)和nos基因下游同源臂片段(序列2第1872-2679位)组成。
[0095] 2、nos基因的无痕敲除
[0096] nos基因敲除的过程与上述mntA基因敲除的过程基本相同，不同的是出发菌株是 Bacillus anthracisAP429 AmntA，具体如下：
[0097] 将质粒pSS4332转入出发菌株Bacillus anthracisAP429 Δ mntA中，得到转化子 AP429AmntA/pSS4332。
[0098] 将质粒pMAD-nos转入AP429AmntA/pSS4332中，选只在壮观霉素平板上生长的菌 落为AP429 Δ mntA/nos: : spc。
[00"] 重组的菌AP429 Δ mntA/nos : : spc在无抗生素存在的条件下传5代，通过抗生素抗 性分析证明不再有红霉素抗性后，按照前述方法制备感受态，转入质粒pHY-Cre。电击完毕 后立即加入lmL冰冷的BHIG培养基，30度孵育2.5小时.取50yL涂布于含红霉素（5yg/mL)的 LB平板上，30 °C过夜培养。得到的重组菌在含红霉素（5yg/mL)的LB液体培养基中30 °C传两 代后，再在无抗生素存在的条件下37°C传三代，再用PCR的方法鉴定抗性基因去除情况，结 果。最终通过一系列实验，得到不含质粒的mntA基因敲除的菌株，命名为Bacillus anthracis AP429ΔmntAΔnos〇
[0100] Bacillus anthracis AP429 Δ mntA Δ nos进行PCR鉴定（引物为nosiF和nosiR)，结 果如图3所示，泳道M为分子量Marker，泳道1为Bacillus anthracis AP429 Δ mntA扩增结 果，泳道2为Bacillus anthracis AP429 Δ mntA Δ nos扩增结果;从PCR结果看，重组菌株nos 基因敲除成功。
[0101] 重组菌Bacillus anthracis AP429 Δ mntA Δ nos为将Bacillus anthracis AP429 基因组中的mntA基因和nos基因敲除得到的菌，为mntA和nos两个基因都缺失的突变株，再 次命名为Bacillus antrhacis AP431。
[0102] 将炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431于2016年3月30日保藏于中国微生 物菌种保藏管委理员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路）， 保藏号为CGMCC N0.12321，分类命名为炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)。
[0103] 实施例2、重组菌炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431生物特性分析
[0104] 1、AP431菌株PA蛋白表达情况的免疫印迹分析
[0105]挑取实施例1获得的AP431和A16R新鲜菌落，分别接种到5mL的BHIG液体培养基中， 37°C摇菌。培养12h后，以1%。比例转接到200mL的LB液体培养基中，摇床225rpm，过夜培养。 将新鲜菌液离心，收集培养上清，4°C保存。然后将菌体用PBS洗涤3次后相同体积重悬，冰浴 超声破碎。设定超声破碎仪参数，超声强度为35 %，超声30min，每超声5sec暂停5sec，重复 进行。超声结束后，4°C下离心10min，分离上清和沉淀，则细胞内容物主要在超声裂解物上 清中，S层蛋白主要在超声裂解物沉淀中。分别将培养上清、超声裂解物上清和超声裂解物 沉淀按照实验手册制样，用12 %凝胶进行SDS-PAGE电泳，然后转移到NC膜上。NC膜用5 %脱 脂奶粉室温封闭2小时；与羊抗PA多抗(SC-17424，购自SANTA CRUZ公司，1:200稀释)37 °C共 孵育2小时；然后膜用PBST洗涤3次，每次5分钟，再与相应的HRP标记的兔抗羊IgG抗体（1: 5000稀释)共孵育1小时，最后将膜用PBST洗干净，利用凝胶成像系统ECL发光显影。化学发 光底物试剂盒中的A液和B液，以1:1比例充分混合配制，并均匀地加在NC膜上，放入化学发 光成像仪中，发生反应并拍照记录。
[0106]结果如图4所示。图中泳道Μ为蛋白分子量Marker，泳道1，2.培养基上清;泳道3,4. 超声裂解物上清；泳道5，6 .超声裂解物沉淀；其中泳道1，3，5对应A16R;泳道2，4，6对应 AP431。从结果可以看出，在培养基上清、胞内和细胞S层三个位置中，AP431的PA蛋白均有良 好表达，而A16R的PA蛋白仅在其培养基上清中少量表达，胞质和细胞外壁中没有表达。这可 以说明，在相同培养条件下，PA蛋白在突变株AP431中高效表达，与A16R相比有明显的优势。 [0107] 2、芽胞形成能力分析
[0108] 菌株炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431接种于LB培养基中，37度培养5天 后取样涂片进行芽胞染色，观察芽胞形成情况。
[0109] 结果如图5所示，炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431仍具有很好的芽胞形 成能力。
[0110] 3、抗氧化能力分析
[0111] 菌株炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431接种于BHIG培养基中，37度培养6 小时到对数生长期，加入不同浓度的H2〇 2(2.5、5、10、25和50mM)，37度振荡孵育30分钟，稀释 涂平板计数。与此同时，以A16R作为对照。
[0112] 结果如图6所示，随着过氧化氢的浓度增大，两组细菌的存活率分别下降。在过氧 化氢浓度为5〇1]11]1〇1/1时，经过3〇11^11作用后两组细菌被完全杀灭。在过氧化氢浓度为5、10和 25mmol/L时，AP431组的存活率均低于A16R组。方差分析结果表明，AP431比A16R对于过氧化 氢更敏感(P〈〇.〇5)。
[0113] 4、毒力评价
[0114] 不同剂量的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431芽胞以肌肉注射或腹腔注 射的方式接种C57小鼠（军事医学科学院实验动物中心），每天观察并记录死亡情况，剂量依 次为2*10 8CFU/只与2*107CFU/只。以现有疫苗株炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)A16R 作为对照。实验结束后用Graphpad 5.0软件统计分析相应数据。
[0115] 结果如图7所示，炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431安全性优于现有疫苗 株A16R〇
[0116] 实施例3、减毒炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431的免疫效果验证
[0117] 将35只BALB/c小鼠随机分成5组，每组7只。分别设置为阴性对照组、炭疽芽胞杆菌 (Bacillus anthracis)AP431高剂量免疫组和低剂量免疫组、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)A16R高剂量免疫组和低剂量免疫组。AP431高剂量免疫组接种剂量为2X 108CFU/只；AP431低剂量免疫组接种剂量为2 X 107CFU/只；A16R高剂量免疫组接种剂量为2 X 107CFU/只;A16R低剂量免疫组接种剂量为2 X 106CFU/只；阴性对照组不作处理。接种方式 为皮下注射，每2周加强免疫1次，共免疫3次，每次免疫剂量和免疫途径不变。
[0118] 免疫程序结束后第10d，采集BALB/c小鼠血液样本，采用眼球摘除法。将采集的血 液放入37 °C静置lh，然后放入4°C冰箱过夜，使血清充分析出。2000g冷冻离心10min，吸收上 清，血清稀释100倍后测定抗PA抗体。
[0119] 测定方法如下：
[0120] (1)抗原PA的包被。用包被液与PA蛋白（购自默克密理博公司，货号176905)稀释为 lyg/mL。将抗原稀释液加入96孔酶标板，每孔100yL。设定A1、A2孔为空白对照（即不加包被 抗原，仅加包被液l〇〇yL)，设定阴性对照。将96孔酶标板置于干净的湿盒中，保持反应环境 湿润，4°C下过夜静置反应。
[0121 ] (2)洗涤。弃去包被液，向96孔酶标板中加入洗涤液PBST，每孔100yL，放入微孔板 振荡器洗涤5min，甩干。重复洗涤3次。
[0122] (3)封闭。每孔加入200yL的5 %的脱脂奶粉PBST溶液200yL，37 °C孵育1 -2h。
[0123] (4)加入一抗。弃去封闭液，用洗涤液PBST洗涤反应孔3次，洗涤方法同步骤(2)。将 待测血清用保温液（1%的脱脂奶粉PBST溶液)稀释100倍，加入反应孔，每孔100yL。将酶标 板放回湿盒中，37°C下静置结合2h。
[0124] (5)洗涤。洗涤方法同步骤(2 )，重复洗涤3次。
[0125] (6)加入二抗。用10mL保温液将HRP标记的山羊抗鼠二抗（（购自SIGMA-ALDRICH公 司，货号91618)稀释5000倍，取100yL加到各反应孔。
[0126] (7)洗涤。洗涤方法同步骤(2 )，重复3次。
[0127] (8)显色。酶标板甩干后加入显色底物TMB溶液(购自天根生化科技有限公司，货号 PA107-01)，每孔100yL，室温下静置，避光显色lOmin。
[0128] (9)终止反应。待显色完全后，每孔加入反应终止液50yL，反应立即终止。
[0129] (10)测定0D值。用多功能酶标仪于450nm波长检测每个反应孔的光密度值，记录检 测结果。
[0130]结果如图8,该试验同时进行了 AP431芽胞免疫和A16R芽胞免疫，均采用了皮下注 射的免疫接种方式。并且，每种芽胞疫苗均设置了两个免疫剂量，由于在安全性评价中发 现，AP431的安全性显著高于A16R，将AP431芽胞免疫剂量分别比A16R芽胞免疫剂量提高一 个数量级。其中，AP431高剂量免疫组抗体水平和A16R高剂量免疫组相当，小鼠的血清抗体 D45〇平均值都超过了 0.6; AP431低剂量免疫组抗体水平比A16R低剂量免疫组水平略高。上述 结果表明，菌株AP31都能够激发小鼠显著的免疫应答。
[0131] 实施例4、减毒炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431的保护效果验证
[0132] 将24只小鼠随机分成5组，每组6只。分别设置为阴性对照组、AP431高剂量免疫组、 AP431中剂量免疫组和AP431低剂量免疫组。
[0133] AP431高剂量免疫组:减毒炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431接种剂量为 5X108cfu/只，
[0134] AP431中剂量免疫组:减毒炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431接种剂量为 lX108cfu/只，
[0135] AP431低剂量免疫组:减毒炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)AP431接种剂量为 5X107cfu/只，
[0136] 阴性对照组不作处理。
[0137] 接种方式为肌肉注射，每2周加强免疫1次，共加强免疫2次，每次免疫剂量和免疫 途径不变。
[0138] 免疫结束后10天，用炭疽芽胞杆菌Sterne株（Sterne，Max · Variation in Bacillus anthracis.Onderstepoort Journal of Veterinary Science and Animal Industry. 1937，8:271-348.中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所已保存)芽胞 腹腔注射攻毒，剂量为5 X106cfu/只，该剂量为绝对致死剂量。攻毒方式为腹腔注射。对各 组小鼠进行全天候观察，记录小鼠的存活情况，试验观察期为攻毒后的14天。
[0139] 结果如图9所示，其中，5X108cfu免疫剂量组小鼠的保护率为83%，阴性对照组的 小鼠在2d后就全部死亡。从结果可以看出，采用5 X108cfu的免疫剂量进行肌肉注射免疫， 可以达到较高的免疫保护率。
【主权项】
1. 重组菌，为降低和/或抑制炭疽芽胞杆菌AP429CGMCC NO. 4912中mntA蛋白和nos蛋白 活性得到的菌。2. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述降低和/或抑制炭疽芽胞杆菌 AP429CGMCCN0.4912中mntA蛋白和nos蛋白活性为沉默炭疽芽胞杆菌AP429CGMCCN0.4912中 mntA蛋白编码基因和nos蛋白编码基因的表达。3. 根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于：所述沉默炭疽芽胞杆菌 AP429CGMCCN0.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋白编码基因的表达为敲除炭疽芽胞杆菌 AP429CGMCCN0.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋白编码基因。4. 根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述敲除炭疽芽胞杆菌 AP429CGMCCN0.4912中mntA蛋白编码基因和nos蛋白编码基因均采用基因组定点编辑或同 源重组的方式进行。5. 根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于:所述同源重组为λ-red同源重组或sacB 基因介导筛选的同源重组或自杀质粒介导的同源重组。6. 根据权利要求1-5中任一所述的重组菌，其特征在于： 所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429CGMCCN0.4912中mntA蛋白编码基因采用的同源重组的 mntA蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列1第1-958位； 所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429CGMCCN0.4912中mntA蛋白编码基因采用的同源重组的 mntA蛋白编码基因的下游同源臂的核苷酸序列为序列1第1895-2875位； 所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429CGMCCN0.4912中nos蛋白编码基因采用的同源重组的nos 蛋白编码基因上游同源臂的核苷酸序列为序列2第1-805位； 所述敲除炭疽芽胞杆菌AP429CGMCCN0.4912中nos蛋白编码基因采用的同源重组的nos 蛋白编码基因下游同源臂的核苷酸序列为序列2第1872-2680位。7. 根据权利要求1-6中任一所述的重组菌，其特征在于： 所述重组菌保藏号为CGMCC NO. 12321。8. 权利要求1-7中任一所述的重组菌在制备如下1)或2)产品中的应用。 1) 、炭疽杆菌疫苗； 2) 、预防和/或治疗炭疽杆菌引发的疾病的产品。9. 一种如下1)或2)产品，其活性成分为A或B; A为权利要求1-6中任一所述的重组菌； B为表达mntA蛋白编码基因上游同源臂和mntA蛋白编码基因的下游同源臂的重组载体 和表达nos蛋白编码基因上游同源臂和nos蛋白编码基因的下游同源臂的重组载体； 1) 、炭疽杆菌疫苗； 2) 、预防和/或治疗炭疽杆菌引发的疾病的产品。
【文档编号】C12N15/75GK105969711SQ201610298152
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】王艳春, 刘纯杰, 袁盛凌, 陶好霞
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所