一种胎盘多能干细胞提取制备方法
【专利摘要】本发明公开一种胎盘多能干细胞提取方法，包括以下步骤：无菌条件下获取胎盘组织，经PBS反复冲洗、碘伏消毒、生理盐水充分冲洗胎盘，至少三次；将胎盘组织剪成1×1×1mm3碎片，置于无菌离心管中，利用0.25％胰蛋白酶和0.2％Ⅳ型胶原酶消化胎盘组织碎片，离心收集得细胞沉淀，将细胞沉淀重悬于含体积分数为10％的胎牛血清α?MEM培养基，常规方法冻存；流式细胞学分析：CD73、CD90和CD105细胞表达。本发明在无菌条件下获取胎盘，接着对胎盘进行PBS反复冲洗、胎盘表面消毒、生理盐水冲洗胎盘一系列预处理，保证获取的胎盘新鲜，便于保证胎盘组织中多能干细胞的活性。
【专利说明】
一种胎盘多能干细胞提取制备方法
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，涉及一种胎盘多能干细胞提取制备方法。
【背景技术】
[0002]干细胞可自我更新，并且能够分化为各种细胞系。这些细胞可分为胚胎干细胞(ESC)和非胚胎干细胞或成体干细胞(ASC)。后者不能再分化为各种组织(多能的)，并且其增殖速度低于胚胎干细胞。因此，胚胎干细胞的应用性优于成体干细胞的应用性。对动物和人类的初步研究表明，可以通过移植在体外培养的干细胞，可缓解某些疾病的症状，例如糖尿病、帕金森氏病、肝功能衰竭和充血性心力衰竭。然而，由于诸多原因，例如伴随人类胚胎干细胞的使用而产生的伦理问题，以及我们对该领域的极为有限的知识，该领域进展缓慢。由于上述缺点，人们已经开始使用来自人类骨髓的成体干细胞治疗某些癌症，例如血癌(白血病)。然而，因为需要侵入式的外科手术、大量专家和专业中心，这一疗法并不能被系统地应用，并且仍然取决于临床医生的意愿。一些研究者正开发细胞疗法，该疗法基于分离自脐带的干细胞。然而，从脐带中所能提取的干细胞数量相当少，这使得这一过程漫长而昂贵。此外，分离自脐带的干细胞并不能与每一位受体免疫系统相容，这会引起免疫反应，导致移植排斥。
[0003]胎盘中含有多种干细胞，包括间充质干细胞、造血干细胞、内皮干细胞和未知功能的多潜能干细胞等。
[0004]间充质干细胞，英文名称为mesenchymal stem cells(MSC)，也有其它名称，如骨髓基质细胞、脂肪干细胞、多潜能基质细胞等，是指单个或一群符合国际统一标准的细胞。间充质干细胞存在于多种组织和器官中，包括骨髓、脂肪、脐带、胎盘、肝脏、脑、骨质等，体内外均具有向骨、软骨和脂肪组织分化的能力，具有免疫调节、造血支持、促血管新生等作用。
[0005]造血干细胞是指尚未发育成熟的细胞，是所有造血细胞和免疫细胞的起源，它不仅可以分化为红细胞、白细胞、和血小板，还可以跨系统分化为各种组织器官的细胞，具有自我更新多向分化和归巢潜能。一般造血干细胞来源于三个渠道:骨髓造血干细胞;外周血造血干细胞;脐带血造血干细胞。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种胎盘多能干细胞提取制备方法。
[0007]本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
[0008]—种胎盘多能干细胞提取方法，包括以下步骤:
[0009](I)预处理:无菌条件下获取胎盘组织，经PBS反复冲洗，去除胎盘血，使用碘伏消毒脐带及胎盘表面;生理盐水充分冲洗残留脐带和胎盘，至少三次；
[0010](2)胎盘多能干细胞分离培养:将胎盘组织剪成I X I X Imm3碎片，将胎盘组织碎片置于无菌离心管中，利用0.25%胰蛋白酶和0.2%IV型胶原酶消化胎盘组织碎片，去除组织留取消化液，离心收集得细胞沉淀，将细胞沉淀重悬于含体积分数为10%的胎牛血清α-ΜΕΜ培养基，在37°C，体积分数为5 %的二氧化碳培养箱中培养，培养60h后半量换液，去除未贴壁细胞，每5天换液一次，常规方法冻存；
[0011](3)免疫表达:流式细胞学分析:⑶73、⑶90和⑶105细胞表达。
[0012]所述步骤(2)胎盘组织碎片在37°C温度下消化30min。
[0013]所述步骤(2)离心条件为:1500r/min，离心5min。
[0014]所述步骤(2)中0.25%胰蛋白酶和0.2%IV型胶原酶的体积比为1:1。
[0015]本发明的有益效果:本发明在无菌条件下获取胎盘，接着对胎盘进行PBS反复冲洗、胎盘表面消毒、生理盐水冲洗胎盘一系列预处理，保证获取的胎盘新鲜，便于保证胎盘组织中多能干细胞的活性，利用0.25%胰蛋白酶和0.1 %1型胶原酶消化胎盘组织碎片，多能干细胞的分离效率高。
【具体实施方式】
[0016]下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0017]实施例1
[0018]配制D-Hanks液:800ml新鲜制作的三蒸水中，依次加入氯化钠8.00g、氯化钾0.40g、磷酸氢二钠0.06g、磷酸二氢钾0.06g、碳酸氢钠0.35g，苯酸红0.02g，完全溶解后不足双蒸水至100ml，测定pH7.2-7.4，分装250ml玻璃瓶，高压灭菌20min，室温冷却，4°C保存，用时加热至37°C。
[0019]配制胰蛋白酶液:称取胰蛋白酶250mg，EDTA20mg ；取80mlD_Hanks液，将胰蛋白酶完全溶解，补加D-Hanks液至10ml，并加入EDTA溶液溶解，其终浓度为0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液，用0.Ium的虑器抽滤除菌置于4°C冰箱备用。
[°02°] 配制IV型胶原酶:取胶原酶IV型原液0.2ml，加入D-Hanks液至10ml，用0.1um的滤器抽滤除菌，置于4 °C冰箱备用。
[0021]—种胎盘多能干细胞提取方法，包括以下步骤:
[0022](I)预处理:无菌条件下获取胎盘组织，经PBS反复冲洗，去除胎盘血，使用碘伏消毒脐带及胎盘表面;生理盐水充分冲洗残留脐带和胎盘，至少三次；
[0023](2)胎盘多能干细胞分离培养:将胎盘组织剪成I X I X Imm3碎片，将胎盘组织碎片置于无菌离心管中，利用0.25%胰蛋白酶和0.2%IV型胶原酶消化胎盘组织碎片，0.25%胰蛋白酶和0.2%IV型胶原酶的体积比为1:1，37°C温度下消化30min，去除组织留取消化液，离心收集得细胞沉淀，离心条件为:1500r/min，离心5min，将细胞沉淀重悬于含体积分数为10%的胎牛血清α-ΜΕΜ培养基，在37 V，体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养，培养60h后半量换液，去除未贴壁细胞，每5天换液一次，常规方法冻存；
[0024](3)免疫表达:流式细胞学分析:⑶73、⑶90和⑶105细胞表达。
[0025]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0026]以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的【具体实施方式】。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
【主权项】
1.一种胎盘多能干细胞提取方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)预处理:无菌条件下获取胎盘组织，经PBS反复冲洗，去除胎盘血，使用碘伏消毒脐带及胎盘表面;生理盐水充分冲洗残留脐带和胎盘，至少三次； (2)胎盘多能干细胞分离培养:将胎盘组织剪成IX I X Imm3碎片，将胎盘组织碎片置于无菌离心管中，利用0.25%胰蛋白酶和0.2%IV型胶原酶消化胎盘组织碎片，去除组织留取消化液，离心收集得细胞沉淀，将细胞沉淀重悬于含体积分数为10 %的胎牛血清α-ΜΕΜ培养基，在37 0C，体积分数为5 %的二氧化碳培养箱中培养，培养60h后半量换液，去除未贴壁细胞，每5天换液一次，常规方法冻存； (3)免疫表达:流式细胞学分析:⑶73、⑶90和⑶105细胞表达。2.根据权利要求1所述的一种胎盘多能干细胞提取方法，其特征在于，所述步骤(2)胎盘组织碎片在37°C温度下消化30min。3.根据权利要求1所述的一种胎盘多能干细胞提取方法，其特征在于，所述步骤(2)离心条件为:1500r/min，离心5min。4.根据权利要求1所述的一种胎盘多能干细胞提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中.0.25%胰蛋白酶和0.2% IV型胶原酶的体积比为1:1。
【文档编号】C12N5/073GK105969722SQ201610570529
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月19日
【发明人】张正亮
【申请人】安徽惠恩生物科技股份有限公司