厦门霉素高产菌株及其培养基、用图
【专利摘要】本发明公开了一种生物技术领域的厦门霉素高产菌株及其培养基、用途；具体涉及厦门霉素生物合成的高产基因工程菌株(Streptomyces xiamenensis)318Pls1 CGMCC No.12366的构建及培养基优化；通过生物合成基因簇的位点特异性整合，在厦门链霉菌基因组的核心区导入额外的厦门霉素生物合成基因簇，强化了厦门霉素的生物合成能力。并通过优化的培养基组合，实现了厦门霉素产量的大幅提高。CGMCC NO.1236620160419CGMCC NO.4.353420070401
【专利说明】
厦门霉素高产菌株及其培养基、用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种厦门霉素高产菌株及其培养基、用途。
【背景技术】
[0002] Streptomyces xiamenensis的模式菌株CGMCC Νο·4·3534分离自中国福建省红树 林环境样本。该菌株产生的厦门霉素为具有氨基酸取代和异戊烯基化的苯并吡喃化合物， 具有抑制肺纤维化和瘢痕增生的生物活性，是新的抗纤维化药物候选物。在通常采用的GYM (Glucose Yeast-extract Maltose)培养基中，野生型厦门链霉菌中厦门霉素的产量仅为 15mg/L。为满足进一步的药理活性研究和药物开发的需求，厦门霉素的产量亟待提高。
[0003] 厦门霉素的生物合成途径已被完全解析，克隆到的生物合成基因簇包括ximA-E这 5个基因，分别负责催化由分支酸裂解形成4-羟基苯甲酸，经过异戊烯基转移、环化形成厦 门霉素 B，以及加载L-苏氨酸形成终产物厦门霉素的过程。厦门霉素生物合成途径相对简 单，合成所需的前体均来自于微生物普遍存在的主代谢途径(TCA、PPP、MEP等）。基于厦门霉 素生物合成途径对出发菌株进行定向分子育种，有望快速构建高产菌株。培养基成分和培 养条件是影响菌体生长和发酵产素效率的重要因素，对相关因素进行优化是提高化合物产 量的传统方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种厦门霉素生物合成基因簇加倍的厦门霉素高产菌株 及其培养基、用途。本发明在厦门链霉菌野生株基因组的核心区通过位点特异性整合导入 额外的厦门霉素生物合成基因簇，将厦门链霉菌中的生物合成基因簇进行加倍，获得了具 有高产性状的基因工程菌株厦门链霉菌（Streptomyces xiamenensis)318Plsl CGMCC No. 12366。通过培养条件优化、单因素添加和正交实验，确定了厦门霉素摇瓶发酵的优化培 养基。本发明提供的菌株和培养基配方具有厦门霉素产量大幅提高的有益效果。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0006] 第一方面，本发明涉及一种厦门链霉菌的基因工程菌株，所述基因工程菌株为厦 门链霉菌（Streptomyces xiamenensis)318Plsl CGMCC No. 12366。
[0007] 优选的，所述基因工程菌株是通过位点特异性整合将厦门霉素生物合成基因簇在 野生型厦门链霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No · 4· 3534中进行加倍而获得的。
[0008] 优选地，所述厦门霉素生物合成基因簇位于整合型质粒PLM009404上，将该质粒通 过大肠杆菌-链霉菌之间的接合转移，可实现厦门霉素生物合成基因簇在野生型厦门链霉 菌中的加倍，获得高产厦门霉素的基因工程菌株（Streptomyces xiamenensis)318P1 si CGMCC No.12366。
[0009] 更优选的，人工导入的厦门霉素生物合成基因簇位于基因组的核心区，并同时保 留了基因组臂区的原始生物合成基因簇。
[0010] 第二方面，本发明涉及前述的厦门链霉菌的基因工程菌株的培养基，每升培养基 中含有葡萄糖20g、KN〇3lg、酵母浸膏10g、麦芽浸膏15g。
[0011]第三方面，本发明涉及一种前述的厦门链霉菌的基因工程菌株在生产厦门霉素中 的用途。
[0012]优选的，所述基因工程菌株选用上述的培养基，经发酵培养获得厦门霉素。
[0013] 优选的，所述基因工程菌株采用摇瓶培养生产厦门霉素;所述摇瓶培养生产条件 为：
[0014] 种子活化:在固体培养基SFM(豆饼粉20g/L，甘露醇20g/L，琼脂20g/L)平板上挑取 产孢良好的单菌落，接种于500mL三角瓶内100mL种子活化培养基TSB(Tryptone Soya Broth 30. lg/L)中，3(TC，220r/min，培养48h;
[0015] 发酵培养:500ml三角瓶，装液量100mL，按5%接种量(V/V)接种于如权利要求4所 述的发酵培养基，30°C，220r/min旋转式摇床震荡培养7天。
[0016] 本发明中，所述产生菌-厦门链霉菌（Streptomyces xiamenensis)318Plsl已于 2016年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址 为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC No.12366。
[0017] 野生型厦门链霉菌（Streptomyces xiamenensis)已于2007年4月保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC No.4.3534。
[0018] 本发明具有的有益效果为:通过提供一种厦门霉素生物合成基因簇加倍的高产基 因工程菌株及其优选的培养基配方和摇瓶培养条件，厦门霉素的产量获得了大幅提高。
【附图说明】
[0019] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0020] 图1为厦门霉素生物合成基因簇加倍菌株318P1S1的PCR验证;其中，A为整合位点 attL的PCR鉴定，B为pLM009404上xim基因上游重组序列的PCR鉴定，C为pLM009404上xim基 因下游重组序列的PCR鉴定，M:lKb DNAmaker;l:318: :pSET152的PCR产物；2:318Plsl的PCR 产物;3:318WT阴性对照；
[0021] 图2为基因簇加倍菌株318P1S1培养基优化正交实验中厦门霉素产量；
[0022]图3为厦门霉素 HPLC检测标准曲线；
[0023]图4为基因簇加倍菌株318P1 s 1的厦门霉素产量(图4A)和HPLC谱图（图4B)。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域 的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于 本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照 制造厂商所建议的条件。
[0025] 实施例1、厦门霉素生物合成基因簇加倍菌株的构建和验证
[0026] 步骤一、大肠杆菌与链霉菌的接合转移
[0027] 将E.coli ET12567(pUZ8002)单菌落在 10mL LB(加 Chl，Kana)培养基中37°C振 荡培养过夜；
[0028] 取100yL过夜培养物接种至10mL新鲜的LB(加 Chl，Kana)培养基，37°C培养4~ 6h，至 0D600 = 0.4;
[0029] 用10mL新鲜LB培养基洗涤上述菌体2次以除去抗生素，将剩余的菌体悬浮于lmL LB培养基中；
[0030] 同时，取lmL(10-8)链霉菌孢子（No.4.3534)至5mLTES缓冲液中，50°C热激 10min，冷却；加入5mL 2XYT broth，37°C，200rpm培养2h;
[0031] 将lmL E.coli ET12567(pUZ8002)细胞和萌发后的链霉菌孢子混合，简单离心， 弃去大部分上清，将剩余约50yL液体悬浮沉淀；
[0032] 依次稀释至ΠΓ1~10_3倍，每个稀释度取100yL涂布于SFM固体培养基，30°C培养 16~20h;
[0033] 用lmL含有25mg/mL萘啶酮酸和30mg/mL阿泊拉抗生素的无菌水覆盖平板，30°C 继续培养至出现单菌落；
[0034] 将平板上长出的单菌落每板挑取10个划线于SFM(Apr)平板上转接两次培养，进 行PCR验证，选出转化成功的重组子。
[0035] 步骤二、对阿泊拉霉素抗性的整合子纯化后进行PCR验证
[0036] 首先用引物Pls-attF/R扩增整合位点attL的序列，PCR扩增产物大小与目标条 带1Kb相符，证实PSET152质粒成功整合进318染色体中（图1-A)。其次，分别用引物Pls-M13A-F/R和PI s-Ml 3E-F/R，扩增重组质粒pLM009404中xim基因簇前后端的重组序列，PCR扩 增产物大小与预期的目标条带2.2Kb和2.3Kb相符，证实质粒携带的第二个xim基因簇成功 整合进318染色体中（图1-B，1-C)。
[0037] PCR反应体系： 薇 DMA ( 100ng/'uL.) 0·5() μL」 2x PCR Mix (生工生物） 12.5pL
[0038] 正向及反向引物 0,50 μL DMSO 0.75 μL d.d.H20 up to 25 [iL
[0039] PCR反应程序：
[0041 ] 用于检测接合转移突变株ET12567/pSET152中导入的整合型质粒pSET152上 Apramycin抗性基因的引物：
[0044]用于检测厦门霉素基因簇(xim)加倍菌株318Plsl及整合空载质粒的菌株318:: PSET152上游重组位点attL的引物：
[0047]用于检测厦门霉素基因簇(xim)加倍菌株318Plsl基因组上整合质粒pLM009404携 带xim基因簇的引物：
[0052] 步骤三、电泳检测PCR产物：120V，电泳30min后，用新鲜Gel Red染液染色40min， 紫外检测目标条带，图1。
[0053] 步骤四、对目标条带进行胶回收，连接至PMD-18T载体中，送公司测序，序列比对 后筛选出构建成功的重组菌株。
[0054] 本发明将厦门霉素基因簇加倍构建过表达菌株（Streptomyces xiamenensis) 318?181061〇：如.12366的目的是提高厦门霉素产量，以得到高产的厦门霉素突变株。此 外，由于厦门霉素基因簇位于318染色体左臂区的一个基因岛上，存在遗传不稳定性，其基 因组核心区序列中带有0C31噬菌体特异性整合位点attB，通过特异性位点整合将另一个 厦门霉素基因簇引入到核心区，增加了基因簇拷贝数的同时也增加了遗传稳定性，有利于 在此菌株的基础上后续基因工程菌株(加强启动子、删除负调控等)的构建。
[0055] 实施例2、厦门链霉菌发酵条件优化
[0056] 步骤一，设计单因素实验，分别就发酵过程中，摇瓶内是否加弹簧、消泡剂，培养 温度：30°C、37 °C，摇床转速：180r/min、220r/min、300r/min，种子活化时间：24h、36h、48h， 接种量2%、5%、10%，进行了单因素实验；
[0057] 步骤二，观察发酵7天内，菌株生长情况、菌丝体断裂情况、摇瓶状态，并记录；
[0058] 步骤三，发酵7天后，收菌，提取厦门霉素并进行HPLC检测，三个平行实验组，取 平均值；
[0059] 步骤四，综合菌体生长及产素结果，总结最适培养条件为：
[0060] _a.种子活化:500mL三角瓶，装液量100mL，挑取产孢良好的单菌落，接种于种子 活化培养基TSB(Tryptone Soya Broth 30.1 g/L，pH 7.2)中，30°C，220r/min，培养48h; [00611 _b.发酵培养:500mL三角瓶，装液量100mL，以5%接种量(V/V)接种于GYM发酵培 养基（葡萄糖4g/L，酵母浸膏4g/L，麦芽浸膏10g/L，pH 7.2)，30 °C，220r/min旋转式摇床震 荡培养7天，摇瓶中需加弹簧，不加消泡剂。
[0062]实施例3、厦门霉素生物合成培养基优化
[0063] 步骤一，使用L9(34)表进行4因素 3水平的正交实验设计（表1)，通过调整GYM培 养基中4种原料的配比，得到9种培养基的配方(表2);
[0064] 步骤二，采用上述优化后的培养方法对318Plsl菌株进行了发酵培养基的优化 筛选，以厦门霉素终产量为研究指标。每个实验组重复三次；
[0065] 步骤三，对抽提后的发酵产物进行高效液相色谱分析，结合极差和方差分析法 评价发酵条件优化组合和显著性水平(图2);
[0066] 步骤四，优选出厦门霉素高产培养基GYM-9(葡萄糖20g/L，酵母浸膏10g/L，麦芽 浸膏15g/L，KN03lg/L，pH 7.2)，其厦门霉素产量可达76mg/L。比较318野生株、空载菌株和 加倍菌株318Plsl在GYM培养基和优选出的GYM-9中的产量，3菌株在GYM-9中产量均提高2倍 多（图4)。此外，基因簇加倍菌株318P1 s 1无论在GYM培养基还是在优选出的GYM-9培养基中， 厦门霉素产量都相较野生株增加2.5倍左右。
[0069] 实施例4、厦门霉素产量的HPLC定量分析方法
[0070] 步骤一，厦门霉素浓度标准曲线的绘制：将厦门霉素标准品稀释成7个浓度梯 度，进行HPLC进样检测，各浓度对应峰面积数据如下：
[0072] 得出标准曲线（图3)公式:y=14831812.72x-39728.96，R2 = l，y峰面积，x 厦门 霉素浓度；
[0073] 步骤二，厦门霉素产物提取方法:将100mL发酵液用等体积乙酸乙酯浸泡过夜， 重复萃取3次，上层有机相合并蒸干，浸膏溶于6mL甲醇；
[0074] 步骤三，HPLC检测方法:将上述甲醇溶解浸膏稀释3倍后，按照进样量10yL进行 高效液相色谱(HPLC)分析，检测条件为:C18反相柱(Agilent Extend-C18,4.6 X 150mm，5y m);流动相为分别加入0.5%三氟乙酸的甲醇和水(20%-80%梯度洗脱）；流速lmL/min;柱 温为40°C ;紫外检测波长254nm;
[0075] 步骤四，厦门霉素产量分析方法:采用标准厦门霉素浓度曲线公式，将检测出的 峰面积，换算成相应厦门霉素浓度，乘以稀释倍数，计算出厦门霉素产量。
[0076] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上 述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不 影响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种厦门链霉菌的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为厦门链霉菌 (Streptomyces xiamenensis)318Plsl CGMCC No.12366。2. 如权利要求1所述的厦门链霉菌的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是 通过位点特异性整合将厦门霉素生物合成基因簇在野生型厦门链霉菌（Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.4.3534中进行加倍而获得的。3. 如权利要求2所述的厦门链霉菌的基因工程菌株，其特征在于，人工导入的厦门霉素 生物合成基因簇位于基因组的核心区，并同时保留了基因组臂区的原始生物合成基因簇。4. 一种如权利要求1所述的厦门链霉菌的基因工程菌株的培养基，其特征在于，每升培 养基中含有葡萄糖20g、KN〇3 lg、酵母浸膏10g、麦芽浸膏15g。5. -种如权利要求1所述的厦门链霉菌的基因工程菌株在生产厦门霉素中的用途。6. 如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述基因工程菌株选用如权利要求4所述的 培养基，经发酵培养获得厦门霉素。7. 如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述基因工程菌株采用摇瓶培养生产厦门霉 素;所述摇瓶培养生产条件为： 种子活化：在固体培养基SFM平板上挑取产孢良好的单菌落，接种于500mL三角瓶内 100mL种子活化培养基TSB中，30°C，220r/min，培养48h; 发酵培养:500mL三角瓶，装液量100mL，按体积比5 %的接种量接种于如权利要求4所述 的发酵培养基，30°C，220r/min旋转式摇床震荡培养7天。
【文档编号】C12N1/21GK105969714SQ201610362606
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】徐俊, 胡晓艳, 徐岷涓, 步绪亮, 余河霖
【申请人】上海交通大学